著者らは、組織学、細胞培養液の一部との親切な援助のために私たちの仲間のラムラボの同僚アマルChishtiとBijalパテルに感謝したいと思います。資金はスタートアップ資金と心臓血管研究所のシード・グラント（MTL）、ウェイン州立大学ナノメディシンフェローシップ（CBP）によって提供されました。

1.細胞培養の準備<ol><li>商業的に購入したヒト大動脈平滑筋細胞を利用します。 </li><li> 88.6％とからなる平滑筋細胞増殖培地中で細胞を維持する231培地、0.1％の組換えヒトインスリン（RH-インスリン）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子（RH-FGF）、組換えヒト上皮細胞増殖因子（RH-FGF）の各々アスコルビン酸; 5％ウシ胎児血清（FBS）およびL-グルタミンの各;そして、1％抗生物質/抗真菌剤。 注：各増殖因子、FBSおよびL-グルタミンは、血管メディア増殖キットとして購入されます。 </li><li>細胞が約90％コンフルエントと組織播種のための準備が整うまで、メディアごとに48時間を変更します。 </li><li>拡張のためのメディアの変化との間でインキュベーター中で細胞を保管してください。 </li></ol> 3Dプリント挿入とカスタムシリコーン成形プレートの調製<ol><li> 3Dは、プレートインサートを印刷するための市販の3Dプリンタ（ 例えば 、レプリケータミニ）を使用します。 <ol><li>オペアンプを使用してください印刷された外殻とポストの3Dモデルを作成するために、このようなブレンダーとしてソースの3D設計ソフトウェアアン。 </li><li> 3Dプリンタのソフトウェアへの移植を可能に.STLフォーマットを経由して、モデルのドライバファイルをエクスポートします。 </li><li> 3Dプリンターにロードされたポリ（乳酸）フィラメント（PLA）を使用して印刷柱と外殻を生成します。 </li><li>次の印刷、30分を行う各インサートを滅菌するために、70％-100％のエタノール溶液に浸します。 </li></ol></li><li>ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）のシリコーンポリマーのポリマー混合物をベースと室温で10分間脱気し、混合物を可能に1:10の硬化剤を準備します。 <ol><li> 、（35ミリメートル）小さい（60ミリメートル）、中間、および大規模（100ミリメートル）として使用シャーレのサイズを定義します。 </li><li> 2 mLを、4 mLおよびそれぞれ、小中間および大プレートに未硬化のシリコーンの6 mLを加え、シャーレの底面全体を横断薄層を作成します。 </li><li> PDMSを注ぐことにより、小さなプレートのための投稿を作成します。7mm高さの100mmプレートとは、約2~3時間、60℃のホットプレート上で硬化させます。次に、円筒状の支柱をパンチアウトするために5ミリメートル生検パンチを使用します。各PDMSシリンダーを確保し、各小板の中央にするために、未硬化PDMSの少量を使用してください。 </li><li>プレートの底にPDMSの硬化を完了する前に、中間および大規模なプレートについては、3Dはそれぞれ、各中間および大型プレートに集中直径ポスト10ミリメートルと20ミリメートルを印刷置きます。大規模なプレートの場合は、さらに3Dプリント外殻をポストから直径等距離では約66.7ミリメートルを置きます。 <ol><li>各皿は、ポリマーの脱ガスのための18時間を可能にする、約2〜3時間、60℃のホットプレート上で大気中で硬化させます。 図1に見られるように、適切な領域と向きでプレートに印刷されたコンポーネントを修正しました。 </li></ol></li><li>すべてのPLAの内部に30分間、30％の蒸留水で70％エタノール溶液を添加その後、滅菌のためのTESと各プレートをカバーしています。 </li><li>慎重に各プレートからのエタノールを吸引空気乾燥させ。 </li><li>その蓋、フェイスアップの隣に生物学的安全キャビネット（BSC）内の各プレートを配置します。滅菌を完了するために30分間BSCの下でUV光にプレートし、蓋を公開します。滅菌技術は、UV曝露後のすべての工程を用いて行われます。 </li></ol></li></ol>平滑筋細胞とプレートのメンテナンスで播種フィブリンハイドロゲルの調製、 <ol><li>それぞれ、小中間および大型プレートサイズの0.5 mLを、1.1 mLおよび1.81ミリリットルの量の成長培地+ 0.01％のTGF-β1を含むフィブリンゲル溶液を混ぜます。 <ol><li>それぞれ、100 U / mLのストックから、それぞれ、小中間および大型プレートのメディアに、40μL、88.4μLとトロンビンの145μLを追加します。ゆっくりとそのトロンビンが均等にメディア内で混合されていることを確認するために手で各プレートを旋回させます。 </li><li>次に、160を追加1; L、354μLおよび580μLのフィブリノゲンは、20 mg / mlでの在庫から、滴下円それぞれ、小中間および大プレートにトロンビンメディア混合物に、それぞれ。ゆっくりでも層に混入し、ヒドロゲルの分布を確認するために手で旋回。 </li><li>ヒドロゲルは、室温で10〜15分間硬化させます。 </li></ol></li><li>標準的なプロトコルに従って、平滑筋の150mm細胞培養プレート中で増殖する細胞と遠心分離をトリプシン処理。 231培地、1％FBSおよび1％抗生物質/抗真菌 - 得られたペレットを98％からなる分化培地3mLに再懸濁されるべきです。 <ol><li>積極的に任意の細胞塊を破壊するために2 mLのピペットで上下に滴定により細胞を混ぜます。血球計数器を用いて細胞をカウントし、/ mLで、小中間および大型プレート用、それぞれ2×10 6細胞/ mL、1.0×10 7細胞/ mLおよび1.4×10 7細胞の細胞懸濁液を作成します。 </li><li>各細胞懸濁液intの1 mLを加え50 mLコニカルに対応するOAは、小さな中間および大型の標識。希望するそれぞれの追加の組織のリングのために、このように、追加の50 mLコニカルを設定します。 </li><li>それぞれ、各小中間および大血管のための2 mLを、4 mLおよび5 mLの最終播種量を得るために、各円錐形に分化培地を追加します。その後、慎重に滴ずつそれぞれ対応するプレートで準備ヒドロゲルの上に細胞溶液をピペット。 </li><li> 37℃インキュベーターで5％CO 2に代えプレート。 </li></ol></li><li>分化培地を各プレート毎に48〜72時間を変更します。より大きな板の場合には、大細胞播種密度を補償することごとに48から24時間を変更した後、24時間後に最初にメディアを変更します。 <ol><li>リングが完全にポストに向かって収縮していますように2〜4日後に、それぞれ、各小中間および大きいリングに10μL、20μLおよびTGF-β1の35μLを追加します。 TGF-βへの曝露後; 1、少なくとも24時間、リングを扱うことする準備が整いました。 </li></ol></li></ol>血管構築とメンテナンスの4アセンブリ<ol><li>最終的な血管構造物の製造前に、特殊な容器が完成容器を保持するために作成されます。 <ol><li>小血管のために、50mLのポリカーボネートコニカルチューブの上から2インチのセクションを切断することにより、リングの積み重ねのための背の高い板を作成し、PDMS 35ミリメートルプレートにカットエッジを接着。プレートの蓋として円錐形の蓋を使用してください。 </li><li>プレートを積み重ね、中間および大血管背の高いリングのために、背の高い板壁として機能するように縦方向に2.5インチのセクションに1.75インチの直径のポリカーボネートチューブをカット。背の高いプレート底部は、2インチ直径の円形片に0.125インチ厚のポリカーボネートシートを切断します。アクリル溶剤セメントを使用して、円形の切​​断片をポリカーボネート管部分に結合します。背の高い板用の蓋として60ミリメートルのペトリ皿から蓋を使用してください。 </li><li> 3DのpRINTポスト5、直径10から20mm、長さ50mm。 </li><li>各コンテナに未硬化のシリコーンの10ミリリットルを追加します。 PDMSの完全な硬化に先立ち、中央にそれぞれ、小さな中間、および大規模な容器にステップ4.1.3で作成した各ポストを配置します。 </li><li> 2-3時間、60℃にホットプレートセットに硬化させます。 </li><li> 30分間、30％蒸留水で70％エタノール溶液で滅菌します。 </li><li>慎重に各容器からエタノールを吸引した後、BSCで空気乾燥させ。次に、その蓋、フェイスアップの隣に配置、各プレートとフード内のコンテナを配置します。さらに滅菌のための追加の30分間BSCの下でUV光にコンテナを公開します。 UV照射後のすべてのステップで滅菌技術を使用してください。 </li></ol></li><li>非常に微細な鉗子を使用して、慎重にそのポストから各きつく巻か平滑筋ヒドロゲルリングを削除し、背の高いポストとその対応するより大きな容器に移します。 <ol><li>のペアを使用しますそれぞれの手で鉗子とは、ポストからリングの片側を持ち上げ、その後、他の。内腔を保護し、維持するために注意してください。 </li><li>背の高いポストに最初の1辺、リングのもう一方の側をスライドさせる、この両手方式で転送を実行します。穏やかな、緩やかな動きを使用して、円周方向に働いて、ゆっくりと背の高いポストの上にリングを押し下げます。所望の血管の長さは、各リングが完了構築物の長さの約1〜ミリ加えると、得られるまで、続いて組織リングスタック。 </li></ol></li><li>ポストは、作業面と平行になるように背の高い3Dプリントポスト上に位置決めリングのスタックを使用すると、プレートを回します。 <ol><li>マイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間および大血管の外表面に軽く100 U / mLの濃度でトロンビンの40、80および160μLを追加します。トロンビンを添加しながら、ゆっくりと構築物の全ての表面の均一な被覆を確実にするためにプレートを回転させます。これは、構築後の初期日にリングスタック構造体を固定するために利用フィブリン糊のベースになります。 </li><li>次に、迅速に構築体を回転させながらマイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間、および大規模な構築物の20mg / mLの濃度でフィブリノゲンの40、80および160μLを追加します。トロンビンおよびフィブリノーゲンはすぐに一度混合固いゲルに設定してください。短い硬化時間に、可能な限り迅速かつ均等にフィブリノゲンを適用します。 </li></ol></li><li>構築物を保持する各コンテナに分化培地の20 mLを加え。 37℃のインキュベーターに置き容器が必要になるまで。 3〜5日毎のメディアを変更します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

リングスタッキングメソッド現在の血管組織工学構築物の技術上の複数の利点を提供します。 RSMは、単にポストと外殻寸法をカスタマイズすることによって、任意の大きさの人間の血管を生成するように適合され得ます。私たちの方法は、ヒトの細胞でのみ構成されるポリマーフリー工学血管の開発を可能にし、迅速に身体の自然な創傷治癒過程で見つかった支持体材料を劣化させます。ポ...

冠動脈疾患（CAD）の処置において、患者自身の血管バイパス手術用移植材料として回収します。しかし、多くの場合、病気の患者は、自分自身に寄付する実行可能な船を持っていない、と彼らが行う場合には、ドナー部位は、かなりの追加的な害を引き起こし、感染の重大なリスクがあります。 1操作された血管移植片は、この必要性を満たすことができます。スケーラビリティは、患者の血管のサイズ要件の広い範囲を満たすために、エンジニアリング船の最も重要です。しかし、エンジニアリング船舶のための本方法は、容易に拡張されず、一般的に複雑な金型またはポリマー足場の再製造を必要とします。ほとんどの操作された移植片血管線維芽細胞、平滑筋、または内皮細胞を播種されたポリマー管状足場を利用してのいずれか。または組織管を作成するために、マンドレルの周りに細胞シートをロール。臨床試験における二工学血管移植片は、脱細胞化に基づいていますDポリマー-ECMプラットフォーム。血管の修復に使用できる2、3、4ポリマー移植片は、既に持続ポリマーの存在とグラフトの長期適用の主な課題として生じる可能性が開存性の問題を有することが知られています。管状の型は様々なサイズで血管を生成するためにカスタムモールドのための追加の設計及びツールの製造を必要とする手順、完全に細胞容器を製造するために使用される5、6、7、8、9、10、11、12、13れています。 本明細書に記載される方法は、容易に拡張操作血管を作成するための新規な技術を包含しますカスタマイズ可能な3Dプリント挿入と伝統的な培養プレートを使用して移植片。 14細胞は、中央ポストと外殻のインサートを有するプレートに播種します。ポストコントロールは直径ルーメンと自己集合組織のリングにに細胞単層を可能にします。リングの外殻を制御する厚さ、および最終的な容器のこのように壁の厚さ。完成した組織のリングは、その後、管状血管移植片を形成するように積層されています。この方法の利点は、「リングスタッキング法」と呼ばれる任意の接着細胞タイプは、単に修正ガイドを挿入することによって生成することができるプレートの設定および組織環または所望の用途に必要な任意のサイズの管に播種することができることです。組織のリングを作成する組織工学における比較技術は、15、スケールに難しいまま各所望の大きさのために金型の再製造を必要とする16。さらに、この方法を用いて作製血管グラフトを生産することができ2-3週間でdは、数週間では速く、他の操作された容器に比べて。 図6は、診療所では、この時間のずれが悪化している患者の治療に有意な差を作ることができます。

<table><tbody><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td>vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Medium 231</td><td>Gibco (Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>M-231-500</td><td>media specific to vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PSC-100-042</td><td>growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability</td></tr><tr><td>Replicator Mini 3D printer&amp;nbsp;</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer filament</td></tr><tr><td>Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)</td><td>Ellworth Adhesives&amp;nbsp;</td><td>3097358-1004</td><td>polymer for gluing plate parts</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Hyclone Labratories, Inc.</td><td>SH30256.01</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Thrombin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>F3879-5G</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Tranforming Growth Factor-Beta 1&amp;nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>growth factor for stimulating collagen production</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Polycarbonate tubing&amp;nbsp;</td><td>US Plastics&amp;nbsp;</td><td>PCTUB1.750X1.625</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Polycarbonate sheet&amp;nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>409497</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Adhesive polymer solvent&amp;nbsp;</td><td>SCIGRIP</td><td>10799</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Instron 5940</td><td>Instron</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>U-Stretch</td><td>Cell Scale</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>Smooth Muscle Actin&amp;nbsp;</td><td>MA5-11547</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Tropomyosin</td><td>MA5-11783</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr></tbody></table>

scaling of engineered vascular grafts using 3d printed guides and the ring stacking method

冠動脈疾患は、数百万人のアメリカ人に影響を与え、死の主要な原因です。利用可能な自家血管移植片の不足により、人工移植片は、患者の治療のための大きな可能性を提供します。しかし、操作された血管移植片は、一般に容易に拡張されない時間がかかり、高価な練習を構成する、異なるサイズをカスタマイズするためにカスタムモールドまたはポリマーチューブの製造を必要とします。人間の動脈は、約2.0〜38ミリメートルから約0.5〜2.5ミリメートルから壁の厚さで内腔直径の範囲です。我々は、血管平滑筋細胞（SMC）とここに実証所望の細胞型の組織の可変サイズのリングは、内腔の直径を制御するために、中央ポストのガイドを使用して作成することができる」は、環スタッキング法」と呼ばれるメソッドを作成しましたそして、外殻は、血管壁の厚さを決定します。これらの組織のリングは、その後、血管の自然な形状を模倣、管状構造物を作成するために積層されています。容器の長さがbのことができますeは、単に必要な長さを構成するのに必要な環の数を積層して合わせ。私達の技術を用いて、血管に類似した管状の形態の組織は、容易に診療所および患者のニーズを満たすために寸法および長さの多様で製造することができます。

ここで実証されたリングスタッキング法（RSM）がスケーラブルであることを示し、3つの異なる工学血管移植片の大きさ（ 図1）の製造です。適用性を証明するために、3つの異なる容器のサイズは、動脈左前のため、実際の人間の血管サイズに相関を選択した（小;直径ルーメン= 4ミリメートル）17、（中間;直径ルーメン= 10ミリメートル?...

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Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

スケーラブルな設計された血管は、臨床適用性を改善するであろう。簡単にかなりの3Dプリントガイドを使用して、血管平滑筋のリングは、血管移植片を形成し、筒状に作成して積層しました。移植片は、単純に、3Dプリントガイドサイズを変更することによってヒト冠状動脈寸法の範囲を満たすような大きさにすることができます。

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K ビュー.  Wayne State University. スケーラブルな設計された血管は、臨床適用性を改善するであろう。簡単にかなりの3Dプリントガイドを使用して、血管平滑筋のリングは、血管移植片を形成し、筒状に作成して積層しました。移植片は、単純に、3Dプリントガイドサイズを変更することによってヒト冠状動脈寸法の範囲を満たすような大きさにすることができます。 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

操作された血管柄マッスルフラップ

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Standardized Technique of Aortic Valve Re-implantation for Valve-sparing Aortic Root Replacement

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures prevents a number of cardiac surgeons from incorporating them into their practice. The aim of this protocol is to describe a simplified and user-friendly technique of an aortic valve-sparing root replacement (VSRR) procedure by re-implantation of the aortic valve. Proper selection of patients and limitations of the technique are discussed.
In 54 consecutive patients, normal appearing aortic valves were re-implanted in a commercially available polyester prosthesis with pre-shaped sinuses by a simplified and standardized technique. Placement of the first row of the proximal suture line, choice of the prosthesis size, and adjustment of the height of the commissures of the patient to the fixed height of the sinus portion of the prosthesis were slightly modified from the reference techniques with the aim of increasing its feasibility for use by other cardiac surgeons. Early mortality and morbidity as well as 5-year survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were collected in all patients.
Thirty-day mortality, re-sternotomy for bleeding, re-sternotomy for mediastinitis, and the incidence of stroke were very low, 1.8% for each (1 of 54). No patient required permanent pace-maker implantation. At 5 years, survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were 97.5%, 95.2%, and 91.6%, respectively.
Mid-term results of our standardized technique of re-implantation of the aortic valve for valve-sparing aortic root replacement are very good and compare with more complex techniques reported by experienced surgeons. By following the present protocol of the standardized re-implantation technique, a greater number of cardiac surgeons can perform this procedure with comparable good results.

Valve-sparing aortic root replacement has the advantage of preserving the patient&#39;s own aortic valve. The complexity of the reported techniques to date restricts their use to a limited number of cardiac surgeons. This protocol describes step-by-step a standardized technique reproducible by a greater number of cardiac surgeons.

弁温存大動脈の大動脈弁再置換術の標準化された技術のルート交換

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures ...

医学

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

要約

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拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

操作された血管柄マッスルフラップ

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

弁温存大動脈の大動脈弁再置換術の標準化された技術のルート交換

3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

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拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

操作された血管柄マッスルフラップ

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

弁温存大動脈の大動脈弁再置換術の標準化された技術のルート交換

3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製