作者は感謝してCNC加工との彼の援助のためにニールホワイトハウス（WPI、ヒギンズのマシンショップ）を認める。さらに、我々は、Camtasiaの支援については、MATLABプログラミングだけでなく、ケイト飲料とジョセフCotnoir（WPI学術技術センター）との援助の彼女アドリアーナヘラを（WPI学術情報基盤センター）に感謝いたします。ソフィーバークとJacleenベッカー（WPI学術技術センター）は、補足的なビデオ映像を提供。この作品は、国立衛生研究所（R15 HL097332）、マサチューセッツ州立大学医学部 - WPIのパイロット研究イニシアチブ、米国心臓協会（JZHに学部研究フェローシップ）、及びウースター工科大学（JZHや制度への夏季留学研究フェローシップによって資金を供給された）MWRに立ち上げ資金。

1。細胞播種の金型製作 2mmのセンターポストの直径は15、丸底、環状の井戸を作るためにポリカーボネートの1 / 2&quot;厚切りを粉砕することによって開始する。粉砕されたチャネルは6深さmmと幅の3.75ミリメートルです。クリーンとするポリカーボネートの鋳型を乾燥製粉工程からプラスチック製の破片を取り除く。 ミックスポリジメチルシロキサン（PDMS）硬化剤に塩基を10:1の比（w / w）の時、脱気は、すべての気泡を除去するため、およびポリカーボネートの金型に流し込む。ドガは、再び残りの気泡を除去し、4時間、60℃のオーブンで硬化する。 一度硬化、慎重にゆっくりとポリカーボネートから離れて剥がすことによりPDMSのテンプレートを削除し、石鹸と水で洗浄し、オートクレーブ。また、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に溶解した二パーセントアガロース（W / V）の溶液をオートクレーブ。 水平な面にPDMSのテンプレートを置き、溶融AGAで埋める<html>センターポストの金型のそれぞれに最初にピペッティングアガロース増加し、その周りの空間にピペッティング。アガロースが（約15分）固化することを許可し、PDMSからアガロースを解放するために金型を反転させる。各ウェルの周囲から余分なアガロースを切断し、12ウェルプレートにアガロース井戸を配置。 2。細胞培養とリングの播種金型の上面を覆っなく、アガロースの金型の外側に細胞培養培地（10％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシン含有DMEM）を追加します。インキュベーターでプレートを配置し、セルを準備しながら約15分間平衡化することができます。 90％の合流点に、ラットの大動脈平滑筋細胞（rSMCs）をトリプシン処理し、5 × 10 6細胞/ mlの濃度で懸濁します。各ウェルに細胞を適用する円運動を使用して環状のアガロース各ウエルに細胞懸濁液100μL添加、。 内容が&quot;&gt;必ずインキュベーターの棚が水平になっていることを確認し、インキュベーターでプレートを配置して、24時間邪魔されずに座ってすることができます。Exchangeの培地は2日ごとに、その後も世界中からメディアを吸引し、そして再充填を各ウェルになるまでアガロースがよく、完全に水没しています。 3。組織のリングの収穫と厚さ測定文化の結論では、中央の支柱の上にそれをスライドさせてアガロースの型からリングを取り外します。 、（PBS）リン酸緩衝生理食塩水で小さなペトリ皿にリングを置き、センターのサンプル、およびデジタルイメージングシステムを用いて画像を取得。 エッジ検出のための画像解析プログラムを使用し、その円周に沿って4ヶ所（上、下、左と右）にリングの厚さを測定する。各リングの平均厚さの値（t）を計算し、断面積を計算するためにこの値を使用（2π（T / 2）2）。 4。リングの機械的試験水平位置での引張試験機（インストロンEPS 1000）を設定します。 1N ± 1mNロードセルとカスタム細いワイヤグリップを（ステンレス鋼線を曲げることにより作成された）に取り付けます。 二つの薄い線のグリップでリングのサンプルをマウントします。 5表面張力風袋荷重がサンプルに適用されるまでグリップを延長する。断面積を（厚さの測定値から算出）を入力して、ゲージの長さを記録。 プレサイクルの8倍10mm /分の速度で風袋荷重と50 kPaの応力と鳴る。第八プレサイクル後に、10mm /分で失敗に引き出します。失敗は次への一回の測定から40％力の低下として注目されている。各リングのサンプルの場合は、究極の引張応力（UTS）と故障のひずみを測定し、取得したデータから最大接線係数（MTM）を計算する。 5。組織のリングとしてsembly組織のチューブを作製するカスタムチューブホルダーは、長方形の切り欠き（2センチ× 3センチ）で丸5センチメートルポリカーボネートディスクから機械加工されています。 twoホルダーをねじ込むことができるように、これらのディスクを介してネジ穴を開けます。カスタムチューブホルダーをオートクレーブしてから、空のシャーレにバイオセーフティキャビネット及び場所に移す。 斜めのエッジを作成するための角度で1.9ミリメートルの直径のシリコンチューブの端をカットして、シリコンチューブをオートクレーブに外科はさみを使用してください。チューブはオートクレーブされている間、メディアとのペトリ皿を埋める。 アガロース井戸からリングを外し、メディアとのペトリ皿の中に置いてください。場所は、使用前にそれらを湿らせると同じシャーレにシ​​リコンチューブをオートクレーブ。 リングの中心にシリコンチューブの斜めの端に置くと静かにシリコンチューブの上にリングをスライドさせて鉗子を使用してください。里の希望数を繰り返すNGS。軽くチューブに沿って両方向に連続してそれらを押すことでお互いに接触するリングをスライドさせます。このメソッドは、文化の中で唯一の1日後に収穫したリングに使用することができます。 リングがマウントされると、ポリカーボネートホルダー内にシリコンチューブを合わせ、一緒にホルダーの二つの部分をねじ込みます。 100ミリメートルシャーレにホルダーを配置し、55 mLのメディアを追加します。交換メディア文化の期間中、3日ごと。 組織のチューブを削除するには、ポリカーボネートのホルダーからシリコンチューブを解放し、シリコンチューブをオフし、PBSで満たしたシャーレに組織管をスライドさせて鉗子を使用する。 6。代表的な結果： プロトコルが正しく実行されると、細胞は24時間以内に対応する金型ポストの直径に等しい内径と組織のリングを形成するために集約。 cultur場合、リングの縁は、外観と（通常スムーズです。レベルの表面上にED）、全周厚さで均一である。組織のリングは、取り扱いが容易であり、その後の機械的および組織学的分析のための彼らの井戸（Gwyther ら参照。、2011 8）から削除することができます。組織のリングの形態、マトリックス組成、および機械的性質は、播種された細胞の数と種類によって異なります。 さまざまな種類の細胞、播種条件、および文化の長さから作られた組織のリングからの代表的な結果を表1に示す。 5 × 5 rSMCsから作成した2つの内径のリングは、私たちの以前に発行さ2 mmのリング（6.6x10 5 rSMCsから作られる）から作成されたリングよりも高いUTSを示した。ラットの細胞、ヒト平滑筋細胞（HSMC）と同様に8が容易に組織を形成するために集約文化の中で唯一の14日間（データは示さず）の後にコラーゲンを大量に含まれているリングは、。ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）も集約して形成された凝集リングが、ラcked機械的強度と一軸引張試験の初期プリサイクリング段階で破った。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> N </td><td>セル数</td><td>厚さ（mm） </td><td>文化の長さ（日数） </td><td> UTS（kPa）の</td><td> MTM（kPa）の</td><td>障害株（MM / MM） </td></tr><tr><td> rSMCリング</td><td> 6 </td><td> 66万</td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMCリング</td><td> 4 </td><td> 50万</td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> HSMCリング</td><td> 3 </td><td> 75万</td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSCのリング</td><td> 3 </td><td> 75万</td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / </td><td> N / </td><td> N / </td></tr></tbody></table> 表1。培養パラメーターと異なる種類の細胞、播種濃度、及び文化の持続時間から生成さ2ミリメートルのリングの機械的性質を示す表。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> 図1（）組織のリングの生成プロセスの模式図。粉砕された環状のウェル（B）カスタムポリカーボネート型。中央郵便直径は2mmです。それはポリカーボネートの金型から剥離された後に（C）PDMSのテンプレート。 （D）集計組織のリングは、2 mmのポストでアガロースの金型で培養。 PBSで（E）二mmの直径の組織のリング。スケールバーは= 6ミリ（B、C）と2ミリメートル（D、E）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> 図2応力-ひずみ曲線produの代表プロット一軸引張試験からCED。

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li><li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li><li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs.">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li><li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization.">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li><li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units.">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li><li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro.">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li><li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios.">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li><li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. a. n., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices.">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li><li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery.">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li><li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

最近では、セルベースまたは足場ベースの組織工学的アプローチのいくつかの制限を解決するために&quot;足場のない&quot;組織工学の手法に関心の高まりがあった。特定の細胞由来の組織、細胞およびそれらが生産する行列から作成されていることを、彼らは本質的には外因性物質が含まれていない、非常に高い細胞密度を含んでおり、人間の細胞やタンパク質から完全に行うことができます。ヒトの細胞から作られた人工血管は、外因性の足場の不在で実質的な機械的強度（例えば、ヒト伏在静脈1600 mmHgに比べて圧力が3400 mmHgにバースト）12を得ることができる。セルベースの血管組織が ​​改善された細胞密度と機械的強度を示すが、ほとんどの現在の製造方法は、（そのような&quot;シートベースのエンジニアリング&quot;3,4,12または5,13を &quot;bioprinting&quot;のような）大規模な文化の期間が必要（&gt; 3ヶ月）または三次元組織の構築のための特殊な装置。細胞由来の組織のリングメタodは短期間内におよび特殊な装置を使用せずに強固な3次元組織構造を形成するために迅速な細胞の自己組織化を可能にするここで説明する。 このプロトコルの詳細私が2mm内径のラット平滑筋細胞由来の組織のリングを作成するために開発された手順。本例では、組織のリングは7日間（その後、リングの融合と管形成のための追加の7日間培養）培養した。しかし、2mmのラットは（と人間）平滑筋細胞のリングウェルから除去し、細胞播種後の一日には早く処理（例えば、シリコンチューブへの転送）のための十分な粘着性がありますすることができます。さらに、様々な内径（2、4、および6 mm）を持つ堅牢な組織のリングは、単にオリジナルのポリカーボネート型のポスト径を変更することにより、この方法で作成することができます。8私達はまた、最近5 2をイネーブルにするにはポリカーボネートの金型の設計を変更単一のマルチウェルアガロース室でキャストするミリシーディング井戸、どの以下PDMSとアガロースを使用し、6穴プレート（データは示さず）の1つのウェルに収まります。よく、ポスト径の変化、播種の幅、丸みを帯びた底部の曲率半径、井戸のシード数、またはシード井戸の深さは、すべてのCNCのCADファイルに仕様を変更するだけで変更できますポリカーボネートの金型の加工。最後に、単一のポリカーボネートの金型は、PDMSのテンプレートを無制限に製造するために使用することができ、それぞれのPDMSのテンプレートは、洗浄オートクレーブと何十回も再利用することができます。 初代ラットの平滑筋細胞（セルアプリケーション、R354 - 05）、初代ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ロンザ、CC - 2583）、初代ヒト：組織のリングのサイズを変更することに加えて、我々はを含む、多くの異なる細胞型からリングを行っている皮膚線維芽細胞11（博士ジョージピンの寛大な贈り物、生体医工学のWPI部）、ラットの肺線維芽細胞（RFL - 6、ATCC CCL - 192）、および間葉系幹細胞（ロンザ、PT-2501）。これらの細胞型の凝集と組織のリングを形成するためにセンターポストの周りの契約のそれぞれ、細胞の組織、ECMの構成、および構成要素の機械的性質は、各セルのタイプによって異なりますが。各セルのタイプのためのシードパラメータは経験的に細胞の大きさと能力を集約するために基づいて決定する必要があります。従って、細胞由来の組織のリングを作成するこのシステムは非常に汎用性のときに、プロトコルは、異なる細胞タイプで最適な組織形成のための微調整が必​​要な場合があります。 説明したように組織のリング形状は、一軸引張試験によって容易に積載し、組織の材料特性の評価を容易にします。血管収縮と生理的機能を測定するために血管のリングセグメントを使用するための実質的な先例もあります。予備研究では、細胞由来の組織のリングは薬理学的応答を測定するためのワイヤーミオグラフデバイス上でマウントできることを示していると収縮力発生（データは示さず）。完全に、迅速に、組織学的、機械的、生理学的、および生化学的分析のために自己組織化セルのリングを製作する能力は、健康と疾病における血管組織の構造と機能をモデル化するための有用である可能性が強力な新しいツールを示唆している。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン（PDMS） </td><td>ダウコーニング</td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ</td><td> 5万</td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15から017 - CV </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> PAA </td><td> A05 - 201 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> Mediatech </td><td> 30から002 - CI </td></tr><tr><td>デジタルイメージングシステム</td><td> DVT株式会社</td><td>モデル630 </td></tr><tr><td>一軸試験機</td><td>インストロン</td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td>エッジ検出ソフトウェア</td><td> DVT株式会社</td><td>フレームワーク2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

毎年、患者数十万人は米国の冠動脈バイパス手術を受ける。これらの患者の1約3分の1が病気の進行または前の収穫のために適切な自己ドナーの容器を持っていない。血管組織工学の目的は、これらのバイパスグラフトに適した代替ソースを開発することです。さらに、設計血管組織は、心血管疾患を研究するために血管モデルを生きているような貴重な証明するかもしれない。エンジニアリングの血管へのいくつかの有望なアプローチは、細胞ベースの手法の開発と分析に焦点を当てた多くの最近の研究で、調査されている2-5ここでは、我々がで使用できる3次元組織のリングに急速に自己集合細胞に方法を提示血管組織をモデル化するためのin vitro。 これを行うには、平滑筋細胞の懸濁液を丸底環状アガロースのウェルに播種されています。アガロースの非接着性は、目を許可するまとまりのある組織の環を形成してウェルの中央でポストの周りに、骨材との契約を決済する電子細胞。6,7は、これらのリングは前に、機械的な生理学的、生化学的、または組織学的分析のために収穫するために数日間培養することができる。我々は、これらの細胞由来の組織のリングは同じような期間（&lt;30 kPa）の培養、他の組織工学的血管構造のために報告された値を超えて100〜500 kPa引張強さ8で得られることが示されている。9,10我々の結果は、その堅牢な細胞を実証由来の血管組織のリングの生成は、短い期間内に達成し、そして細胞および血管組織の構造と機能への細胞由来のマトリックス（CDM）の貢献の直接的および定量的に評価するための機会を提供することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering at JoVE.com

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元（3D）の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして機能する。

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K ビュー.  Worcester Polytechnic Institute. この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元（3D）の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして?...

ビデオ: Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

生物工学

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...