私たちのプロトコルは、研究者が明確かつ簡単に追跡可能な方法で血管ネットワーク形成プロセスを研究することを可能にし、新しい研究への扉を開き、血管の行動に光を当てることができます。この技術は、周囲の環境に応答して、高度に組織化され、反復可能な血管ネットワークを作成する可能性を提示します。血管疾患を患う患者由来の内皮細胞をこのシステムを用いて回収することができ、血管疾患を再現し、適切な治療法を見つけることを可能にする。
提案された方法は、異なる細胞タイプと組み合わせたときに血管ネットワークの挙動を研究するために拡張することができ、特定の組織タイプとの発達血管の相互作用を観察することを可能にする。スキャフォールドを最低15分間70%エタノールに浸し、PBSで2回洗います。フィブロネクチンストック溶液1.5マイクロリットルを、スキャフォールドあたり28.5マイクロリットルのPBSと混合して播種する。
ピペットのエラーを避けるために、すべての足場に使用される1フィブロネクチン希釈液を準備します。疎水性表面の上にスキャフォールドをまばらに置き、フィブロネクチン希釈液の30マイクロリットルで各足場を覆います。プレートの蓋を交換し、フィブロネクチンで覆われた足場を摂氏37度、湿度100%に設定したインキュベーターに1時間以上入れます。
インキュベーション後、PBSでスキャフォールドを軽くすすいでフィブロネクチン残骸を除去する。足場は、最大1週間、摂氏4度でPBSに保管することができます。製造者が示す抗生物質溶液、FBS、および内皮細胞増殖サプリメントを含む、対応する培地キット成分と基底培地を混合して、内皮細胞またはEC培地を調製する。
ヒト脂肪微小血管内皮細胞懸濁液を、1ミリリットル当たり400万個の細胞濃度でEC培地に含めます。鉗子を使用して、非TC 24ウェルプレートにウェルあたり1フィブロネクチンコーティング足場を1つ置きます。各足場を細胞懸濁液の25マイクロリットルの液滴で覆い、サスペンションが足場から流れ落ちないようにします。
蓋をプレートに置き、60〜90分間、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%のインキュベーターに入れます。インキュベーション後、各々に700マイクロリットルのEC培地を充填します。蛍光顕微鏡を用いて、または3日間、EC合流を観察できるまで、内皮化足場をインキュベートする。
1 日おきにメディアを変更します。低グルコースDMEMの500ミリリットル、FBSの57.5ミリリットル、非必須アミノ酸の5.75ミリリットル、グルタマックス5.75ミリリットル、ペニシリンストレプマイシン-ナイスタチン溶液5.75ミリリットルを混合することによってDPSC培地を調製する。内皮化された足場を新しい非TC 24ウェルプレートに移します。
現在のプレートからすべての媒体を、ピペットまたは真空吸引を使用して廃棄し、足場に真空を直接適用しないように注意してください。各井戸の中央に足場を1つ置き、周囲を軽い真空で乾燥させます。PBSを用いた希釈トロンビンおよびフィブリノーゲンストック溶液を、それぞれ1ミリリットル当たり5単位、15ミリグラムの最終濃度にします。
トロンビン希釈で1ミリリットルの懸濁液あたり800万DPSCを調製し、播種する足場あたり個々のマイクロチューブに懸濁液の12.5マイクロリットルを配布します。5~50マイクロリットルのピペットを12.5マイクロリットルにセットし、フィブリノーゲン溶液で満たします。チップを取り外さずに、ピペットを25マイクロリットルにセットします。
先端の材料が上昇し、空のボリュームを残す必要があります。液体が先端の開口部に届くまで、プランジャーボタンをゆっくりと押しますが、漏れません。プランジャーをこの位置に持ち、トロンビン懸濁液中の細胞を含むマイクロ遠心分離管の1つにチップを入れ、先端が液体に接触していることを確認します。
プランジャーボタンをそっと放し、セルサスペンションを先端に引き込みます。両方の材料を十分に混合し、泡の形成を避けます。内皮化足場の上に混合材料を素早く分配する。
各スキャフォールドに対して上記の手順を繰り返し、チップ内の予期しないフィブリンゲル形成を避けるために、用途間のチップを変更してください。プレート蓋を交換し、スキャフォールドを摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度100%で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1対1のDPSCおよびEC培地を1ミリリットルずつ充填します。
1週間の培養、一日おきに培地を交換する。培養中の異なる時点で、ウェルから培地を取り出し、共焦点顕微鏡を使用して構築物を画像化し、血管の発達または他の目的のパラメータを研究する。このプロトコルはSU-8のフォトレジストから成っているテセレーション足場の製造を可能にする。
明確なコンパートメント形状と非常に正確で再現可能な特徴を備えた足場が得られました。従来の内皮細胞と支持細胞の両方の同時播種により、細胞は足場上に均一に分散し、予測不可能で組織化されていない血管ネットワークを生じた。それどころか、段階的な細胞播種は、高度に組織化された血管ネットワークをもたらした。
蛍光内皮細胞を使用する場合、血管をリアルタイムで画像化することができます。内皮細胞を発現する赤色蛍光タンパク質を六角足場上で培養し、画像化した。支持細胞を1日目に添加し、血管ネットワークを1日おきに画像化して血管の発達を定量化した。
各時点について、足場全体の広い画像が撮影されました。容器の成長は、容器の全長および面積として定量化した。多色の内皮細胞を用いた単一の血管追跡を可能にするために、共焦点イメージングタイムラプスを行った。
船路はタイムラプスから発生し、船舶の移動を観察することが可能です。血管成熟は平滑筋アクチンおよび支持細胞の存在によって観察された。円形、六角形、および二乗コンパートメントの場合、細胞は増殖し、構造に編成されます。
7日目までに、すべての形状は豊かで複雑な血管ネットワークを示した。より高い倍率画像は、形成された血管と共局化した高密度平滑筋アクチンおよび支持細胞存在を明らかにし、支持細胞の採用および血管構造を取り巻く分化を促進した。この技術は、特定の細胞阻害剤や追加の細胞タイプの存在下で異なる条件にさらされたときの三次元血管ネットワークの挙動を研究するために使用することができる。
