The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

実験は、テルアビブ大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行いました。 マウスからの膵臓組織の1の単離<ol><li> 成体マウスの場合： <ol><li>私はハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に溶解し0.4ミリグラム/ mLのコラゲナーゼPおよび0.1 ngの/ mLのDNアーゼ：消化緩衝液を準備します。たて15-mLコニカルチューブにマウス当たり緩衝液5mlを準備し、使用するまで氷上で保管してください。 </li><li>制度ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 </li><li> （命令のために、文献18を参照してください）膵臓を除去するために、各マウスを解剖。 HBSSを含む培養皿に入れてください。 4個の - 実体顕微鏡下でこの段階を実行するために、及び、消化効率を高める2に組織を切断することが可能です。 </li><li> （ステップ1.1.1で調製した）消化緩衝液を含むチューブに膵臓組織を置きます。すべてのマウスを解剖し、膵臓組織されるまで氷上にチューブを保ちます集めました。 </li><li>残りのマウスと1.1.4 - を繰り返して、1.1.2を繰り返します。 </li></ol></li><li> 胚および新生児マウスの場合： <ol><li> 0.4ミリグラム/ mLのコラゲナーゼPおよび0.1 ngの/私はHBSSに溶解mLのDNアーゼ：消化緩衝液を準備します。 15-mLコニカルチューブにマウスあたり2mLの緩衝液 - 生後7日（P7）または若い時胚および仔のために、新たに1.5を準備します。 15-mLコニカルチューブにマウス当たり緩衝液4mL - P7または古い子犬の場合は、3を準備します。使用するまで氷上で保管してください。 </li><li>制度ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。胚のために、母親の子宮からすべての胚を除去し、PBSを含む10 mmの培養皿に配置します。一度に一つの胚を解剖。 </li><li>その頭が研究者から離れて指していると、その背中の上でマウスを置きます。細かい鉗子を使用して、マウスの絞り18までの腹腔を露出するように正中線で腹部の皮膚、オープンを引き上げます。 </li><li>微細な鉗子を使用して、肝臓のFRを外しバック腹壁をオム。マウス尾に向かって連続運動では、（肝臓、胃、脾臓、腸、腎臓、および膵臓を含む）内臓をかき出すとHBSSを含む培養皿に配置します。 </li><li>実体顕微鏡下では、膵臓（ 図1）を露出するために肝臓と腎臓を削除します。細かい鉗子を使用して、脾臓から、最終的には胃、十二指腸から膵臓を切り離し、と。 </li><li> （ステップ1.2.1で調製した）消化緩衝液を含むチューブに膵臓組織を置きます。 P14以前仔については、消化効率を高めるために2片に組織を切断します。すべてのマウスを解剖し、膵臓の組織が収集されるまで氷上でチューブを保管してください。 </li><li>残りのマウスと1.2.6 - を繰り返して、1.2.2を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 2.膵臓消化<ol><li> agitatで37℃で30分間加熱ブロック中の（消化緩衝液中）膵臓組織を含むチューブをインキュベート700 rpmでイオン。 15分後、手動でそれらを3反転させることによってチューブを振る - 4回、バック加熱ブロック内に配置します。 注： - 10分攪拌機能なしの加熱ブロックを使用している場合は、チューブごと5を反転。組織が適切に消化されていることを確認します。ない場合は、インキュベーションの前に小さな断片に組織を切断や撹拌を増加させます。 </li><li> 、組織消化を停止し、氷上でチューブを配置し、各チューブに冷HBSS 10mLのを追加します。遠心管4℃で5分間、300×gで、上清を吸引除去します。 </li><li> 再懸濁： <ol><li>成体マウスおよびP14または古い子犬のために、PBS 6mLのでペレットを再懸濁し、新しい15 mLコニカルコレクションのポリプロピレンチューブの上に置い70μmのセルストレーナーを介して株。最大の細胞の回復を確実にするために、PBSの追加の6 mLでオリジナルのチューブを洗浄し、コレクションチューブにセルストレーナーを介して株。 </li><li>胚および仔のための若いトン漢P14は、PBS 2mLでペレットを再懸濁し、5-mLの丸底ポリスチレンコレクションチューブ（FACSチューブ）の上に置か35μmのセルストレイナーを介して株。最大の細胞の回復を確実にするために、PBSの追加の2 mLでオリジナルのチューブを洗浄し、コレクションチューブにセルストレーナーを介して株。 </li></ol></li><li>遠心管4℃で5分間、300×gで、上清を吸引除去します。細胞がゆるくポリスチレンチューブに接続されているように、慎重に液体を削除します。 </li></ol> 3.準備標識単細胞<ol><li>緩衝液調製物は：FACSによる細胞の単離のために、PBS（塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし）、5％ウシ胎児血清（FBS）、および5mM EDTAを混合することによってバッファを仕分け準備します。フローサイトメトリー分析のために、0.05％アジ化ナトリウムを用いてバッファを選別補充による分析バッファを準備します。両方のバッファは、最大2ヶ月間4~8℃で保存することができます。 </li><li>ソートやANAで細胞を再懸濁溶解バッファー。再懸濁を1.5mLの古いP8と1ヶ月の間仔から、および3mLの中で1カ月以上経過したマウスから、1ミリリットル中のp7より若い胚および仔から分離された各膵臓を。丸底ポリスチレンチューブ（FACSチューブ）の上に置か35ミクロンの細胞ストレーナーを通して細胞株。 </li><li>コントロールを染色するために、前の手順（全試料体積の5％以上）で行われたサンプルから100-μLアリコートを50-取り出し、新しいFACSチューブに入れます。 DAPI蛍光タンパク質を含む使用された各蛍光団、のためだけでなく、未染色のコントロールのためのチューブを含みます。 注：蛍光タンパク質を発現する細胞を有するトランスジェニックマウスを使用する場合は、細胞数が限られている場合、または、染色対照としての非トランスジェニック組織を含みます。蛍光タンパク質を発現する細胞は、さらに、染色することなく使用されている場合は、3.8に進みます。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引します。 </li><li>圏のための王は、（ヤギIgGの1μLを補っソート100μLまたは解析用バッファ）をブロッキング溶液で細胞を再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>細胞表面マーカーを染色するために、サンプルあたり100μLの容量で全ての所望のフルオロフォア標識抗体を含む混合物を準備します。選別または分析緩衝液中の2倍の抗体希釈液を調製する（ すなわち、二重の必要な濃度を得るために抗体を希釈し、1の最終希釈場合：100：200が所望される、抗体1希釈）。ブロッキング溶液を洗浄することなく、200μLの最終染色量を達成するために、サンプル細胞に混合物の100μLを追加します。氷上で30〜60分間、暗所でインキュベートします。 </li><li>解析や並べ替えのパラメータを（ステップ4.3と5.2を参照）を設定するには、一つだけ（染色対照）使用される抗体のが含まれている追加のチューブを準備します。 （ステップ3.6で説明したように）ソートや解析バッファに2倍抗体希釈液を調製します。 SIを含めるようにしてください使用した各蛍光団だけでなく、未染色の制御のためのngle染色対照希釈。ブロッキング溶液を洗浄することなく、200μLの最終染色量を達成するために、細胞（ステップ3.3で調製した）に対する抗体混合物の100μLを追加します。氷の上で、暗所で60分 - 30インキュベートします。 </li><li>分析を各チューブに充填するか、4 mLと最大容量までバッファをソートすることによって洗浄します。 （ステップ3.2で説明したように）必要に応じて、35ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞を再株。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。 </li><li>再懸濁分析におけるサンプルまたは並べ替えバッファ。再懸濁1ミリリットル中に1ヶ月より若い仔から、1から500μL中の胚から単離された細胞、 - 2ミリリットルで3カ月齢、および3mLの中で3カ月以上経過したマウスからを。染色対照は緩衝液300μLに再懸濁することができます。 </li><li>死んだ細胞を同定するために細胞を再懸濁するためにDAPIの200 ngの/ mLを加え。チューブの共同を含めるようにしてくださいサイトメーターの設定のためにDAPIずに未染色細胞をntaining。セルソーティング（ステップ4）、または分析（ステップ5）に進みます。 </li></ol> 4.セルソーティング<ol><li> 準備： <ol><li> RNaseでRNA抽出に先立って、コート1.5-mLの捕集管を細胞選別のための阻害剤すぐにソートする前に。この目的のために、滅菌した1.5 mlのコレクションチューブに、0.01 U / mLのRNase阻害剤を含有する緩衝液を選別の1ミリリットルを加えます。 5分後、チューブをボルテックスし、液体を除去。 </li><li>セルは、従来の細胞培養物にソートするための、無菌の15-mLのコレクションチューブに（20％FBS、1％L-グルタミン、および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））無菌の培養培地を3 mLを加え。 </li></ol></li><li> FACSソーターにチューブをロードする前に、渦それは簡単に細胞を再懸濁します。氷の上に残っているチューブを保管してください。 </li><li> 例えば、（選別パラメータを決定するために染色コントロールを分析することによって開始し、 </em&gt;電圧補償）および選別ゲート（ 例えば、全細胞集団、生DAPI陰性細胞、および細胞集団）をソートします。 </li><li>ソートパラメータとゲートが設定されたら、サンプルをロードし、コレクションチューブに細胞ソーティングを開始します。 注：ソート条件は、機器に大きく依存しています。私たちは、100μmのノズル幅、23.1 PSIの圧力、および5の最大のソート速度を使用します。 </li><li> RNA抽出または選別された細胞の培養に進みます。 注：RNA抽出のために、5分間、2000×gで細胞を遠心分離し、標準的な抽出プロトコルを続行する前に、過剰な液体を除去します。細胞は、非滅菌条件下で選別された場合、細胞を培養するために、培養培地でチューブを充填し、その汚染を最小限にするために培養する前に7分間300×gでそれを遠心分離することによって二回洗っ。 </li></ol>フローサイトメトリーによって5細胞分析<ol><li>リットルになる前にそれは簡単に再懸濁細胞にサイトメーター、渦の中に各チューブをoading。氷の上に残っているチューブを保管してください。 </li><li>分析パラメータ（ 例えば、電圧補償）を決定するために、染色されていない単染色した試料を分析することによって開始します。 </li><li>分析パラメータが設定されると、染色対照を含め、各サンプルをロードし、結果を記録。解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いて得られた結果を分析します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、膵臓の微小環境の細胞を分離し、分析する方法について説明します。この方法は、胚および成体膵臓組織からの間葉系細胞を単離することができます。加えて、我々は成功し、成人および新生児の膵臓5、17から内皮細胞を単離するために、このプロトコルを使用していました。しかし、（代替プロトコルは文献18、23、及び24に記載されている）、膵臓上皮細胞の再現可能な単一細胞懸濁液を得るために適当ではないかもしれません。この方法では、蛍光標識された細胞を用いて、いずれかの蛍光タンパク質を発現するか、表面マーカーについて免疫染色し、FACSにより精製またはフローサイトメトリーによって分析することができます。 RNAは、それらの遺伝子発現パターンをプロファイリングするために精製された細胞から抽出することができます。あるいは、精製された細胞は、その後のプロテオーム解析のための細胞株を確立するために培養することができます。このメソッドは、要素eの特性評価を可能にしますその器官、生理学、および病態生理を支配する膵臓の微小環境によってxpressed。 膵臓の間葉は、前駆体および分化した細胞5、9の増殖を促進することによって、組織の器官形成をサポートしています。これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞（hESCの）の拡大を支援することが示された膵臓前駆細胞を17、25、26に由来。従って、胚の間葉要素の同一の輪郭を描くことは、糖尿病に対する潜在的治療法として、ヒトES細胞及び人工多能性幹細胞（iPS細胞）からのインスリン産生β細胞を生成するために、現在の努力を促進するであろう。マウスの遺伝学的研究は、膵臓の発達の初期段階の膵臓上皮の拡大を促進するために間葉により産生されるようFGF10などの成長因子、の同定を可能に3,9。胚間葉において発現さらなる因子を同定する目的で、我々は、レーザー捕捉顕微解剖を使用して、これらの細胞を単離し、それらのRNAを抽出し、遺伝子発現解析26を行います。しかし、労働集約型であることに加えて、この方法は、従来、周囲の間充織（ すなわち、E12.5）への上皮の分岐に発達段階にその使用を制限し、その形態学的特徴に基づいて、細胞を同定することに依存しています。後で発達段階での間葉系細胞を特徴づけるために、我々はここ5、17記載の方法を採用しました。 私たちは、新生児の膵臓の間葉5によって表面マーカーの発現を分析するために、このメソッドを使用していました。また、間葉系細胞は、Nkx3.2 -Creの胚および新生児の膵臓組織から単離された; R26-EYFPマウス、に基づいこのマウス系統での蛍光標識、および細胞株17を確立するために培養しました。 hESC由来の膵臓前駆細胞17を促進する能力と膵臓の間葉によって分泌される因子の同定のために許可されたこれらの細胞のプロテオーム解析。我々はさらに、RNAの抽出および遺伝子発現解析17のために、成体膵臓組織からの間葉系細胞を精製するために、この細胞分離法を使用しました。したがって、この方法は、膵臓細胞の発達をサポートする能力を、膵臓の間充織によって発現された遺伝子およびタンパク質を同定するために用いることができます。 膵臓の間葉系細胞は、さらに、膵臓腫瘍形成において役割を果たすことが示されました。 PDACは、線維芽細胞からなる線維芽細胞が豊富な線維形成、間質、免疫細胞、及びECM 27の形成によって特徴付けられます。間質は、多くの発展を促進すると考えられていたが癌の種類は、それがPDACの進行15、16、28を抑制することが示されました。これは、膵臓間質の成分が腫瘍形成を阻害する因子を分泌することを示唆しています。また、間質細胞の組成物中、並びに細胞表現型の変化は、上皮細胞15、16、28日にそれらの効果を基礎とすることができます。ここで説明する方法は、したがって、健康な膵臓組織と比較して、PDAC間質を構成するさまざまな細胞型を特徴付けるのを助けることができます。さらに、異なる間質細胞型の精製は、PDACの進行の間に、それらの遺伝子発現プロフィールの潜在的な変化を特徴づけることを可能にします。しかしながら、そのようなADDITを含めるように腫瘍形成27中の膵臓ECM組成の変化、組織消化パラメータの調整に起因ionalコラゲナーゼタイプまたはインキュベーション時間を増加させる、必要とされ得ます。

哺乳類におけるエネルギー恒常性と食品の消化は適切な膵臓機能に依存しています。外分泌と内分泌：成人の膵臓は、2つの主要な細胞内コンパートメントで構成されています。生成及び分泌する消化酵素および消化管にこれらの酵素を輸送管細胞を、合計膵臓の質量1の80％以上を含む腺房細胞を含む外分泌細胞、。インスリン産生β細胞及びグルカゴン産生α細胞、内分泌細胞、外分泌組織中に埋め込まれ、血糖値2を調節するホルモンを分泌しているランゲルハンス島に編成されます。 膵臓細胞は、高度に調節され、多段階プロセス3を介してそれらの分化の運命を獲得します。証拠は、ニューロン、内皮細胞、および間葉細胞によって提供される外因性の手がかりは、トンで膵臓細胞の分化と増殖を導くことを示唆しています彼胚3、4、5。一例としては、早期膵臓前駆体6の仕様のための大動脈の要件です。後で開発において、内皮細胞は、両方の膵臓の内分泌および外分泌細胞の発達において中心的な役割を果たすことが示され、β細胞分化4、6、7を促進します。間葉細胞は、主として成長因子FGF10 8,9の分泌を介して、共通の膵臓前駆細胞の生存および増殖を支持することが示されました。我々はさらに、これらの細胞は、胚性膵臓5における内分泌と外分泌前駆細胞の増殖、ならびにの（腺房とベータ細胞を含む）に分化した細胞をサポートすることを示しました。最近では、間葉系細胞はさらにでした内分泌細胞の分化10を調節することが示さ。 成人では、β細胞機能及び質量は、ニューロン、免疫、および内皮細胞、ならびに周皮11、12、13を含むそれらの微小環境中の細胞に依存することが示されました。傷害時に、内皮細胞は、β細胞の複製13を促進するために膵臓に免疫細胞を動員することが示されました。内皮細胞は、さらに、インスリン発現およびβ細胞機能14を支持するために、細胞外マトリックス（ECM）の成分を生成することが示されました。我々は最近、β細胞機能11のための膵島周皮細胞の必要性を実証しました。最後に、膵臓間質細胞は、膵管腺癌（PDAC）15、16の進行を調節することが示されました。しかし、ID膵臓の発達、機能、および腫瘍形成を導く外因性の手がかりの実体は不明な点が多いです。 膵臓の微小環境の細胞により提供されるキューを識別することは、これらの細胞によって発現された遺伝子やタンパク質を特徴づける必要があります。これは、および/または細胞株を確立する上で、遺伝子発現およびプロテオミクス分析を実行するために、膵臓から、これらの細胞を単離することに依存します。ここでは、蛍光タンパク質を発現する免疫蛍光標識された細胞または細胞のいずれかの組織の酵素消化および蛍光活性化セルソーティング（FACS）を利用して、膵臓の微小環境の間葉系細胞を単離する方法を提案します。このプロトコルは正常に、胚、新生児、および成人膵臓5、17の間葉系細胞を単離し、黄色蛍光タンパク質（YFP）発現を分析するために行きました。

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polystyrene 5 mL tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td></tr><tr><td>5 mL tube with 35 &amp;mu;m cell strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS tube</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Heating block with agitation&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

膵臓の間充織は、開発と成人期に必要とされます。ここで説明する方法は、胚、新生児、および成人の膵臓からの間葉系細胞の単離を可能にします。間葉系細胞、ない他の細胞型は、Nkx3.2 -Creの膵臓に黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現します。 R26R -YFPマウス5、11、17、19。開発時には、（またBapX1として知られている）Nkx3.2は胚膵臓、胃、および腸間葉だけでなく、骨格体節19、20、21のサブセットで表されます。この遺伝子は、E9.5 5からNkx3.2 -Creの制御下での遺伝子発現を可能にする、E9.5からE11.5まで、膵臓間葉において発現されました</suP&gt; 19、20。この標識に基づいて、細胞を、フローサイトメトリーを用いてバルク膵臓組織から精製することができます。ここで説明するように、図2は 、胚、新生児、および単離された成人の膵臓組織からの単一細胞のフローサイトメトリー分析を示します。非トランスジェニック膵臓組織は、蛍光細胞を含んでいなかったのに対し、Nkx3.2 -Cre;すべての分析年齢層からR26R -YFP膵臓組織は別個のYFP標識細胞集団（;ゲートが付いている図2）が含まれています。 ここで説明する方法に従って、蛍光タンパク質を発現する細胞を精製またはまたは追加の免疫染色することなく、フローサイトメトリーで分析のいずれかであり得ます。 図3Aに示すように、例えば、蛍光標識に基づいて並べ替えた後に、間葉系細胞は、（少なくとも5継代）細胞株を確立するために培養することができます。トンに注意してください。<html>彼は、間葉系細胞への典型的な培養細胞の形態を、線維芽細胞のできます。また、このシステムは、選別された細胞により遺伝子発現を分析しました。この目的のために、RNAは、cDNAを合成するために選別さ間葉細胞から抽出し、遺伝子の発現レベルをqPCRにより分析しました。このような分析は、選別された細胞は、汎間葉マーカーのビメンチン（ 図3B）を発現することが明らかになりました。最後に、膵臓細胞による表面マーカーの発現は、フローサイトメトリーによって分析することができます。例えば、我々はNkx3.2 -Creの膵臓組織から細胞を単離しました。ここに記載された方法を用いてR26R -YFP成体マウスおよび細胞表面が線維芽細胞22で表現することが報告されたCD9を、糖タンパク質とそれらを染色しました。 図3Cに示されるように、すべてのNkx3.2 -Creで細胞を蛍光標識しました。 R26R -YFPの膵臓はCD9を発現します。 tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：胚および新生児の膵臓組織。 E15.5胚（A）とp4の子犬（B）の胃、脾臓、小腸、および膵臓を含む、単離された全消化管、。膵臓組織は青色の線で区画されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> 図2：間葉系細胞を蛍光Nkx3.2 -Creで標識されています。 R26R -YFP膵臓組織。フローサイトメトリーの非トランスジェニック（左パネル）から単離された膵臓細胞の分析およびNkx3.2 -Cre; R26R -YFP様々な年齢でのトランスジェニック（右パネル）マウス：胚（A）、新生児（B）、および広告ULT（C）。細胞を、側方散乱（y軸）と黄色蛍光（x軸）について分析しました。 （ &quot;D&quot;でマーク）ゲイツ氏は、非トランスジェニックコントロールにおけるトランスジェニックマウスにおけるYFP +細胞集団の存在ではなく、を示しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> 図3：孤立した膵臓細胞の解析。 Nkx3.2 -Creの膵臓組織から選別（A）細胞; R26R -YFP（ 図2B参照）新生仔マウスは、細胞株を確立するために培養しました。位相コントラスト（灰色;右パネル）;培養した細胞を蛍光（右と左のパネル緑）のために画像化しました。 （B）Vimentin1（VIM1）を示すバーダイアグラムNkx3.2 -Creの膵臓組織からYFP + -sorted細胞による発現レベル;ソートされていない膵臓組織（黒）と比較して、R26R -YFPの成体マウス（緑を図1Cに記載されています）。 RNAを抽出し、遺伝子発現を定量PCRによって分析しました。式は、 シクロフィリンに対して標準化しました。 N = 4 *** P &lt;0.001。データは、平均±SDを表します。 （C）Nkx3.2 -Creから分散した膵臓細胞のフローサイトメトリー分析。 R26R -YFP成体マウスの免疫染色されたアロフィコシアニン（APC）とは、抗CD9抗体を抱合し、APC（y軸）と黄色蛍光（x軸）について分析しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

ここでは、間葉系細胞の単離に着目し、胚、新生児および成体マウス組織からの膵臓微小環境内の細胞を単離するための方法を記載します。この方法は、膵臓の発達、機能、及び腫瘍形成を調節する外因性シグナルを解明するために、細胞遺伝子発現およびタンパク質分泌のプロファイリングを可能にします。

フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.2K ビュー.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University. ここでは、間葉系細胞の単離に着目し、胚、新生児および成体マウス組織からの膵臓微小環境内の細胞を単離するための方法を記載します。この方法は、膵臓の発達、機能、及び腫瘍形成を調節する外因性シグナルを解明するために、細胞遺伝子発現およびタンパク質分泌のプロファイリングを可能にします。 

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

がん研究

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

発生生物学

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

医学

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>膵臓がんモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球を用いた養子縁組療法

Flow Cytometry-Based Isolation and Therapeutic Evaluation of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in a Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer is an aggressive malignancy with a dismal prognosis and limited therapeutic options. Adoptive cell therapy, which involves isolating and activating a patient&#39;s own immune cells, such as tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), before re-infusing them, represents a promising experimental approach. However, techniques for adoptive cell transfer in preclinical pancreatic cancer models are not well established. Here, we describe a detailed protocol for adoptive cell therapy using TILs from a syngeneic pancreatic cancer mouse model. The procedure involves implanting live or irradiated mouse pancreatic cancer cells in fluorescence-labeled reporter mice to initiate immune cell influx, then isolating lymphocytes from primary tumors via flow cytometry sorting and/or activating and expanding tumor-reactive T cells ex vivo, and adoptively transferring these activated T cells intraperitoneally into tumor-bearing mice, followed by interleukin-2 administration.&#160;Bioluminescent tumor imaging allows for longitudinal monitoring of orthotopic tumor growth and response to therapy, especially evaluating the tumor-specific cytotoxic effects. This approach recapitulates the logistics involved in developing adoptive cell transfer therapies for pancreatic cancer patients. The results demonstrate enhanced antitumor efficacy of adoptively transferred tumor-reactive T cells compared to irrelevant lymphocyte controls. This versatile methodology enables the in vivo study of adoptive immunotherapy in pancreatic cancer as well as the optimization of cell processing parameters and combination treatment regimens.

<meta charset="utf8"></head><body>膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

We describe a method to utilize tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) from mice through flow cytometry for adoptive cell transfer. This protocol aims to verify the specific cytotoxicity of TILs against tumors in a syngeneic pancreatic cancer mouse model, providing insights into the development of adoptive cell therapies for pancreatic cancer.

膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

Pancreatic cancer is an aggressive malignancy with a dismal prognosis and limited therapeutic options. Adoptive cell therapy, which involves isolating and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

要約

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同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

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