実証された膵臓組織解離プロトコルはシンプルで、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。無傷で生存可能な房状細胞を回復させることは大きな課題です。プロトコルは正常な膵臓、前悪性の損害がある膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍から生存可能な単一セルを回復できる。
ヒトの膵臓腫瘍や炎症を起こした膵臓を解剖するためにこのプロトコルを使用することは、これらの疾患を調査して新しいバイオマーカーや治療法を見つけるのに役立つ可能性があります。この方法は使いやすく、最小限の練習で望ましい結果を得ることができます。このビデオは、プロトコルの詳細を確認するのに役立ちます。
解剖を開始する前に、すべての器具と機器を氷上に準備しておいてください。安楽死させたマウスを固定した後、腹部に70%エタノールをスプレーします。ハサミと鉗子を使用して、動物の生殖器領域に2.5センチメートルのV字型切開を行い、上向きに進んで腹腔を完全に開きます。
マウスの左側にある胃と、脾臓の近くにある膵臓を見つけます。2つの鉗子を使用して、膵臓を胃と十二指腸から引き裂かずに分離します。続けて、膵臓を小腸、空腸、回腸から分離します。
膵臓を右側に移動し、膵臓と胸腔の間の残りの接続を鉗子で分離して、膵臓と付着した脾臓を完全に剥離します。腸間膜脂肪やその他の隣接組織を含まない膵臓を慎重に摘出し、氷上のペトリ皿に広げて検査します。本文中に記載されている組成に従って、解離緩衝液1、2、洗浄緩衝液、酵素活性停止液を予め調製する。
膵臓を氷上の50ミリリットルのチューブに入れ、10%ウシ胎児血清(FBS)とハンク平衡塩溶液(HBSS)ですすいでください。脂肪が浮き、膵臓が沈みます。これは、膵臓にまだ付着している汚染された白色脂肪組織を視覚化し、迅速に除去する簡単な方法です。
次に、マウスの膵臓組織を、5ミリリットルのHBSSを含む滅菌シャーレに移し、氷上で切断するまで保管します。Noyesのはさみとメスを使用して、膵臓を1〜3立方ミリメートルの小片に切ります。組織を遠心チューブに移した後、350G、摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を吸引して廃棄し、細胞片と血球を除去します。0.02%トリプシン-Cおよび0.05%EDTAを含む解離バッファー1に断片を再懸濁し、摂氏37度で10分間攪拌します。直ちに10%FBSとDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で洗浄し、350G、摂氏4度で5分間遠心分離します。
ペレットを10ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、次の解離ステップの前に5分間遠心分離することにより、再度洗浄します。膵臓を解離バッファー2で摂氏37度で15分間インキュベートし、毎分180回転で攪拌します。15分後、滅菌血清ピペットを使用して膵臓断片を上下に10回激しくピペッティングすることにより、機械的解離を行います。
25、10、5ミリリットルから始めて、サイズが小さくなるピペットを使用して繰り返します。サンプルをインキュベートして摂氏37度にします。光学顕微鏡を使用して、懸濁液中の単一細胞の量に応じて解離をモニターします。
トリパンブルーを使用して細胞生存率をモニターします。インキュベーションを継続し、5分ごとにサンプルを採取して解離を確認します。細胞の90%が単一細胞に分離されるまでインキュベートします。
膵臓組織が十分に解離した後、膵臓断片の消失および溶液の濁度の増加によって示され、酵素活性停止溶液で摂氏4度で5分間2回洗浄することにより酵素反応を停止する。このステップから、細胞懸濁液を氷上に保管します。細胞懸濁液を70ミクロンのナイロンメッシュに通します。
ナイロンメッシュサイズが小さいと、細胞の生存率が低下する可能性があります。顕微鏡で細胞の生存率を確認します。細胞を数える前に、ペレットを再懸濁し、5〜10ミリリットルの氷冷緩衝洗浄液で洗浄します。
複数の赤血球が観察された場合は、赤血球溶解緩衝液で室温で2分間細胞を処理します。凝集塊が観察された場合は、前述のように、サンプルをトリプシンで再度処理する必要があります。生存率が80%未満の場合は、磁気活性化セルソーティング、またはMACS MSカラムを備えたMACS死細胞除去キットを使用して生細胞を単離する必要があります。
単離された膵臓組織の赤色は、腺房細胞におけるtdTomatoの発現に起因しています。解離の初期段階では、単離された細胞の数が少なく、多数の凝集塊がありました。その後、生細胞の数を減らすことなく、単離された生細胞が得られました。
インキュベーションが長くなると、細胞の生存率が低下しました。tdTomato陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別法を用いて推定した。穏やかな解離プロトコルは、複数の細胞タイプの回収をサポートし、高い生存率で、目的の細胞タイプの細胞選別をフォローアップすることができました。
生細胞から死細胞までのカウントは、血球計算盤を使用して行いました。凍結した膵臓切片の蛍光画像は、tdTomato陽性の房状細胞を示しました。シングルセルRNAシーケンシングにより、すべての時点で切除された各組織において、蛍光活性化セルソーティングで検出されたすべての細胞タイプが検出されることが確認されました。
腺房細胞におけるカルボキシペプチダーゼ1(CPA1)の発現が研究され、他の細胞タイプのトランスクリプトームとのコンタミネーションが最小限に抑えられていることが示されました。インキュベーション時間が長くなると細胞の生存率が低下するため、サンプルをモニターし、顕微鏡下で数分ごとに組織の解離と細胞の生存率を観察することが重要です。細胞単離プロトコルは、単一細胞RNAシーケンシング、細胞培養、またはオルガノイドの出発物質として使用できます。
この技術により、膵臓がんがどのように発生するかを調べ、炎症組織やがん組織に浸潤する細胞間の相互作用を調べることができます。
