Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
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癌のこの作品 V 学者賞 (V2014 ~ 004) と V 学者プラス賞 (D2016-030) V がん研究財団と、アメリカがん社会制度研究助成 (ACS IRG グラント 58 006 53) からパデュー大学中心に支えられ研究。E. g. p. は、Borch 大学院基金賞パデュー大学医薬品化学および分子薬理部によって支えられました。

1。 準備 0.5%、60 mM Tris pH 8.0、2 ミリメートルの EDTA、60 mM KCl <ol><li>準備 100 mL の低張性溶液バッファー a: 0.3 M ショ糖 NP 40。4 ° C でストア 。
	注: HEK293T など、いくつかの細胞溶解のより少なく厳しい条件が必要です。核は簡単に分離、変更バッファー a: 25 mM HEPES pH 7.6、25 mM KCl、5 mM MgCl 2、0.05 ミリメートルの EDTA、0.1 %np-40、および 10% グリセロールを使用します</li>。
	<li>2 x mRIPA ソリューションの 250 mL の原液を準備: 100 mM Tris pH 8.0、デオキシ コール酸ナトリウム NP-40、および 0.5% 2% します</li>。
	<li>5 M nacl 100 mL 原液を準備します</li>。
	<li>ごとに六つの塩の集中の 1 x mRIPA 溶液 50 mL を準備 2 x mRIPA と 5 M NaCl 水溶液を使用して: 0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM と 500 mM の NaCl。実験を開始する前に氷のすべてのソリューションをクールな</li>
	希望の条件の下で細胞の <li>成長します 。
	注: 蛋白質をノックダウンの効果を判断するには場合、ノックダウンのラインのための SSE は野生型細胞と比較する必要があります。これらの SSE は、サイド バイ サイド実行する必要があります。化学剤や刺激を使用しての例については、セクション 3-5 を参照してください</li>。
</ol> 2。基本的なシーケンシャル塩抽出 <ol><li>収穫 800 万セルそれぞれの条件し、5 mL の氷冷 PBS で 2 回洗って 。
	注: 同等のタンパク質濃度を持っている細胞の数と同じ数を持つことが重要です。セルの正確な数は、個々 のセルの行または特定の蛋白質のために最適化する必要があります。持っていることが重要だ、蛋白濃度の増加は平衡バインディングに依存して溶出曲線の観察を防ぐため、あまりにも多く。ただし、あまりにも少数の細胞とされない場合があります、曲線を検出する十分なタンパク質とクロマチン ペレットは困難に分離し、分数間に失われることができます</li>。
	<li>1 mL のバッファー A + プロテアーゼ阻害剤で細胞を再停止、1.5 mL のマイクロ遠心チューブ、および 4 ° C で 10 分間で下回転トップに転送</li>
	<li>は 4 ° C で 5 分間 6000 × g で遠心分離によって核を分離します 。
	注: この手順後核封筒まだそのままでなければなりません。ペレットが完全に中断されます再核封筒がそのままの場合ただし、封筒を分離するか、クロマチンが解放されると、ペレットは再度中断します。核封筒がない場合そのままバッファー A インキュベーション後、バッファー A の変更を使う</li>
	ペレットを再懸濁の前に核ペレットに <li>追加 200 μ mRIPA 0 mM NaCl + プロテアーゼ阻害剤。15 回を 1 mL ピペットでピペッティングによって各サンプルを均質化します。ペレットを容易に中断する再、戻それは厚さと粘着とピペットに困難なサンプルになると、核が溶解させます。 ただし。
	<ol>の先端に餌を描く、遠心分離機管の底面に対してピペット チップの端をタップするために <li>。一度、核からの DNA をリリース ピペッティングことが壊れますので、ペレットは完全に分解しない</li>
	</ol></li> <li>3 分の氷の上のすべてのサンプルをインキュベートすべての試料をホモジナイズ時 
	メモ: インキュベーション時間を興味の蛋白質によって最適化する必要があります</li>。
	<li>4 ° C で 6500 x g で 3 分のサンプルを遠心分離によって分離クロマチン ペレット</li>。
	<li>きれいな 1.5 mL 遠心分離機に転送清管。これは 0 mM 分数になります。この 0 mM mRIPA ソリューションの核溶解洗浄ステップとして機能およびクロマチンに関連付けられていない任意の緩やかな蛋白質を削除できます</li>。
	クロマチン ペレット ペレットを再懸濁の前に <li>を追加 200 μ L mRIPA 100 mM の NaCl + プロテアーゼの阻害剤。上下に 15 回ペレットをピペッティングによるクロマチン ペレットを分割します 。
	注: でペレット戻回数と一致する重要です</li>。
	<li>3 分間氷の上加温。この潜伏ステップにより、複数のサンプルがある場合、特に重要である平衡状態に到達するすべてのサンプル</li>。
	<li>6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します</li>。
	<li>は残りの塩濃度 2.6 2.10 を繰り返します 。
	注: 400 mM の NaCl 後、mRIPA ペレットべきはっきりと取れ、管の下部に滞在されません。ペレットを分離した上清中の遠心分離機管の蓋に配置できます</li>。
	<li>蛋白質のローディング x 4 の追加 70 μ L 各分画に染めるし、西部のしみの分析の SDS アクリルアミドゲルに各画分の 30 μ L をロードします 。
	注: 蛋白質の結合プロファイルを決定する、それが重要ライセート、ロードよりもむしろ等しい蛋白質濃度と同等のボリュームをロードします</li>。
	<li>膜に転送することによって標準的な西部のしみを実行し、興味の蛋白質の一次抗体を使用します</li>。
	<li>は、クロマチンから溶出する蛋白質を量的に表わすことでは、赤外蛍光 IRDye 二次抗体にしみと、撮像素子と画像のしみを孵化させなさい。開発の他のメソッドを使用できますが、お勧めします蛍光や赤外線撮像、自然の中より定量的である</li>。
	<li>使用 ImageJ または同様のソフトウェアごとの塩分濃度で溶出蛋白質に対する強度を計算します。塩分濃度に対するバンド強度をグラフ化、興味の蛋白質の溶出パターンを判定できます</li>。
</ol> 3。存在下で連続塩抽出、&#34; リーダー &#34; 阻害剤 <ol><li>細胞 (400 万) の 2 つのセットを収穫し、標準の SSE のように核を分離します</li>。
	<li>は再 mRIPA 0 mM の NaCl を 200 μ l 添加の両方のセットを中断し、3 分間インキュベートします。これは、核内蛋白質の除去のため、します</li>。
	<li>追加 200 μ L mRIPA 0 mM NaCl ペレット。コントロール セットに 1 つのサンプルと DMSO に阻害剤 (1 mm (+) JQ1 2 μ L) を追加します</li>。
	<li>撹拌機、ペレットで 15 回をピペッティングし氷上で 5 分間インキュベート</li>
	<li>6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します</li>。
	<li>すべての塩濃度に 3.3 4 を繰り返し、標準的な西部のしみを実行します</li>。
</ol> 4。逐次塩抽出の存在下、&#34; ライター &#34; 阻害剤 <ol><li>(10 μ M サハ) 阻害剤で細胞を治療または 3 h の DMSO</li>
	<li>各治療のため 400 万セルを収穫します</li>。
	<li>阻害剤のすべてのバッファーに追加でサンプルの標準 SSE を実行します</li>。
</ol> 5。シーケンシャル塩抽出次 DNA 損傷 <ol><li>1 のための 1 μ M ドキソルビシンとセルを扱う</li>
	<li>3 h を回復するようにしセル上のメディアを変更</li>
	<li>800 万セルを収穫し、基本的な SSE を実行します</li>。
</ol> 6。非逐次塩抽出 <ol><li>1200 万セルを収穫し、PBS で洗浄します</li>。
	<li>分割細胞マイクロ遠心チューブあたり 200 万セルが存在するようにします</li>。
	<li>再バッファー A の 500 μ L で中断し 10 分間インキュベート</li>
	<li>6000 x g に遠心分離によって核を分離</li>
	<li>MRIPA バッファー + 塩化ナトリウムの各 200 μ L でペレット再中断します</li>。
	<li>1 mL ピペット チップで 15 回のピペッティングによって各サンプルをホモジナイズしてください</li>。
	<li>氷上 3 分加温</li>
	<li>は、クロマチンを 6500 × g で遠心分離によって分離し、チューブをきれいに清を転送します。ローディングの染料の 70 μ L を追加し、西部のしみの分析のための SDS ページのゲルの 30 μ L を実行します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

塩の抽出でタンパク質とクロマチンの相互作用の評価は何十年も14,15; に採用されている一般的な方法ただし、それが最適化されていない体系的にする前に、フル ・ ユーティリィティを明らかにします。このフレームシーケンシャル方式が蛋白質または環境が変更されるとき、クロマチンの結合の変化を区別するために迅速かつ安価な方法を提供?...

真核細胞における DNA の規制は、細胞内および細胞外刺激に対する応答を調整するタンパク質の品揃えによってしっかりと制御されている複雑で高度なシステムです。DNA がヒストン octamers フォーム ヌクレオソーム DNA に沿って分布やタイトなコイル1に圧縮する疎にラップされました。DNA とヒストンのこの構造の配置は、クロマチン、読み取り、書き込み、およびヒストン2ポスト並進変更 (PTM) を消去するタンパク質のネットワークによって規制されていると呼ばれます。アセチル化などいくつかのヒストン Ptm、ヒストンと DNA の2間の相互作用を変更することで、沈殿するアミノ酸の料金を変更します。また、ヒストン Ptm は転写制御因子、クロマチンの remodelers、DNA 損傷修復機構とゲノム3の特定の領域に DNA 複製機械を採用になります。
クロマチンの相互作用を研究するためのほとんどのメソッドは小規模な相互作用プローブまたは大規模なゲノムワイドな解析を含みます。結合試験体外はしばしば電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA)、等温滴定型熱量測定、蛍光偏光、ペプチド プルダウンなどのアッセイのヒストン ペプチドや DNA と個々 の遺伝子組換えドメインを利用します。これらの試金は通常個々 のタンパク質ドメインに焦点を当てる、彼らは、パズルの小さなピースの理解を容易にするが、多蛋白質の役割ではおろか、マルチ ドメイン蛋白質の共同の性質を理解する私たちを許可して複合体。ほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種合成による複雑さの別の層が追加されます。この蛋白質の不均一性クロマチン風景の動的な性質との組み合わせで難しく、体内へのバインド クロマチン蛋白質の相互作用クロマチン体外を要約します。
生体内での方法を行った進歩;ただし、彼らはしばしば高価な時間のかかる作業、技術的に困難です。4の大幅な最適化が必要ですしかし、クロマチン免疫沈降 (チップ seq) を配列することによって続いて、遺伝子、ヒストン修飾とタンパク質の局在を決定するため便利です。タンパク質が多い相互作用; を維持するクロマチンへの架橋しかし、これは人工の相互作用を作り出すことができる、5をマスキング エピトープを引き起こす可能性があります。さらに、特異性の高い抗体や DNA のせん断とチップ qPCR が頻繁に利用可能な事前既知のバインディングのサイトを使用して IP 条件の大規模な最適化 immunoprecipitations (IP) が必要です。チップの条件の最適化後、試料の加工は高価とシーケンス分析して数ヶ月に数週間が必要です。この方法は貴重なクロマチンの局在を特定するためゲノム、コストの間で蛋白質をバインドおよび時間のコミットメントでは、小さな変化が大域結合特性に与える影響についての仮説を生成するこのメソッドを使用する法外です.
本稿で我々 は逐次塩抽出 (SSE) 試金を使用してクロマチン結合蛋白質の大域結合プロファイルを確認し、蛋白質、複雑なまたはグローバル PTM のプロファイルに変更することができます相互作用を変更する方法を区別する方法について説明します。塩抽出の一般的に、広く使用されている手法ですが、この逐次法が高い再現性で汎用性の高い方法を示す.SSE の複雑なまたは単一のドメインも 1 つサブユニットが一括クロマチン複合体の全体的な親和性に貢献する方法を特徴付けることができます。蛋白質の結合はヒストン マーク ターゲット チップ seq と他のゲノム広い調査を使用して確認することができます興味深い仮説を提供するクロマチン環境の変化によって影響がかどうかを決定するため、SSE を使用もできます。
我々 はもともとこのメソッドから Wu et al., Polybromo1 の機能を調べるため、適応 (PBRM1) PBAF クロマチン remodeler6、7の結合に。この手法を使用すると、我々 は複雑な改造 PBAF クロマチン内クロマチンの結合のための PBRM1 の役割を決定、[この関数7六つの個人 bromodomains の相対的な寄与を決定します。
ここで化学剤によるクロマチンからタンパク質の変位を確認する似たようなクロマチン複合体の変更の相対結合親和性を評価するために、異なったセルタイプにクロマチンの結合を探索するこのメソッドを最適化する方法について説明し、クロマチンの風景に変更後のクロマチンの結合の効果を決定します。

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &gt;=99.9% (titration), crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>GLYCEROL, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 antibody</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Bovine (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td><td>Macron</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine,for electrophoresis, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>20550-0.01</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>30100-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>OVCA429 cells</td><td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A media</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power Source</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

クロマチン ターゲット蛋白質の結合特性の解明は、クロマチンの複雑な性質およびほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種の性質のために非常に挑戦することができます。これらのハードルを克服するために我々 は、クロマチン結合複合体の相対結合親和性を評価するためのシーケンシャル塩抽出 (SSE) アッセイを適応しています。結合 2 つ関連複合体、複合体サブユニットが失われたまたは個々 のドメインを無効にするとときの親和性の変化、変化の親和性の差を評価する非専門家によるこの簡単でわかりやすい分析を使用できます。親和性クロマチンの風景に変更しました。順番に塩の量を増やすことで一括クロマチン再懸濁、クロマチンから特定のタンパク質の溶出プロファイルできたら。これらのプロファイルを使用して、我々 はクロマチン修飾複合体の変化やクロマチン環境に変更が結合の相互作用に与える影響を確認することができます。他のin vitroとin vivoアッセイと SSE をカップリング、個々 のドメインとクロマチン環境の様々 な複合体の機能タンパク質の役割を判断できます。

本稿では、利点と我々 は文学6から適応している一般的に使用される連続塩抽出 (SSE) メソッドのアプリケーションを示しています。図 1ARID1a と PBRM1 の溶出パターンを検出することにより非連続的にタンパク質を抽出する SSE の再現性を比較する.一貫して、ARID1a、BAF サブユニットが 200 mM で主に塩化ナトリウムと PBRM1、排他的な...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

8.3K ビュー.  Purdue University. クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。

ビデオ: Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

遺伝学

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

医学

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

がん研究

酵母細胞からの遺伝子座特異的クロマチン単離

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

著者スポットライト:高濃縮遺伝子座特異的クロマチン単離プロトコルによるクロマチン研究の進展と制限の克服(英語) 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

生化学

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

生物学

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

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転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します