Gunzer 연구소의 연구는 독일 연방 교육 연구부 (부여 0315590 AD)와 독일 연구 재단 (보조금 GU769 / 4-1, GU769 / 4-2)에 의해 지원되었습니다. 우리는 기술 지원에 대한 IMCES와 3D 만화 모델링에 대한 Sebastian Kubat에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 EU 지침에 따라 수행되었으며 Essen의 관련 지방 당국 (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germany)의 승인을 받았습니다. 동물은 SPF (specific pathogen-free) 조건하에 사용 및 보관되었습니다. 1. 디프테리아 톡신 (DTX)에 의한 심근염 유도 <ol><li> DTX 솔루션을 인산 완충 식염수 (PBS)로 1 μg / mL 작동 솔루션으로 희석하여 심근염 유발을위한 DTX 솔루션을 준비하십시오. </li><li> Hasenberg 등이 표시 한대로 8-10 주 된 CD11c.DTR 마우스 ( 약 5ng / g 체중 (bw))에이 용액 100 μL를 천천히 (it) 투여 하십시오. 그것은 곰팡이 포자 현탁액의 적용 20 . 주 : 독소의 복강 내 적용은치명적인 심근염. 그러나이 접근법은 먼저 검증되어야합니다. <ol><li> 그것을 적용하기 위해 100 mg / kg bw ketamine과 10 mg / kg bw xylazine의 복강 내 (ip) 주사에 의해 동물을 마취시킨다. </li><li> 깊은 마취 (발가락 핀치 테스트)에 도달 한 후 구강을 통해 22G 내주 정맥 카테터를 사용하여 동물에게 삽관하십시오. 작은 동물 호흡 보호구로 동물을 환기시켜 렌즈 튜브의 올바른 위치를 확인하십시오. 또한 Hasenberg et.가 보여 주듯이 호흡 당 250μL의 흡입량과 250 회의 호흡량으로 호흡 합니다. al. 20 . 참고 : 올바르게 배치하면 적용된 인공 호흡 설정에 따라 동물의 호흡 률이 변경됩니다. </li><li> 환기 시스템을 분리하고 DTX 용액 100 μL 또는 카테터를 통해 대조군과 같은 양의 PBS를 폐에 주입하고 추가로 1 분 동안 동물의 통풍을 계속하십시오. </li></ol></li><li> 마취에서 회복시키고 4 일 동안 일반적인 건강 상태 및 체중 변화를 모니터링하십시오. 참고 : 유전 적 배경, 마우스 변형 또는 초기 체중에 따라 심근염의 심각성 및 발병 정도가 다를 수 있으므로 먼저 결정해야합니다. </li></ol> 2. Light-sheet 현미경을위한 샘플 준비 <ol><li> 독소를 적용한 지 4 일 후에 기화 된 2 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 유도 챔버를 플러싱하여 쥐를 마취시킨다. 레트로 궤도 응용 경로를 사용하여 PBS 50 μL에 직접적으로 표시된 항 CD45 항체 (클론 30-F11, AlexaFluor647 (AF647))의 15 μg을 정맥 주사 (iv) 주사하여 매우 빠르고 정확한 응용을 보장합니다. 항체의 정확한 양. 참고 : 마우스가 기대어 있고 발가락 핀치 테스트에 반응하지 않으면 원하는 마취 깊이에 도달했습니다. </li><li> 배양 2 시간 후, 자궁 경부 전위에 의해 생쥐를 희생시키고d 5 mL의 PBS / EDTA (5 mM)로 원위치 심장 을 관류시킨다. <ol><li> 21 G 카테터를 사용하여 심장을 노출시키고 우뇌로 관류 용액을 주입하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 것과 대동맥을 절개 한 후 혈액을 배출 할 수 있는지 확인하십시오. 참고 :이 심 관류는 기관의 최종 3D 시각화를 방해 할 수있는 사소한 준비 인공물을 초래할 수 있습니다. 따라서, 진보 된 동물 실험자는 복부 대동맥을 절개하여 하대 정맥을 통해 관류를 수행 할 수있다. </li></ol></li><li> 화학적 고정을 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 5 mL를 사용하여 같은 구멍을 통해 심장을 관류하십시오. 카테터를 제 위치에 유지하고 PFA가 채워진 새로운 주사기를 부착하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 관. 주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이있다; 피부, 눈 및 기타 점막과의 접촉을 피하십시오. <ol><li> 부드럽게 톱니 모양 포 셉를 가진 심혼을 움켜 잡으십시오; 우레탄약간 위로; 들어오고 나가는 동맥과 정맥을 포함한 모든 조직 연결을 차단하십시오. 추가 고정을 위해 장기를 4 % PFA에 4 시간 동안 보관하십시오. </li></ol></li><li> 기관을 탈수하려면 암실에서 4 ℃, 12 시간 동안 각각 50 %, 70 % 및 100 %로 두 번 상승하는 에탄올 시리즈에서 심장을 배양하십시오. 여기에 검정색 5 mL 폴리 프로필렌 반응 튜브를 사용하여 공기 방울 형성을 방지하기 위해 저속 회전 속도를 사용하여 튜브 회 전자에서 일정하게 회전 할 수있게하십시오. </li><li> 화학적 제거로 샘플 준비를 완료하십시오. 마음을 투명하게 만들기 위해 밤새 계속 회전하면서 98 % dibenzyl ether (DBE)에서 배양하십시오. 참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다. </li></ol> 3. 가벼운 판 현미경 <ol><li> 가벼운 시트 현미경을 사용하여 LSFM을 실시하십시오 (재료 표 참조). 현미경의 표준 샘플 홀더에 샘플을 DBE로 채워진 cuvette은 30mm x 30mm x 15mm까지의 시편에 적합합니다. </li><li> 탈수 및 맑은 아가로 오스 블록을 사용하여 이미지를 수집하는 동안 견본을 제자리에 단단히 고정시킵니다. <ol><li> 아가로 오스 블록을 준비하려면 2 % 용융 아가로 오스를 15mm x 15mm x 5mm의 금형에 붓습니다. 응고 될 때까지 아가로 오스가 식도록하십시오. </li><li> 오름차순 에탄올 시리즈 (50 %, 70 %, 100 %에서 두 번)로 탈수하십시오. 98 % DBE에서 아가로 오스 블록을 밤새 품는다. 그것이 사용될 때까지 DBE에 아가로 오스를 저장하십시오. 참고 : 아가로 오스는 주로 물로 구성되어 있기 때문에 각 탈수 단계의 배양 시간은 블록의 크기에 따라 연장 될 수 있습니다. 참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다. </li><li> 필요한 경우 날카로운 메스를 사용하여 준비된 아가로 오스 블록을 원하는 모양으로 자릅니다. 일반적으로 샘플 어댑터의 모서리에 프리즘 또는 쐐기 모양의 양식을 자릅니다. 참고 : 아가로 오스 블록은 탄성이므로,작은 힘으로 밀었을 때 샘플이 제 위치에 유지됩니다. </li></ol></li><li> 적절한 여기 및 방출 필터 설정으로 관심 형광 신호 (여기서는자가 형광 및 항 CD45 항체 염색)를 감지합니다. <ol><li> 결합 조직 유래자가 형광 신호를 검출하기 위해 488 nm의 여기 파장 (OPSL : 50 mW)에서 525/50 nm 밴드 패스 필터를 사용하십시오. AF647 결합 항체로 CD45 염색은 668 nm (밴드 패스 필터 : 680/30 nm) 및 647 nm의 여기 파장 (다이오드 레이저 : 50 mW)에서 검출됩니다. </li><li> 두 개의 개별 z 평면 사이의 거리로 4 μm를 선택하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 후 처리 참고 : 획득 한 디지털 이미지 데이터는 과학적 3D / 4D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어로 처리됩니다 (재료 표 참조). <ol><li> 데이터 파일 열기 및 사전 조정. </strong&gt; <ol><li> 분석 소프트웨어를 시작한 후 왼쪽 상단 모서리에서 &quot;능가&quot;버튼을 선택하십시오. 이미지 스택을 열려면 &quot;File (파일)&quot;, &quot;Open (열기)&quot;을 선택하고 첫 번째 획득 한 채널의 데이터가 들어있는 폴더를 선택하십시오. 획득 한 채널을 추가하려면 &quot;편집&quot;및 &quot;채널 추가&quot;를 선택하십시오. 주 : 데이터 크기 및 컴퓨터 시스템에 따라이 프로세스에는 몇 분이 소요될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 2 수집 채널 (autofluorescence 및 AF647)에 대한 모든 단계를 보여줍니다. </li><li> &quot;편집&quot;을 클릭하고 &quot;이미지 속성&quot;을 선택하여 x, y 및 z 복셀 치수를 수정하십시오. 새 창이 열리면 매개 변수를 조정하십시오. 참고 :이 단계는 사용 된 현미경 시스템과 특정 데이터 형식에 따라 다릅니다. 올바른 xyz 값은 후속 크기 및 원거리 측정에 중요합니다. 대부분의 경우 이러한 매개 변수는 현미경 파일에 메타 데이터로 저장됩니다. 그러나, 파일 format는 분석 소프트웨어에서 올바르게 해석 할 수 없으므로 수동으로 픽셀 크기를 입력하는 것이 중요합니다. x 및 y 차원의 픽셀 크기는 카메라 픽셀 크기, 적용될 수있는 비닝 및 렌즈 및 대물 배율에 따라 다릅니다. z의 픽셀 크기는 자체 정의 된 z 단계 크기 ( 예 : 4 μm)와 같습니다. </li></ol></li><li> 채널 조정 <ol><li> 먼저 &quot;Display adjustment&quot;( &quot;Edit&quot;및 &quot;Show Display Adjustment&quot;)를 열어 autofluorescence 신호를 회색조로 변환하십시오. 새 창이 열리면 모든 채널이 표시되고 모든 채널이 표시됩니다. 기본 색상을 변경하려면자가 형광 채널을 선택하고 &quot;흰색&quot;표시 스타일을 선택하십시오. 적용하려면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 검정 레벨 조정의 경우, &quot;디스플레이 조정&quot;으로 돌아가서 샘플 구조를 나타내지 않는 원치 않는 배경 신호를 제외하도록 검정 레벨 값을 조정하십시오에스. <ol><li> 이렇게하려면 채널 막대의 왼쪽 상단 삼각형을 사용하고 왼쪽에서 오른쪽으로 드래그하십시오. 참고 : 변경 사항은 즉시 시각화됩니다. 샘플에서 파생되지 않는 신호 만 억제하십시오. 추가 계산을 위해 잡음 신호가 필요할 수 있기 때문에 배경의 최소값은 &quot;0&quot;이되어서는 안됩니다. 이미지 획득 후 모든 검은 레벨 변경이 수행되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 중요한 샘플 정보가 손실 될 수 있습니다. 블랙 레벨 조정은 대표적인 목적으로 만 사용됩니다. 다른 샘플에 대해 동일한 디스플레이 설정을 사용하려면 채널 목록 아래의 &quot;최소&quot;숫자 필드에 정확한 값을 입력 할 수 있습니다. 이는 정량 분석에 매우 유용합니다. </li></ol></li><li> 오른쪽 위 삼각형을 사용하여 각각의 채널 밝기를 조정하거나 채널 아래의 &quot;최대&quot;숫자 필드에 정확한 값을 입력하여 밝기 조정을 수행하십시오난 목록. </li><li> 채널 막대의 가운데에있는 아래쪽 삼각형을 드래그하여 감마 값을 높이거나 낮추거나 정확한 값을 입력하여 대비를 조정하십시오. </li><li> autofluorescence 채널에 따라 AF647 채널을 조정하십시오. 차이점으로, AF647 신호의 시각화를 히트 맵 컬러 룩업 테이블로 설정하십시오. 4.2.1 단계와 유사한 접근 방식으로 채널 모드 &quot;화재&quot;를 선택하여이를 수행하십시오. 참고 : 전체 신호 강도가자가 형광 채널에 비해 상당히 낮기 때문에 검정 레벨은 대개 훨씬 낮은 값으로 조정됩니다. 자기 형광 채널에 관해서는,이 채널의 밝기는 일반적으로 증가합니다. </li><li> &quot;블렌드 모드&quot;를 선택하여 조직 구조를 자세히 시각화하십시오. 동일한 매개 변수 값을 가진 한 시리즈의 모든 샘플을 분석하십시오. </li></ol></li><li> 가상 클리핑 <ol><li> 3D 장면 엑스포 전에 오르간을 실제로 자르려면렌더링 된 3D 객체에 클리핑 평면을 적용합니다. <ol><li> 오브젝트 목록에서 &quot;Clipping Plane&quot;아이콘 (가위)을 클릭하십시오. 이미지보기 내부에는 노란색 프레임과 조작자 (흰색 스핀들)가 나타납니다. 스핀들을 마우스로 끝까지 돌려서 클리핑면의 방향을 변경하고 스핀들의 두꺼운 중간 부분을 이동하여 원하는 클리핑 깊이를 선택합니다. </li><li> 객체 목록 아래의 해당 확인란의 선택을 취소하여 프레임과 조작자를 숨기고 원하는 스냅 샷을 만듭니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. 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Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li></ol>

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현대 생명 과학에서 생물학적 과정의 현미경 시각화는 점차 중요한 역할을합니다. 이러한 맥락에서 지난 2 세기 동안 많은 발전이 이루어져이 시점까지는 해결할 수없는 질문에 답할 수있었습니다. 첫째, 광학 현미경의 해상도 능력을 근본적으로 높이는 명백한 경향이있었습니다. 한때 가정 된 해상도 제한으로 인해 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 21 , 22 ,...

광학 현미경의 진화 과정에서 특정 표본에 대한 시각화 과정의 한계를 최소화하기 위해 개발 된 많은 특수 형태가 나타났습니다. 그러한 방법 중 하나는 Light Sheet 형광 현미경 검사 (LSFM)입니다. 1903 년 Siedentopf와 Zsigmondy 1 에 의해 처음 개발되었으며 1990 년대 초반에 최초의 생물학적 응용을 발견했습니다 2. LSFM은 형광 신호 분해능을 가진 손상되지 않은 마우스 기관과 같은 큰 표본의 시각화를위한 가장 강력한 현미경 도구가되었습니다 세포 수준까지 이러한 이점 때문에 생존 세포 이미징 가능성과 함께 Nature Methods는 LSFM을 &quot;2014 년의 방법&quot;이라고 명명했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 LSFM의 샘플 조명은 가벼운 시트에 의해 수행됩니다.이 시트는 사용 된 대상 축에 수직으로 향하게됩니다. f또는 방출 - 광 수집 및 후속 화상 형성을 포함한다. 광 시트는 대개 원통형 렌즈로 광폭의 시준 된 레이저 빔을 초점을 맞추거나 단 하나의 수평 또는 수직 평면 4 , 5 에서 좁고 집중된 레이저 빔의 신속한 옆쪽 이동에 의해 생성됩니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 1 ~ 4㎛의 두께로 이미징 광학 기기의 초점 평면 만 조명됩니다. 결과적으로, 조명면에 배치 된 형광 표본의 경우, 산란광의 생성과 초점면 위 또는 아래 영역에서의 광 표백 효과가 모두 제거되거나 크게 억제됩니다. 초점이 맞지 않은 비행기는 모두 비추 지 않기 때문에이 지역에서는 표백 효과가 생략됩니다. 표준 공 촛점 또는 다중 광자 현미경과 달리 조명과 방출 된 빛의 경로는 서로 분리되어 있으므로 최종 이미지 품질<html> 목표물을 통한 여기 광선의 완벽한 집속에 의존하지 않습니다. 근원적 ​​인 질문에 따라, 조명 된 평면의 가장 큰 가능한 영역이 xy 방향으로 움직이는 구성 요소없이 이미지화 될 수 있도록 방대한 FOV (Field of View)와 함께 대상을 사용할 수 있습니다. 최신 LSFM 시스템에서 생성 된 광학 섹션의 형광 이미지는 매우 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 또는 CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 카메라에 캡처되어 FOV (전체 시야) 마이크로 초. 따라서 라이트 시트를 통해 샘플을 이동시키고 정의 된 z 단계에서 이미지를 획득함으로써 합리적인 시간 8 , 9 시간 내에 표본의 전체 3D 정보를 얻을 수 있으므로이 기술을 라이브 셀에 적용 할 수 있습니다 연구 10 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . 그럼에도 불구하고, LSFM이 신속하고, 민감하며, 형광 친화적 인 방법 임에도 불구하고, 표본을 통한 빛 투과는 여전히 중요한 문제이며, 특히 큰 생물학적 샘플이 3D 분석의 타겟 일 때 특히 중요합니다. 빛의 전달은 흡수의 물리적 측면과 굴절률이 다른 구조물의 경계면에서의 광산란으로 결정적으로 변형됩니다 13 . 따라서 샘플을 수 밀리미터 크기로 이미징 할 때 LSFM은 대부분 샘플을 광학적으로 투명하게 만들기 위해 클리어링 프로토콜과 결합됩니다. 이러한 기술은 각각의 생물학적 조직에서 물을 제거하고이를 특정 표적 조직 구성 요소의 굴절률과 협소하게 매치되도록 선택되는 물 또는 유기 용매 기반 침지 매개체와 교환한다는 아이디어를 기반으로합니다. 결과적으로, 측면 광 산란이 최소화되고, 모든 파장의 광은 조직 (13) 을 훨씬 더 효율적으로 통과 할 수있다. 많은 경우, 이와 같이 처리 된 생물학적 표본은 거시적으로 맑아 보입니다. 따라서 긴 작업 거리, 저배율 목표를 사용하여 전체 마우스 기관에서도 LSFM을 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 심근염의 쥐 모델에서 세포 침투를 조사하기 위해 설립 한 가벼운 시트 현미경 (재료 표 참조)에서 대형 표본 이미징을위한 준비 프로토콜을 제시합니다 15 . CD11c.DTR 마우스는 CD11c 프로모터 16 의 제어하에 영장류 디프테리아 독소 수용체 (DTR)를 발현합니다. 따라서 DTR과 함께 CD11c를 발현하는이 마우스의 세포는 Corynebacterium diphtheria (디프테리아 독소, DTX)의 외독소에 민감하게 반응 합니다. DTX로 이들 동물을 전신 처리하면 모든 CD11c + ce가 고갈됩니다안돼. CD11c는 integrin이며 다양한 다양한 가용성 요소에 대한 세포 표면 수용체로서 주로 단핵구 계통의 세포에서 활성화 및 성숙 과정에 관여합니다 17 . 결과적으로, CD11c.DTR 마우스 모델은 다양한 면역 학적 질문의 맥락에서 수지상 세포 및 대 식세포 서브 세트의 역할을 연구하는데 집중적으로 사용되었습니다. 시간이 지남에 따라 DTX로 전신적으로 치료 된 CD11c.DTR 마우스는 부작용을 일으킬 수 있고 사망률이 급격히 상승 할 수 있다고보고되었습니다 18 , 19 . 최근 우리는 이러한 동물에서 기관 내 DTX 적용 후 극심한 심근염의 발생을 설명하는 근본적인 사망 원인을 규명 할 수 있었다. 독소에 대한 도전은 심장의 자극 전달 시스템의 중앙 부분을 포함하여 세포 파괴를 일으켰습니다. 이것은 거대한 CD45가 동반되었다.+ 백혈구 침윤, 결국 치명적인 심장 부정맥으로 이어진다. 이 경우 백혈구 개체군의 출현이 중요 할뿐 아니라 심장 내부의 공간 분포도 중요했습니다. 이 실험적인 질문은 intravital 항체 염색법과 유기 용제 기반의 광학 제거 프로토콜에 의해 뒷받침되는 light sheet microscopy 접근법으로 해결 한 현대 현미경 영상에 대한 도전 과제입니다.

<table><tbody><tr><td>diphtheria toxin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Biochrom</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>ketamine [50 mg/mL]</td><td>Inresa</td><td>PZN 4089014</td><td></td></tr><tr><td>xylazine [2 %]</td><td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe</td><td>Braun</td><td>REF 9161502</td><td>Braun Omincan F&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>indwelt venous catheter&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 381923</td><td>BD Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>small animal respirator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0044</td><td>MiniVent</td></tr><tr><td>anit-CD45 antibody (AF647)</td><td>BioLegend</td><td>103124</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>catheter (21 G)</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 387455</td><td>BD valu-set</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE tube (5 mL)</td><td>Carl Roth</td><td>EKY9.1</td><td>Rotilabo</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>dibenzyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>tube rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>MACSmix</td></tr><tr><td>agarose (low gelling)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>mold (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Tissue Tek</td><td>4566</td><td>Cryomold&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>light sheet microscope system</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td>Ultramicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>microscope body</td><td>Olympus</td><td></td><td>MVX10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>0.5&amp;nbsp;NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&amp;nbsp;mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sCMOS camera 5.5MP</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm OPSL (50mW) laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>647 nm&amp;nbsp; diode laser (50mW)</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D image processing &amp;amp; analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>IMARIS Ver. 8.3</td></tr><tr><td>transgenic mouse strain</td><td>Steffen Jung et al.</td><td></td><td>CD11c.DTR</td></tr><tr><td>wt mouse strain</td><td>Envigo</td><td></td><td>Balb/c Ola Hsd J</td></tr><tr><td>Laser Module</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2XC Objective Lens</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy

빛샘 형광 현미경 (LSFM)은 화학적 제거 프로토콜과 결합하여 대형 생물 표본에서 형광 표식 구조를 분석하기위한 금본위 제가되었으며 세포 분해능에 이릅니다. 한편 기본 프로토콜의 지속적인 정제와 전문화 된 상용 시스템의 가용성 향상을 통해 우리는 전체 마우스 기관의 미세 구조를 조사 할 수 있었고 다양한 라이브 셀 이미징 접근법에서의 세포 행동의 특성을 고려할 수도있었습니다. 여기, 우리는 염증 마우스 마음에서 CD45 + 백혈구 인구의 공간 전체 마운트 시각화 및 부량에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 치명적인 심장 부정맥을 특징으로하는 치명적인 치명적인 심근염 발달 연구를 위해 강하고 유도 가능한 모델로 작용하는 것으로 최근에 알려진 트랜스 제닉 마우스 균주 (CD11c.DTR)를 사용합니다. 이 프로토콜은 심근염 유도, intravit알 항체 매개 염색, 기관 준비 및 후속 컴퓨터 보조 영상 후 처리를 포함한 LSFM을 포함한다. 우리의 특별한 과학적 질문에 대해 고도로 적응 된 방법으로 제시되었지만,이 프로토콜은 다른 기관의 심지어 다른 종의 형광 구조를 완전히 목표로 할 수있는 쉽게 조정 가능한 시스템의 청사진을 나타냅니다.

제시된 LSFM 접근법은 심각한 심근염 유발시 쥐의 심장에서 백혈구 분포와 양을 분석합니다. 그림 1A 는 심근염 유도에 대한 유전자 변형 CD11c.DTR 마우스의 전처리 프로토콜을 설명합니다. 이 단계는 백혈구를 심근에 모집하는 데 필요한 방아쇠를 나타냅니다. 성공적인 DTX 적용 후, 동물들은 일반적인 약점, 식욕 부진 및 2 ~ 4 일 범위의 체중 감소와 같은 심각한 ...

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K 조회수.  University of Duisburg/Essen.  여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다. 

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Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

연구

면역학 및 감염병학

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

의학

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

생체공학

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

포괄적인 심장 이미징을 위한 Light-Sheet Microscopy and Tissue Clearing (광시트 현미경 검사) 및 Tissue Clearing(조직 투명화)

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

저자 스포트라이트: 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위한 맞춤형 광시트 이미징

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

요약

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마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

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