X線回折データセットは、浦項加速器研究所（韓国）のビームライン7Aで収集した。この研究は、科学技術省、将来計画（2015R1A1A01057574〜MH）の資金提供を受けて、韓国国立研究財団（NRF）が運営する基礎科学研究プログラムの支援を受けて行われた。

1. rBC1531の組換えタンパク質産生および精製<ol><li> 組換えBC1531タンパク質（rBC1531） - 発現プラスミドの調製 <ol><li> B. cereus 10のゲノムDNAを調製する。 </li><li> BamHIおよびSalI制限酵素部位をそれぞれ作製するために、フォワードおよびリバースプライマー（材料リストを参照）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってB.セレウスゲノムDNAの鋳型からbc1531遺伝子を増幅する。 </li><li> PCR産物と改変pET49bベクター（pET49bm）をBamHIとSalIを用いて消化し 、 11 。 </li><li>記載されているように、10μLの反応液中のT4 DNAリガーゼを用いて、ステップ1.1.3からの消化されたPCR産物およびベクター（3：1比）を混合する。 18℃で30分間インキュベートする。 </li><li>ライゲーション反応3μLをケミカ50μLにピペット大腸菌 DH5α細胞をチューブ内に1回通す。ピペットで上下に穏やかに混合し、氷上に30分間置く。 42℃で45秒間の熱ショック。 Luria-Bertani（LB）培地1 mLを添加し、激しく振盪しながら細胞を増殖させる（250 rpm、37℃、45分間）。 </li><li>ステップ1.1.6からの形質転換された細胞100μLを取り出し、100μg/ mLカナマイシン（Kan）を含むLB-寒天プレート上にそれらを広げる。 37℃で約18時間インキュベートする。 </li><li>滅菌チップを使用してコロニーを選び、100μg/ mLのKanを含む3mLのLB培地で細胞を増殖させる;激しく振盪する（250rpm、37℃、18時間）。 </li><li>記載されているように、アルカリ性SDS溶解法を用いてプラスミドDNAを調製する。10 。 </li><li> DNAシーケンシング12を使用して、rBC1531発現コンストラクトのヌクレオチド配列を確認する。 </li></ol></li><li> rBC1531タンパク質の過剰発現 <ol><li> 大腸菌 BL21（DE3）株をrBC1531-expで再形質転換する過剰発現のために、工程1.1.5-1.1.6に記載されているように、レシジョンプラスミド。 </li><li>コロニーを選択し、50μg/ mLカン（LB + Kan）を含む10mLのLB培地で増殖させる。 37℃で18時間激しく振盪する。 </li><li> 1LのLB + Kan培地に一晩培養した10mLを接種し、OD 600 （600nmでの光学密度）が〜0.7に達するまで37℃で増殖させる。 </li><li>培養物を氷冷水中に約15分間浸漬して温度を18℃に冷却し、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度1mMで培養液に添加して組換えタンパク質を発現させる。 18〜18℃でさらに16〜18時間培養する。 </li></ol></li><li> rBC1531の精製 <ol><li>遠心分離（5,000×g、4℃、30分）により細胞を回収する。細胞を乱さないように注意深く上清を捨てる。 10 mMイミダゾールを含む50 mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液に細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞ライセートの過熱（時間：2分30秒;サイクルオン：5秒;サイクルオフ：10秒;振幅：38％）を防止するために、氷上で超音波処理することによって細胞を2回溶解する。 </li><li>遠心分離（約25,000×g、4℃、30分）により細胞溶解物を除去する。 </li><li>ニッケルビーズ3mLと10mMイミダゾールを含む60mLのPBSを混合し、余分な緩衝液を重力流して、平衡化したニッケルビーズを2.5×10cmガラスクロマトグラフィーカラムに沈殿させる。 </li><li>ピペットを用いて、ステップ1.3.3の上清を予め平衡化されたニッケルビーズを有するカラムに移し、低速（約20rpm）で回転ホイール上で4℃で2時間インキュベートする。 </li><li>上清を重力により排出させ、10mMイミダゾールを含有する100mLのPBSでカラム中のニッケルビーズを3回洗浄する。 </li><li> 250mMイミダゾールを含有する4×5mLのPBSを適用することにより、rBC1531タンパク質を溶出する。 </li><li>ステップ1.3.7から15μLの溶出液を取り出し、15％SDS-PAGEで溶出する。タンパク質バンドを可視化するクーマシーブルー染色を用いたゲル10 。 </li></ol></li><li> トロンビンタンパク質分解によるrBC1531タンパク質の親和性タグの除去 <ol><li>この画分を透析チューブ（分子量カットオフ：3kDa）にピペットで入れ、4Lのトロンビン切断適合性緩衝液（20mM HEPES、pH7.4,150mM NaCl、および1.5mMβ-メルカプトエタノール）を含むビーカーに入れ、 4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>画分をピペットで取り出し、コニカルチューブに移す。 </li><li> 280nmでの吸光度を測定し、記載されているようにrBC1531タンパク質濃度を推定する。 </li><li> 0.5 mLのチューブで50μgのrBC1531を取り、様々な量のトロンビン（ すなわち、 2,1,6、および0.3単位）を加える。 rBC1531とトロンビン反応を20℃で約3時間インキュベートして、N末端アフィニティタグを切断するのに必要なトロンビンの量を最小限に抑えます。 </li><li> rBC1531およびトロンビン反応を15％SDS-PAGEで分析し、N末端アフィニティータグを完全に消化し、タグを含まないrBC1531を産生するトロンビンの最も少ない量（ 例えば、 50単位のrBC1531あたり0.3単位のトロンビン）を決定する。 </li><li> 10mgのrBC1531タンパク質と60ユニットのトロンビンを15mLチューブに加え、トロンビン - タンパク質分解反応のために20℃で約3時間インキュベートする。 </li><li>分子量および溶出量の標準曲線を作成するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムにゲルろ過標準を適用する（ 13） 。 </li><li>ステップ1.4.6のトロンビン消化rBC1531タンパク質を遠心フィルターチューブ（分子量カットオフ：3kDa）に入れ、4℃で3000gで遠心分離して、5mL未満の体積に減少させる。 </li><li>濃縮したrBC1531タンパク質をSECカラムにアプライし、溶出画分60個をチューブ1本あたり0.5 mLずつ集めます。 </li><li>それぞれの画分15μLをとり、15％SDS-PAGE上でそれらを実行し、記載の10のクマシー染色溶液（0.15％（w / v）クーマシーブリリアントブルー、40％（v / v）メタノール、および10％（v / v）氷酢酸）を用いたゲル。 </li><li> rBC1531を含む画分をピペットで取り出し、1本のチューブに集めます。 </li></ol></li></ol> 2. rBC1531の結晶スクリーニングおよび最適化<ol><li> rBC1531タンパク質の結晶化のスクリーニング条件 <ol><li>ステップ1.4.11のrBC1531を遠心フィルターチューブを使用して〜18.5 mg / mLまで濃縮します（1.4.8項を参照）。 </li><li>各結晶化スクリーニング溶液（セクション2.2を参照）14μLを96ウェルシッティングドロップ結晶化プレートのウェルに加える。 18.5mg / mLのrBC1531タンパク質溶液0.5μLを座位ベッド上に置く。 0.5μLのウェル溶液とタンパク質溶液を混合し、プレート全体のプロセスを繰り返します。 </li><li>透明な接着フィルムでプレートを覆う。96ウェルプレートを18℃に置き、蒸気拡散を可能にする。 </li><li>光学顕微鏡を用いて20〜40倍の倍率で液滴をスキャンし、結晶形成を毎日2-3週間モニターする。 </li><li>得られたrBC1531タンパク質結晶を用いてX線回折データ12を収集する。 </li></ol></li><li> rBC1531結晶化条件の最適化 <ol><li>選択した初期結晶化条件溶液（ 例えば、 0.1Mカコジル酸ナトリウム、pH6.5および1.0Mクエン酸ナトリウム）500μLを調製し、シッティングドロップ用の24ウェル結晶化プレートを充填する。 </li><li> 0.5μLの18.5mg / mL rBC1531タンパク質溶液を座布団に添加し、ウェル溶液0.5μLと混合し、すぐに透明な接着フィルムでプレートを覆う。 18℃にプレートを置きます。 </li><li> 1週間、光学顕微鏡下で結晶成長を観察する。 </li><li> pHを変化させることによって様々な結晶化条件を最適化する（ すなわち、pH 5.5〜6.8）を用いて、そしてクエン酸ナトリウムの塩濃度（ すなわち、 0.9〜1.2M）を変化させて単結晶を得ることによって調製した。 〜1週間の結晶成長をモニターし、X線回折データを収集する12 。 </li></ol></li></ol> rBC1531のヌクレオシドトリホスファターゼ（NTPアーゼ）活性の特徴付け<ol><li> 無機リン酸依存性比色分析の検証 <ol><li>ピロリン酸（100mM）のストックを調製し、200μLの反応緩衝液（20mM HEPES、pH7.4; 150mM）中に0.1,0.25,0.5,1.0,5.0,10,50,100および250μMの最終濃度に希釈する。 mM NaCl;および2mM MgCl 2 ）で2回洗浄した。コントロールとして最初のプレートを使用してください（これにはピロホスファターゼが含まれていません）。第2プレートには、ステップ3.1.2の指示に従って、作業プレートとしてピロホスファターゼが含まれていることを確認してください。 </li><li> Saccharomyces cerevisiae無機p 0.01単位を加える。ヨウ化ホスファターゼ（1μL）を作用プレートのウェルに添加し、20℃で30〜60分間インキュベートする。 </li><li>モリブデン酸アンモニウム（0.86％v / v）とアスコルビン酸（14％v / v）の溶液を7：3の比で混合することにより、モリブデン酸溶液を調製する。モリブデン酸溶液16μLを作業ウェルと対照ウェルの両方に加え、15分間待つ。 </li><li> 690 nm（OD 690 nm）の光学濃度を読み取ります。 </li></ol></li><li> 比色NTPアーゼアッセイ <ol><li> 100mMのヌクレオシド三リン酸（NTP）基質のストックを調製し、180μLのアッセイ緩​​衝液（20mM HEPES、pH7.4）中で所望の濃度（ 例えば、 0,0.2,4.4,11,22,44,88または132μM） pH7.4; 150mM NaCl;および2mM MgCl 2 ）で洗浄した。 </li><li> 96ウェルプレートで20μgのrBC1531（1.5mM）と3.2.1ステップのNTP基質を200μLまで加え、ピペットで上下にピペットでよく混合します。蓋でプレートを覆い、37℃のインキュベーターに30分間置く基質加水分解反応を実施する。 </li><li>プレートを70℃の水浴に移し、rBC1531媒介触媒反応を停止させるために15分間放置する。 </li><li> S.cerevisiae無機ピロホスファターゼ（1μL）0.01単位を反応プレートの各ウェルに加え（ステップ3.2.3から）、20℃で30分間インキュベートする。 16μLのモリブデン酸溶液を反応プレートに加えて発色させる（約15分）。 OD 690nmで読んでください。 </li><li> 12に記載されているようにMichaelis-Menten方程式を用いて解析する。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr...

組換えタンパク質発現は、限られたタンパク質量および有害な汚染などの天然のタンパク質源に関連する問題を克服するために広く使用されている。さらに、病原性遺伝子およびタンパク質の研究において、追加の安全予防措置を必要としない別の実験室株を利用することができる。例えば、 Bacillus cereusは、 Bacillus anthracisをそれらの近い進化的関係のために研究するための有用なモデルである1 。 炭疽菌はヒトや家畜の致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体であり、潜在的に生物兵器として使用することができる2 。したがって、 B. anthracisに関する実験室研究は、実験室領域が負の室内圧力で隔離されることを義務づけるバイオセーフティーレベル3（BSL-3）プラクティスを必要とする米疾病管理センター（NHS）によって厳格に規制されている。 B. anthracisとは対照的に</eB.セレウスはBSL-1剤に分類され、したがって安全性の懸念が最小限である。 B.セレウスは日和見病原体であり、感染時に食中毒を引き起こし、医学的援助なしに治療することができる。しかしB. cereusはB. anthracisと多くの重要な遺伝子を共有しているのでB. anthracisタンパク質の機能はB. cereus 1の対応する同族体を用いて研究することができる。 B. anthracisの ba1554 - ba1558遺伝子クラスターは、 bc1531 - bc1535クラスターと高度に保存されています Bacillus thuringiensisの bt1364-bt1368クラスターと同様に 、遺伝子構成および配列の点で、B。さらに、それぞれのクラスターの最初の遺伝子（ ba1554 、 bc1531 、およびbt1364 ）は、完全に保存されている（ すなわち、 100％のヌクレオチド配列同一性）、implyiBacillus種における遺伝子産物の重要な役割を担う。これらの遺伝子クラスターにおけるその位置のために、ba1554は、推定転写調節因子3として誤って同定された。しかしながら、 ba1554産物のアミノ酸配列分析は、それがヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ活性を有し、転写因子活性に関連しないMazGファミリーに属することを示している4,5。 MazGファミリーに属するタンパク質は、全配列および長さに関して多様であるが、EXXE 12-28EXXDモチーフによって特徴付けられる共通の約100残基のMazGドメインを共有する（「X」は任意のアミノ酸残基を表し、 X残基の数を示す）。 MazGドメインは、必ずしも特定の触媒活性を直接的に説明するとは限らない。 エシェリヒア・コリ （EcMazG） 由来の MazGメンバーは、2つのMazGドメインを有するが、C末端のMazGドメインは酵素的に活性である6 。さらに、MazG酵素の基質特異性は、非特異的ヌクレオシド三リン酸（EcMazGの場合）から特異的dCTP / dATP（インテグリン関連MazGの場合）およびdUTP（dUTPaseの場合）6,7,8,9まで変化する。したがって、そのNTPアーゼ活性を確認し、その基質特異性を解明するためには、BA1554タンパク質の生物物理化学的分析が必要である。 ここでは、BSL-3機能を持たない大部分の研究室が分子レベルでB. anthracis ba1554のオルソログであるB. cereus bc1531遺伝子のタンパク質産物を特徴づけることができる段階的プロトコールを提供する。簡潔には、組換えBC1531（rBC1531）を大腸菌で発現させ、親和性タグを用いて精製した。 X線結晶学実験のために、結晶rBC1531タンパク質のzation条件をスクリーニングし最適化した。 rBC1531の酵素活性を評価するために、NTPアーゼ活性を比色分析して、従来使用されていた放射性標識ヌクレオチドを回避した。最後に、得られた生物物理化学的データの分析により、rBC1531のオリゴマー化状態および触媒パラメータを決定することができ、ならびにrBC1531結晶からX線回折データを得ることができた。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus cereus&lt;/em&gt; ATCC14579</td><td>Korean Collection for Tissue Culture</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA prep kit</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>Genomic DNA preparation</td></tr><tr><td>Forward primer</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAA&lt;br/&gt; CGATGAAAGATATGCA</td><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI site is underlined</td></tr><tr><td>Reverse primer</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT&lt;br/&gt; CCCTCATCAATACGTG</td><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I site is underlined</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzynomics</td><td>P410</td><td>PCR polymerase</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI</td><td>Enzynomics</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I</td><td>Enzynomics</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b expression vector</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Enzynomics</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB broth (Luria-Bertani)</td><td>LPS solution</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>LPS solution</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-prep kit</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>Plasmid DNA preparation</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent cell</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaros</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Nickel bead</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE protein standard</td></tr><tr><td>Coonmassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Methyl alcohol</td><td>Samchun chemical</td><td>M0585</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>Prepare aliquots of 20 &amp;mu;L (1 Unit per &amp;mu;L) and store at 70 &amp;deg;C and thaw before use</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>General Electric</td><td>28989335</td><td>Size exclusion chromatography</td></tr><tr><td>Gel filtration standard</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>Crystralization plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-083</td><td>96-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>The JCSG core suite I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>Crystallization secreening solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Cryschem plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td><td>24-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>Inorganic pyrophosphatase</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium molybdate solution</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>NTP substrate</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td><td>microplate reader</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Prism 5 for Window</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinant protein expression, crystallization, and biophysical studies of a bacillus-conserved nucleotide pyrophosphorylase, bcmazg

真の病原体から遺伝子やタンパク質を研究する際の安全規制や規制を克服するために、それらの同族体を研究することができます。 Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体である。 Bacillus cereusは、その近縁の進化的関係のためにB. anthracisを研究するための有用なモデルと考えられている。 炭疽菌の遺伝子クラスターba1554 - ba1558はバチルス ・セレウスの bc1531-bc1535クラスターならびにバチルス・チューリンゲンシスの bt1364-bt1368クラスターと高度に保存されており、 バチルス属の関連遺伝子の重要な役割を示している。この原稿ではB. cereusの bc1531のオルソログの組換えタンパク質を用いて炭疽菌の遺伝子クラスターからの第1遺伝子（ ba1554 ）のタンパク質産物を調製し特徴付ける方法を説明しています。

この研究における目的のタンパク質の特徴付けは、好ましくは数ミリグラム以上の十分な量の組換えバチルスセレウスbc1531 （rBC1531）タンパク質を調製することによって開始した。 ba1554と同一のオルソロガス遺伝子を含むので、 BセレウスのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、BC1531タンパク質をコードするDNA断片を調製した。 rBC1531は大腸菌細胞にお...

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Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌の必須病原体であるため、その遺伝子やタンパク質の研究は厳格に規制されています。代わりのアプローチは、オーソロガス遺伝子を研究することである。最小の実験装置を必要とし、重大な安全性の懸念がないB.セレウスの B. anthracisオルソログ（bc1531）の生物物理化学的研究を記載する。

組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究<em&gt;バチルス</em&gt;保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

recombinant-protein-expression-crystallization-biophysical-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

7.4K ビュー.  Yonsei University.  Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌の必須病原体であるため、その遺伝子やタンパク質の研究は厳格に規制されています。代わりのアプローチは、オーソロガス遺伝子を研究することである。最小の実験装置を必要とし、重大な安全性の懸念がないB.セレウスの B. anthracisオルソログ（bc1531）の生物物理化学的研究を記載する。 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

生化学

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

免疫・感染学

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. PRMTs can either mono- or dimethylate arginine guanidino groups symmetrically or asymmetrically. The enzymology of these proteins is a complex and intensely investigated area that requires milligram quantities of high-quality recombinant protein. The baculovirus expression vector system (BEVS) employing Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells has been used for expression screening and production of many PRMTs, including PRMT 1, 2, and 4 through 9. To simultaneously screen for the expression of multiple constructs of these proteins, including domains and truncated fragments as well as the full-length proteins, we have applied scalable methods utilizing adjustable and programmable multichannel pipettes, combined with 24- and 96-well plates and blocks. Overall, these method adjustments enabled a large-scale generation of bacmid DNA, recombinant viruses, and protein expression screening. Using culture vessels with a high-fill volume of Sf9 cell suspension helped to overcome space limitations in the production pipeline for single batch large-scale protein production. Here, we describe detailed protocols for the efficient and cost-effective expression of functional PRMTs for biochemical, biophysical, and structural studies.

The baculovirus expression vector system (BEVS) is a robust platform for expression screening and production of protein arginine methyltransferases (PRMTs) to be used for biochemical, biophysical, and structural studies. Milligram quantities of material can be produced for the majority of PRMTs and other proteins of interest requiring a eukaryotic expression platform.

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

脂質バイセルにおけるABCトランスポーター膜タンパク質の結晶化

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

著者スポットライト:医薬品開発を進めるためのABCトランスポーター膜タンパク質のバイセル結晶化セットアップ 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究

要約

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の生産、結晶化と構造決意

タンパク質結晶の微結晶化および

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究

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タンパク質結晶の微結晶化および

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製