この研究は、NIH R01 DK110355、DK093776 [NTS]、DK102450 [NTS]、およびP30 DK034987 [UNC-チャペルヒルへの] NIH交付金によって支援された。著者らは、qPCRおよびウェスタンブロット実験の支援についてDeekshita Ramanarayananに感謝している。

このプロトコルは、ノースカロライナ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）に従って承認され、実施されます。 1.準備<ol><li>トリトン-X緩衝液（1％トリトンX-100,5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4中の容量を出す）を調製する。 500mLにするには：Triton X-100と500mM EDTAをそれぞれ5mL加え、PBS490mL、pH7.4に入れる。 Triton-X緩衝液は4℃で保存してください。 </li><li>高塩緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.6,140mM NaCl、1.5M KCl、5mM EDTA、0.5％Triton X-100、二倍蒸留（dd）H 2 O中に容量を持ち出す）を調製する。 500mLを作るため：0.5M Tris-HCl（pH7.6）10mL、5M NaCl 14mL、KCl55.9g、0.5M EDTA5mLおよびTriton X-100 2.5mLを撹拌し、容量を500に調整するmLとなるように希釈した）。ハイソルトバッファー溶液は4℃で保存してください。 </li><li>使用直前に、適切な量のTriton-XおよびHigh Salt Buffer（ <emプロテアーゼまたはプロテアーゼ/ホスファターゼインヒビターカクテルで、例えば、25mgの組織サンプルごとに1mL）を除去し、インヒビターを含む未使用のバッファーを捨てる。 </li><li> 1×PBS、pH 7.4中で5mM EDTAを調製する。 500mLを作るために：0.5M EDTA5mLを1xPBS、495mLに撹拌する。 </li><li>獣医学のガイドラインと制度上の基準に準拠した承認されたプロトコルを使用して、異なるマウスの器官（脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸、腸、腎臓、脾臓）を分離する。組織収集手順は、プロテアーゼが豊富な組織（ 例えば、膵臓を最初に処理すべきである）のRNAおよびタンパク質の完全性を保存するために、5分を超えてはならない。 </li><li>その後のRNA抽出、cDNA合成、およびIF遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR解析のために、少量の組織（約5〜20mg）を切断し、RNA保存液に入れます。組織を含むRNA保存液チューブを4℃で一晩置き、さらにプロトコールに従う貯蔵および隔離ステップ。 </li><li>組織の残りの部分をより小さな断片（ 例えば 0.5cm）に切断し、冷凍瓶に入れる。長期保管の場合はバイアルを-80℃または液体窒素でスナップフリーズして保管してください。 </li></ol> IF遺伝子発現解析<ol><li> RNA貯蔵溶液試薬中に保存された組織からRNAを抽出する。製造業者のプロトコールに従って、任意の適切な/好ましいRNA抽出方法を使用する。 </li><li> RNA濃度を定量し、2μgのRNAを使用して、製造業者のプロトコールに従って適切な逆転写キットを使用してcDNAを生成する。 </li><li>生成されたcDNAおよびマウスIF遺伝子特異的プライマーを使用して、各サンプルの3つの技術的複製ならびに製造業者のプロトコルによるブランク対照を含むqPCR反応をセットアップした。 </li><li> IF遺伝子発現を、異なる条件（ 例えば、若い組織と古い組織）を比較した倍率変化として定量化する。 </li></ol> 3.Pイムノブロット用の全組織溶解物の修復<ol><li> 1mLの2×非還元SDSサンプルバッファー中で25mgの組織をホモジナイズする。タンパク質濃度を定量するために比色分析を行う場合は、ブロモフェノールブルー染料をサンプルバッファーから除きます。 </li><li>還元メルカプトエタノール（2-ME）を5％（v / v）添加して還元サンプルを調製する。非還元性サンプル200μLに10μLの2-MEを加える。 </li><li>界面活性剤および還元剤適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。色素が既にサンプルバッファーに含まれている場合、タンパク質量は、クーマシーベースの染色24を含む多くの技術によってゲルを実行した後に推定することができます。 </li><li>すべてのサンプルをボルテックスし、95℃で5分間加熱する。 </li><li>還元条件と非還元条件の両方でウェスタンブロッティングを行います。膜を短時間露出させてモノマー種を明らかにし、より長い時間（&gt; 1分）で高分子量複合体含有物を明らかにするIFタンパク質。凝集をモニタリングする場合、ゲル/膜全体（ゲルウェルの底を含む）を調べる。 </li><li>平行ゲルを実行し、ローディングコントロールとしてタンパク質染色で染色する。疾患モデルまたは傷害実験では、ハウスキーピングタンパク質（ 例えば、アクチン、GAPDH）のイムノブロットとは対照的に、ストレス条件の違いによって後者が変化するので、ローディングコントロールとして全タンパク質染色を使用すべきである。 </li></ol> 4.組織特異的IFの界面活性剤可溶性および高塩濃度抽出物の調製<ol><li>氷冷したTriton X-100緩衝液1 mLをガラス管ホモジナイザーに加え、氷上に置きます。 </li><li>液体窒素保存液から少量の組織（〜25 mg）を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れる。ホモジナイズ（50ストローク）し、気泡を作るのを避けるために、ポリテトラフルオロエチレン乳棒を使用してください。常にホモジナイザーとライゼートを冷たく保ちます。 </li><li>ライセートを1.5 mLのmicrに移す遠心チューブを氷上に置き、予め冷却した遠心分離機（4℃）で20,000×gで10分間遠心する。 </li><li>上清画分を別のチューブに集める。これは、トリトンX可溶性画分であり、免疫沈降（Ip）およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用することができる。脳組織からより清潔なIF抽出物を得るために、ステップ4.1-4.4を繰り返すことができることに留意されたい。 </li><li>組織ペレットに1 mLのHigh Salt Bufferを加え、清潔なホモジナイザーに移し、100ストロークを飛ばします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻して移し、チューブを冷たい部屋の回転シェーカーに1時間置きます。 </li><li>ホモジネートを20,000 xgで4℃で20分間遠心分離する。上清を捨てる。 </li><li>氷冷PBS / EDTAバッファー1 mLをペレットに加え、クリーンホモジナイザーでペレット（20ストローク）を最終的なクリーンアップステップ*としてホモジナイズします。新しいチューブに移し、4℃で20,000×gで10分間遠心分離して、IFタンパク質 -高濃度高塩抽出物（HSE）である。 *任意に、この段階でホモジナイズの代わりにボルテックスする。 </li><li>上清を捨て、予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300μLにペレットを溶解する。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを壊し、95℃で5分間サンプルを加熱する。 </li><li>ペレットが確実に溶解するように必要に応じてボルテックスおよびピペットをかけます。ペレットを完全に溶解させるのに数分かかることがあります。 </li><li>すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。 </li></ol> 5.大量実験におけるIFタンパク質抽出のための自動化組織溶解<ol><li> RNA抽出のために、溶解マトリックスD（小さなセラミック球を使用する）を入れたチューブに溶解緩衝液（組織25mgあたり600μLの緩衝液）を置き、組織ライザーで25秒間2回パルスする。 20,000 xgでの遠心分離によってマトリックスから溶解液を分離し、次の工程に分離する。 </li><li>タンパク質の抽出には、Trit溶解マトリックスSS（単一のステンレススチールビーズを使用）を含む溶解チューブ中で、X-100（または全溶解物を調製する場合はSDSサンプルバッファー）上に置く。複数のマトリックスを試験した後、これは、伝統的な計量法と同様の品質のIFタンパク質抽出物を生成するため選択された。自動化された方法は、膵臓および脾臓に最適ではなく、これらの組織に標準的なホモジナイゼーションプロトコルを使用する必要があることに注意してください。 </li><li> High Salt Extractの調製を進めるには、磁石を使用してステンレスビーズをチューブから取り出し、チューブを20,000 xgで10分間4℃で遠心します。 </li><li>手動プロトコルのステップ4.4（上記）に進みます。 </li><li>すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。 </li></ol>翻訳後修飾IFタンパク質の免疫濃縮<ol><li> PBST緩衝液（PBS中0.02％Tween-20）を調製する。 50mLを調製するために、10mLのTween-20を50mLのPBS（pH7.4）に加える。 </li><li> PTM抗体を調製する（PBST200μL中の抗体1〜10μg）。一般に、3μgの抗体/反応は、必要に応じてさらに最適化できる良好な開始条件である。 </li><li>各反応について、50μLの磁性ビーズを微量遠心管に分注し、磁石の上に置き、ビーズ保存液を吸引します。 </li><li>ビーズを抗体溶液に再懸濁し、室温で20分間、ローテーター（少量の混合を確実にするためにエンドオーバーエンド）でインキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させる。 </li><li>チューブを磁石の上に置き、抗体溶液を吸引する。 </li><li> 200μLのPBSTで1回抗体結合ビーズをすすぎ、洗浄バッファーを除去する。 </li><li> 0.6-1mLの組織溶解物をビーズに加え、穏やかなピペットで混合し、冷たい部屋の回転器で3時間インキュベートする。 </li><li>チューブを磁石の上に置き、溶解物を除去し、200μLのPBSTでビーズを5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、ビーズを100μlで収集し、6; LのPBS（Tween-20無し）で清潔な新しいチューブに移す。チューブをマグネットの上に置きます。 </li><li> PBSを吸引し、100μLの非還元サンプル緩衝液を加える。 50μLを除去し、2-ME（5％）を加えて還元サンプルを作製する。試料を95℃で5分間加熱する。 </li><li>磁石上のビーズからip分画を分離し、新しいチューブに集める。 </li><li>分析まで-20℃でサンプルを保存する。 </li></ol>質量分析のためのIFタンパク質試料の調製<ol><li>質量分析の分析には時間とコストがかかりますので、研究を開始する前にプロテオミクスの専門家に相談してください。 </li><li>汚染を避けるために特別な注意を払ってください。きれいな手袋ですべてのゲルを取り扱い、清潔な容器でインキュベートし、ddH 2 O（石鹸を避ける）のみを用いて洗浄する。 </li><li>標準条件に従ってSDS-PAGEゲル上で20〜50μLのHSEサンプル（セクション4および5から）を流してください。 </li&gt; <li>タンパク質染色で1時間染色する。複数回すすぎ、ddH 2 Oで一晩脱脂する。 IFタンパク質バンドは脱染色後に容易に見えるはずである。 </li><li>ゲルをプラスチック製のシートプロテクターの間に置き、分析のために切除して送るバンドをスキャンしてマークします。 </li><li>新しいきれいなかみそりを使用してIFタンパク質バンドを切り出します。 </li><li>ゲルバンドを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、質量分析装置に移す。 </li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

IFタンパク質が細胞および組織ストレスのマーカーおよびモジュレーターの両方であるため、IFタンパク質の生化学的特徴付けを可能にする方法は、哺乳類系における多数の病態生理学的現象を理解するのに有用であり得る。現在の方法の背後にある原則は、一般に低塩類溶液および高塩溶液を使用する細胞および組織からIFタンパク質を単離し、分離し、再構成するための1970年代および1980?...

<html> I型IVは、細胞質（ 例えば、上皮および毛ケラチン（K）、筋細胞デスミン、神経フィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、および他のタイプの細胞質タンパク質である。その他）;タイプVは核ラミンであり;タイプVIはアイレンズ1の IFである。それらの分子構成に関して、IFタンパク質は、高度に保存されたコイルドコイル「ロッド」ドメインおよび球状の「頭部」および「尾部」ドメインの3つの共通ドメインを有する。 IFタンパク質四量体は、機械的保護2 、ストレス感知3,4 、転写5および成長の調節、ならびに他の重要な細胞機能に関与する動的細胞骨格および核骨格構造を形成する成熟フィラメントに最終的に組み込まれる短いフィラメント前駆体を形成するように集合する&quot; 1,6,7 。 IFシステムの機能的重要性は、ニューロパシー、ミオパチー、皮膚脆弱性障害、代謝機能不全および早期老化症候群を含むIF遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる多くのヒト疾患の存在によって強調される8 。いくつかのIF遺伝子突然変異は、肝疾患9の単純な上皮ケラチンのような疾患の進行を引き起こさないが、そのキャリアを素因とする9 。後者は、上皮におけるIFの重要なストレス保護機能によるものである。 IFは一般に、基底条件下で最も豊富な細胞タンパク質の中に含まれていますが、様々なタイプのストレスの間にさらに強く誘導されます10 。例えば、線虫C.elegansのプロテオーム全体の変化を評価した最近の研究では、複数のIFが高度に上方制御され、凝集しやすいことが示された生物老化中に11,12。適切なIF構造の維持は、様々な形態のストレスに対する細胞の抵抗性にとって必須であるため、IF凝集はまた、老化中の機能低下に寄与し得る。しかしながら、ストレスを受けている異なる組織にわたって複数の哺乳動物IFタンパク質を試験する生物学的レベルの研究は欠けている。 IFは、細胞の要求を満たすために適応する高度に動的な構造である。ケラチンは、例えば、可溶性（非糸状）および不溶性（糸状）タンパク質プール13間の生合成に依存しないサイクリングを受ける。通常の生理学的条件下では、非イオン性界面活性剤Nonidet P-40に可溶化することができる約20％と比較して、洗浄剤を含まない緩衝液中で全K8 / K18プールの約5％を抽出することができ、 X100 14 、 </s&gt; 15 。有糸分裂の間に、表皮ケラチンではあまり明らかではないが、ビメンチンおよび他のIII型IFタンパク質においてより明白である単純型上皮K8およびK18 14の溶解性が顕著に増加する15,16 。 IFタンパク質の溶解特性は、フィラメント再配列および溶解性のための重要な翻訳後修飾（PTM）であるリン酸化によって厳密に制御されている17,18,19,20。ほとんどのIFは、保存された部位で多数のPTMによって広範な調節を受け、機能的変化をもたらす17 。 この方法の目的は、複数のマウス組織にわたるIFタンパク質の研究のための生化学的抽出および分析方法に、IF分野の新しい研究者を紹介することである。特定我々は、高塩抽出法を用いたIFタンパク質の単離と、質量分光法およびPTM標的抗体によるPTMの変化の評価に焦点を当てている。これらの方法は以前に公表された手順21に基づいているが、異なるIFタンパク質型を抽出するための改変を含み、IFファミリーにわたる調節のための共通機構を明らかにする。例えば、特定のリジン残基でのK8アセチル化はフィラメントの組織化を制御するが、高アセチル化はK8不溶性および凝集体形成を促進する22 。最近の世界のプロテオミクスプロファイリング研究は、ほとんどの組織特異的IFタンパク質もまたアセチル化の標的であり、ほとんどのIFアセチル化部位が高度に保存されたロッドドメインに限定されることをさらに明らかにした。これにより、IFシステムのグローバルプロファイリングに適したメソッドの必要性が強調されます。我々はまた、optiでの自動ホモジナイゼーションを用いて複数の組織からIFタンパク質を単離する迅速な方法を紹介する溶解した溶解マトリックス。得られた調製物は、質量分析および他の方法による下流のPTM分析に適している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

中間フィラメント（IF）は、アクチンフィラメントおよび微小管とともに、細胞骨格 - 各細胞の重要な構造要素 - を形成する。正常に機能するIFは細胞に機械的およびストレス回復性を与え、機能不全のIF細胞骨格は細胞の健康を損ない、多くのヒト疾患と関連している。翻訳後修飾（PTM）は、生理学的変化およびストレス条件下でIF動態を決定的に調節する。したがって、IFのPTMシグネチャーにおける変化をモニターする能力は、細胞傷害の間のストレス応答因子としてのIFシステムのより良好な機能的理解、および最終的な調整に寄与し得る。しかし、70を超える個々の遺伝子によってコードされ、組織依存的に発現される多数のIFタンパク質は、異なるPTMの相対的重要性を分類する際の大きな課題である。この目的のために、IFタンパク質上のPTMのモニタリングを可能にする方法孤立した家族のためではなく、生物全体のレベルで、この分野における研究の進展を加速させる可能性があります。ここでは、9種類のマウス組織（脳、心臓、肺、肝臓、小腸、大腸、膵臓、腎臓、および腎臓）からのIFタンパク質の総、洗浄剤可溶性および界面活性剤耐性画分の単離のための生化学的方法を提示する。脾臓）。我々はさらに、異なるマウス組織の溶解マトリックスおよび自動化されたホモジナイゼーションを用いて、IFタンパク質の迅速な単離のための最適化されたプロトコールを実証する。自動化されたプロトコルは、（複数の動物および実験群を含む疾患モデルにおけるような）高試料量の実験でIFをプロファイリングするのに有用である。得られたサンプルは、質量分析に基づくPTMプロファイリングを含む様々な下流分析に利用することができる。これらの方法を利用して、我々は、異なるマウス組織（脳および肝臓）におけるIFタンパク質がそれらの発現に関して並行して変化することを示すための新しいデータを提供する老化中のシオンレベルおよびPTMを減少させる。

溶解マトリックスを用いた複数のマウス組織からのIFタンパク質の高塩ベース抽出のための新しい高速方法。 上皮組織からの中間フィラメントタンパク質画分の大部分を単離する従来の方法25,26 は、ここでは9つの異なる器官および組織溶解のためのより...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

isolation-intermediate-filament-proteins-from-multiple-mouse-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。 

ビデオ: Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

生化学

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They allow the analysis of the intrinsic properties of microtubules, such as dynamics, and their interactions with microtubule-associated proteins (MAPs). The &#8220;tubulin code&#8221; is an emerging concept that points to different tubulin isotypes and various posttranslational modifications (PTMs) as regulators of microtubule properties and functions. To explore the molecular mechanisms of the tubulin code, it is crucial to perform in vitro reconstitution experiments using purified tubulin with specific isotypes and PTMs.
To date, this was technically challenging as brain tubulin, which is widely used in in vitro experiments, harbors many PTMs and has a defined isotype composition. Hence, we developed this protocol to purify tubulin from different sources and with different isotype compositions and controlled PTMs, using the classical approach of polymerization and depolymerization cycles. Compared to existing methods based on affinity purification, this approach yields pure, polymerization-competent tubulin, as tubulin resistant to polymerization or depolymerization is discarded during the successive purification steps.
We describe the purification of tubulin from cell lines, grown either in suspension or as adherent cultures, and from single mouse brains. The method first describes the generation of cell mass in both suspension and adherent settings, the lysis step, followed by the successive stages of tubulin purification by polymerization-depolymerization cycles. Our method yields tubulin that can be used in experiments addressing the impact of the tubulin code on the intrinsic properties of microtubules and microtubule interactions with associated proteins.

This protocol describes tubulin purification from small/medium-scale sources such as cultured cells or single mouse brains, using polymerization and depolymerization cycles. The purified tubulin is enriched in specific isotypes or has specific posttranslational modifications and can be used in in vitro reconstitution assays to study microtubule dynamics and interactions.

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...