このプロトコルは、異なる組織とポイント間のタンパク質発現を見て、基礎的および臨床研究における重要な問題に対処するために使用することができます。信頼性の高い定量的なウエスタンブロッティングを行うために、蛍光全タンパク質染色と内部ローディングコントロールを組み合わせています。これは、実験条件間で様々な組織を比較するときに生じる限界を克服します。
スナップ凍結細胞または組織サンプルからタンパク質を抽出するには、必要に応じてサンプルを洗浄する前に氷上のマイナス80度サンプルを解凍します。ポリプロピレンの害虫を使用してハンドヘルド電気ホモジナイザーを使用して、洗浄されたサンプルを均質化し、二重蒸留水で害虫を洗い流し、サンプル間のきれいな組織で乾燥させます。サンプルを氷の上に10分間放置し、その後遠心分離します。
次に、タンパク質サンプル含有上清をペレットを邪魔することなく、氷上の新しいチューブに移します。タンパク質濃度を定量化するために、3重化中の濃度を増加させると牛血清アルブミン標準を設定し、各タンパク質サンプルの1マイクロリットルを重複して96ウェル光学プレートの適切なウェルに追加します。タンパク質濃度が低いと予想される場合は、60°Cの熱ブロックでタンパク質を10分以上インキュベートし、プレートリーダー上の560ナノメートルで吸収を測定します。
プレートリーダーの測定値をエクスポートし、各サンプルの平均吸光度値をタンパク質標準を使用して得られた標準曲線と比較して、タンパク質濃度を計算します。タンパク質の量を正常化するには、サンプルバッファーと超純水中のタンパク質サンプルの希釈液を調製し、70°Cの熱ブロックでサンプルを10分間インキュベートします。次に、渦を巻き、一時的に遠心分離する前に、サンプルを氷の上に置きます。
電気泳動の場合、ゲル電気泳動チャンバシステムに4~12%のBis-Tris勾配ゲルをプレキャストし、タンパク質標準物の3.5マイクロリットルをウェルにロードします。膜間正規化の内部標準を使用する場合は、他のサンプルと同等の量をタンパク質ラダーの隣の最初の3つのウェルにロードし、各サンプルの30マイクログラムを残りのウェルにロードします。その後、サンプルを80ボルトで10分間実行し、さらに45〜60分間150ボルトを実行します。
電気泳動の終わりに、転写スタックを組み立てるには、ポリビニリデンジフルオリド膜を含む底面スタック上にプロテインゲルを置き、その後ろろをろ紙に置く。ブロッティングローラーを使用して気泡を取り除き、上部のスタックをフィルターペーパーの上に置いてから、もう一度スタックを転がして気泡を取り除きます。デバイスの左側にある電極を使用して、スタック全体を転送デバイスに転送し、スポンジがデバイス上の対応する電気接点に合うように、ゲルスポンジをスタックの上に置きます。
蓋を閉じた後、適切なプログラムを選択して起動します。プログラムの最後に、膜をゲルサイズにカットし、切断された膜を二重蒸留水で素早く洗ってから、タンパク質の全汚れを継続します。全タンパク質染色の場合は、膜をタンパク質側を内側に向けた50ミリリットルチューブに転がし、ヒュームフードの室温で5分間ローラーに5ミリリットルのタンパク質汚れ溶液を付けて膜にラベルを付けます。
インキュベーションの終わりに、洗浄液の5ミリリットルで素早く膜を洗い、チューブを洗浄の間のローラーに短時間戻し、続いて超純水で短いすすがします。3ミリリットルのブロッキングバッファーを膜に加え、室温で30分間ローラーに戻します。適切な最適化された濃度で目的の一次抗体とブロッキングバッファーを交換し、一晩4°Cでローラー上の膜をインキュベートします。
翌日、室温でローラーに洗浄1回5ミリリットルの新鮮なPBSで5分間膜を6回洗浄します。最後の洗浄後、ローラ上の適切な二次抗体溶液を用いて膜を室温で1時間培養し、洗浄ごとに30分間3回洗浄します。最後の洗浄後、膜を乾燥させ、アルミニウム箔を使用して膜を光から保護します。
画像取得のために、タンパク質側を下に向けてスキャナー上に膜を置き、ソフトウェア内のスキャン領域を選択します。そして、両方のチャンネルの画像を取得し、適切な画像解析プログラムにエクスポートします。700ナノメートルのチャンネルを表示して、タンパク質染色結果の合計を表示し、正規化の対象領域を定義する[解析と矩形を描画]を選択します。
次に、最初の長方形領域をコピーして個々のサンプルに貼り付け、定義された領域が解析されたすべてのレーンで同じサイズであることを確認します。各レーンのタンパク質濃度を定量化するには、合計タンパク質染色と目的のタンパク質の両方の結果をスプレッドシートプログラムにコピーし、最大の全タンパク質染色シグナルを決定します。次に、各タンパク質染色シグナル値をこの値で割って、正規化されたタンパク質負荷値を求め、各個体のシグナル値を対応する正規化されたタンパク質値で割って、異なるサンプルにおける相対的なタンパク質発現率を算出した。
これらの代表的なウエスタンブロットでは、5日目の出生後5日目から得られた組織から抽出されたタンパク質が、10週齢の成体マウスから抽出されたタンパク質と比較される。全タンパク質染色の蛍光強度の定量は、各レーン上の長方形ボックス内の蛍光強度を測定することによって達成された。レーン全体を解析する場合、蛍光強度はサンプル間で比較的類似したままであり、全タンパク質染色を正規化に使用することがこの目的に適していることを示しています。
蛍光総タンパク質染色は、異なる発達時のタンパク質レベルを比較するためにも使用できます。例えば、生存運動ニューロンタンパク質レベルはマウスの年齢とともに明らかに減少するが、全タンパク質染色定量は一定のままである。内部標準、蛍光ベースの正規化、および適切な統計を使用すると、さまざまな条件にわたる複雑なタンパク質発現解析の堅牢性が向上します。
このプロトコルは、従来のウェスタンブロット技術を追加し、実験バッチ間で適切なローディング制御と比較の問題を克服し、タンパク質発現解析のための柔軟性を提供します。このアプローチは、他の実験条件下でのタンパク質発現の比較まで拡張することができる。
