この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（SDサポート）、防衛省のW81XWH-15-1-0472（KMS）、Bertarelli財団（KMS）、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）などがあります。 Jessica E. Sagers氏に感謝の意を表します。

この研究プロトコールは、マサチューセッツ州の眼および耳の施設動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認された。実験は世界医師会の倫理規定に従って実施された。 1.解剖の準備<ol><li> 手術テーブルの準備 <ol><li> 70％エタノールを使用して外科用テーブルを消毒する。 </li><li> 2つの非滅菌準備パッドを顕微鏡の隣に置きます。 </li><li>熱殺菌した手術用ハサミ、メスハンドル、マイクロナイフ、鉗子（＃4と＃55の2つずつ）を含む計器トレイを準備します。器具トレイと50mmの透明壁のガラス底ペトリ皿を1つの非滅菌パッドに置きます。 </li><li>無菌の＃15メス刃を得る。密封可能なプラスチック製の袋または容器（制度上のガイドラインに沿って死体を処分するため）。バケツの氷;冷たい滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む。これらのアイテムを他の非滅菌パッド。 </li><li> HBSSを50 mLのプラスチック試験管に移し、氷上に置きます。 </li></ol></li><li> 文化の準備 <ol><li>すべての材料を層流フードで準備する。 4つの標本ごとに、35mm4ウェルペトリ皿の4つのインレーに4つのオートクレーブ処理した10mmの丸いガラスカバースリップを入れる。 </li><li> 4つの標本ごとに、以下のものからなる300μLの全量を微量遠心チューブに混合する：組織接着剤10μL、NaHCO 3285μLおよびNaOH5μL。 </li><li>得られた溶液45μLをすべてのカバースリップに入れ、室温で少なくとも20分間放置する。この溶液は数時間カバースリップ上に放置することができるが、O / Nを放置することはできない。 </li><li>コンタミネーションに対する2つの障壁を作り出すために、1つまたは2つの35mm 4穴ペトリ皿を10cmのペトリ皿の中に置きます。 </li><li> 98％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％N-2、および1％アンピシリン（（マイクロ）遠心分離管内で1ウェルあたり65μL）で洗浄した。使用前に25℃に加温してください。 </li></ol></li></ol> 2.マウスの蝸牛外植片の解剖<ol><li> 新生児マウスの断頭 <ol><li> 60 mmのプラスチックペトリ皿を用意し、蓋に70％エタノールをスプレーして、表面が濡れるようにします。 </li><li>冷たいHBSSをプラスチック製の実験室チューブから60mmのプラスチックの底部と50mmの透明なガラス底のペトリ皿に注ぎます。解剖されていないときはいつでも組織を冷たく保つために、プラスチック実験室管と両方のペトリ皿を氷上に保管してください。 </li><li> P3-P5歳の新生児マウスをラテックス手袋の切れた指の氷上に置き、低体温が意識消失（約1〜3分）を引き起こすまで待つ。 </li><li>操作はさみでマウスをすばやく断頭し、シール可能なビニール袋に体を処分する。切断された新生児の頭を60mmのプラスチックシャーレの蓋の中の70％エタノール。 </li></ol></li><li> 側頭骨の巨視的切開 <ol><li>メスの刃を使用して、前端から後端（矢状縫合の上に直接）から表面切開を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を除去する。 </li><li>外耳道の両方をメスの刃で切って、皮膚を前方に折り畳んで頭蓋全体を露出させます。 注：このステップには通常、解剖顕微鏡は必要ありませんが、視覚化を改善するために使用することができます。 </li><li> ＃15メス刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。蝸牛の圧迫を避けるために、刃を前方から後方へ静かに上下に動かして頭蓋を切断してください。 注：頭蓋骨はこの年齢で骨化してはならず、簡単に切るべきです。 </li><li> ＃15メスを使用して、軌道の直後の垂直カットを作成して、スナウトを取り出して破棄します刃。 注：頭蓋骨の後部にはまだ脳と蝸牛が含まれているはずです。 </li><li> ＃4鉗子で鈍的切開を行い、前脳、小脳、および脳幹を処分する。 </li></ol></li><li> 蝸牛の微視的抽出 <ol><li>スコープの下に鉗子を置き、照明と焦点を最適化することによって顕微鏡（倍率6.5倍）と光源を調整します。 </li><li>冷たいHBSSで満たされた60mmプラスチックペトリ皿に頭蓋の2つの半分を置きます。 </li><li>周囲の静脈動脈（側頭骨内の曲がりくねった動脈）に隣接していると同定できる蝸牛/ eを完全に露出させ、＃4の鉗子を用いて臓器を側頭骨から鈍く分離する。 </li><li>蝸牛を50mmの透明なガラス底のペトリ皿に移し、顕微鏡の下に置く。 </li><li>氷上に頭蓋の他の半分と60ミリメートルのプラスチックシャーレを置きます。 </&gt; <li>蝸牛を前庭系から取り出し、＃4の鉗子で蝸牛耳の嚢（典型的には軟骨性）を慎重に切開する。それ以降のすべてのステップで＃55鉗子を使用してください。 </li></ol></li><li> 組織処理の最終ステップ <ol><li>マイクロナイフまたは2つの鉗子を用いて、コルチ器官に付着した螺旋靭帯を残りの蝸牛および神経節から注意深く分離することにより、内耳組織の処理を続ける。 <ol><li>螺旋靭帯と有毛細胞領域との間の隙間のより暗くて半透明な領域に切断し、螺旋靭帯を最も基本的な側面で把握し、尖った方向に動いている間にゆるやかに引き離すことに続く。 </li></ol></li><li>検体を配置して、蝸牛の長手方向矢状図を取得し、マイクロナイフを用いて蝸牛を2〜3つの切片に切断し、これらの切片を頂端、（中央、）およびbアナルターン。ペトリ皿に水平に横たわることができる蝸牛外植片を達成するために、有毛細胞および神経突起の実際の層と上および下組織を除去する。 注記：培養皿への安定した接着のための適切なサイズは、1つの蝸牛ターンの約半分である。 </li><li>腹膜を静かに剥がして、コルチ器官のすぐ上の非常に薄い半透明の層である房膜を取り除く。 </li><li> Reissnerの膜をすぐにSGNよりも優れたものにし、両側に鉗子で触れ、剥がしてください。 注：横に位置する損傷した有毛細胞領域をマイクロナイフで切り取って取り除きます。 </li></ol></li></ol> 3.検体の培養プレートへの移送<ol><li> 4つのカバースリップから45μLの組織接着剤溶液を除去する。各カバースリップを50μLの滅菌H 2 Oで洗浄する。水を吸引する。 </li><li> 1 mLのピペットを拾います。試料がチップの内側に付着しないように、約120μLのDMEMでピペットチップを濡らします。 </li><li> 1 mLピペットを用いて検体を個別に移す。 HBSSで満たされた、小さくて透明なガラス底のペトリ皿から最大70μLをピペットで取り、4ウェルのペトリ皿に4つのインレイ（カバースリップで調製）の1つに液体と共に試料を置く。 </li><li> 標本の向きが正しいことを顕微鏡（倍率50倍）で確認します。胸膜が除去された有毛細胞の領域が上向きであることを確認する。モディベラのトリムされた基底部分と一緒に、基底膜が下向きになり、カバースリップに付着することを確認する。 <ol><li>標本が検査の際に上下逆さまになっている場合は、ピペットチップに残っているHBSSをインレイに入れ、正しい方向になるまでピースの位置を変えます。 NOTE：これは、退化につながる可能性のあるカバースリップからの構造的支持なしに有毛細胞が培地中に浮遊することを防止する。 </li></ol></li><li> 1 mLピペットを使用して過剰のHBSSを吸引する。 15秒待ちます。 </li><li>調製した暖かい培地（98％DMEM、1％N-2、および1％アンピシリン）60μLを検体に直接ピペットで加える。ピペットで検体に触れないように注意してください。内側および外側のペトリ皿カバーを交換し、37℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>すべてのストック溶液を適切な場所に戻し、死骸や残留廃棄物を処分し、施設ガイドライン（ 例えば、エタノールや次亜塩素酸塩を使用して）に従って手術テーブルを除染し、器具をきれいにしてオートクレーブし、 。 </li></ol> 4.最終的な培養培地および対象物質の追加注：蝸牛外植片は、10-16時間後に使用する準備ができている。 <ol><li>混合物を準備する97％DMEM、1％ウシ胎児血清（FBS）、1％N-2、および1％アンピシリン（マイクロ遠心管内のウェルあたり65μL;使用前に溶液を25℃に暖める）。 </li><li>該当する他の物質を、それぞれの治療グループのソリューションに追加します。蛍光物質（ 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現ウイルス;最近の発表では、10 10 GCのアデノ関連ウイルス（AAV）を50μL中48時間使用した） 18 、光。 </li><li>孵卵器から蝸牛外植片を含むペトリ皿を移し、層流フードの下に置く。 </li><li>インレーからのピペットで古い培地（FBS無し）を吸引する。 </li><li>調製した温かい培養（処理）培地（97％DMEM、1％FBS、1％N-2,1％アンピシリン、および対象物質）1ウェルあたり60μLを添加する。 </li><li>ペトリ皿をインキュベーター（37℃）に戻します。 </li><li>ビューr細胞の移動、または蝸牛外植片の剥離の兆候を同定し、最大7日後に染色を実施するために、顕微鏡下で公式に観察する。 </li></ol> 5.免疫蛍光 - 1日目<ol><li>ブロッキング溶液（94％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5％正常ヤギまたはウマ血清（2次抗体に応じてNGS / NHS）、および1％非イオン性界面活性剤（ 表の表を参照 ） （98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤をそれぞれの抗体とともに含む）で洗浄した。 注：抗体には、1：400+（ミオシン7A、内外の有毛細胞用）およびマウス抗TuJ1 1：200+（β-チューブリン、SGN用）またはマウス（IgG1）抗マウス抗体（後シナプス密度）、およびニワトリ抗NF-H1：1000 +（ニューロフィラメント（neurofilament））、抗マウスモノクローナル抗体SGNおよび神経線維の場合）。 &quot;+&quot; means &quot;以上である必要があります。 </li><li>ピペットを用いて培地を吸引する。検体に触れないように注意してください。 </li><li>層流フードの下で、滅菌PBSで蝸牛外植片を2回すすぎ、各洗浄後に5分間シェイカー上に検体を置く。 </li><li>シェーカー（フードの下）で20分間4％パラホルムアルデヒド（PFA - CAUTION）に組織を固定する。 PFAを吸引する。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>蝸牛外植片を、シェーカー上で30分間、調製したブロッキング溶液（94％PBS、5％NHS、および1％非イオン性界面活性剤）中に置く。 </li><li>蝸牛外植片をRTでのカウンター上の対応する一次抗体（使用前にボルテックス）O / Nを用いて調製ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）に入れる。 注：ペトリ皿をプラスチック製のラップ（またはアルミ箔）で囲まれた湿ったペーパータオルで包みますGFPを発現するウイルスなどの蛍光物質を含む）を含み、皿を湿潤に保ち、抗体溶液O / Nの蒸発を防止する。 </li></ol> 6.免疫蛍光 - 2日目<ol><li>ステップ5.1で4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色（300nM）を調製し、ストック抗体溶液を使用して一次抗体に相補的な正しい二次抗体混合物を得る。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギ488 1：200+およびヤギ抗マウス568 1：200+ ORヤギ抗マウス（IgG1）568 1：1000+、ヤギ抗マウス（IgG2a）488 1：500+、およびヤギ抗ニワトリ647 1：200+またはファロイジン568 1：200+（内外の有毛細胞用））。 </li><li>一次抗体溶液を吸引する。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>蝸牛外植片を準備ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）にres（使用前にボルテックス）をカウンターで1.5時間インキュベートし、光から保護する。 </li><li>二次抗体溶液を吸引し、DAPI染色液（シェーカー上に1分間置いてから吸引する）で蝸牛外植片をすすいでください。 </li><li> 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。 </li><li>鉗子を使用して、4ウェルプレートから検体を含むカバーガラスを取り出し、蒸留水で満たされたレシピエントにそれらを浸し、ペーパータオルに垂直に接触させてカバースリップを乾燥させる。 </li><li>顕微鏡スライド上に曇り止め装着媒体の一滴を置き、カバースリップを反転させて、下向きの組織を培地に浸す。 </li><li>周りを覆って透明なマニキュアを使用してカバースリップをシールします（ガラスの下に試料を押しつぶすことなく）。乾燥した状態となるまで15〜20分間明かりから覆った部分にスライドを平らにしておきますそれらを箱に入れたり、共焦点顕微鏡の下で検査したりしてください。 注：蛍光染色は、スライドを4℃または-20℃で保存することで最もよく保存されます。 </li></ol> 7.共焦点イメージング<ol><li>神経突起およびSGNを含むCorti地域の器官の概要およびズームイン画像を取得します。 注：イメージングプロセスの標準設定：1,024×1,024ピクセル、400Hzの速度、フレーム平均3、20％の総合レーザー強度、通常20倍および63倍の油浸漬（潜在的に2倍デジタルズームと組み合わせる）。 405 5％DAPI、 &quot;スマートゲイン&quot; 766.8V、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％〜488 15％のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、 &quot;スマートゲイン&quot; 622.2VのDAPI、Myo7A、およびTuJ1染色プロトコルのチャンネル設定が概説されています。 、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％ - 561 13％テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、 &quot;スマートゲイン&quot; 562.4V、 &quot;スマートオフセット&quot; 0.0％。 </li><li>画像をZスタックにマージするには、ソフトウェアを使用してz軸投影を得る。 </li></ol>

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Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

研究者は、蝸牛外植物を含む実験を行う前に解剖技術を完璧にしなければならない。有毛細胞は、学習曲線の早期に行われる解剖の間に一般的に損傷を受け、その完全性のための特に問題のある瞬間は、安定した手、適切な道具および経験を必要とする体膜の除去である。時間と資源を節約するために、解剖顕微鏡の下で視覚制御を行うべきであり、潜在的に損傷した領域に注目すべきであ?...

感音神経障害（SNHL）は、内耳または上行する聴覚経路への損傷を反映する。難聴はヒトの最も一般的な感覚障害であるが、治癒療法はまだ存在していない2 。蝸牛や聴覚の脳幹インプラントは、重度から重度のSNHLの患者にある程度の聴覚を回復することができますが、これらの装置で提供される聴力は、特に聴覚の発声を理解したり、音楽を聴いたりする試みにおいて、 毛細血管変性は長い間、外傷性聴覚事象（ 例えば、大きな騒音への曝露）の主な結果と考えられているが、有毛細胞から聴神経へ情報を伝達するシナプスは少なくとも音響外傷3 と同様に脆弱であるという証拠が増えている3 、 4,5 </sup<html> &gt; 、 6 。聴覚機能の評価のための現行の金標準である人間の聴力検査閾値は、内耳の特定の細胞損傷を予測しないので、細胞変性をできるだけ早期に検出し、適切な治療を開始するためにより洗練されたツールが必要です。 難聴のための有望な薬学的治療は、しばしば、インビトロでの均一な細胞培養物について試験されるが、このようなシステムは、蝸牛の微小環境を正確にモデル化しない。蝸牛細胞は、Corti 10,11またはSpiral Ganglion Neurons（SGN） 12の臓器を単離培養したときに失われる重要なインビボ過程である蝸牛8,9内の他の細胞型に影響を及ぼす栄養因子を分泌することが知られている分子マーカーを分析するしかしながら、「精密医学」の追求において、難聴のための新たなパーソナライズされた治療法を確立するためのインビトロデータの検証に必要であり得るインビボ研究は、かなりの資源と時間を必要とする。聴力検査とその後の蝸牛全体装着の中耳または円形窓膜注入を完璧に行うためにどれだけの労力が必要ですか？蝸牛外植体として知られている器官型ex vivo培養物の有望な化合物の効率的なスクリーニングは、 14,15,16,17 。 この記事では、治療された蝸牛外植片を生成、維持、評価するためのプロトコルについて詳述します。スクリーニングでの使用を含むこのモデルの特定のアプリケーションが強調されています遺伝子治療のためのウイルスベクターの比較評価を含む。 エクスビボでの外植片アプローチにより、研究者は、異なるタイプの細胞集団に対する所定の治療の効果を現場で視覚化し、細胞型特異的機構の同定およびその後の標的化治療の洗練を容易にすることができる。 全体的に、この技術は、蝸牛内に共存する非常に異なる細胞タイプ間の重要なクロストークを維持しながら、 生体外で蝸牛を研究するモデルを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin, Sodium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11593-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NF-H antibody, chicken</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td>
			<td>Antibodies Inc.</td>
			<td>75-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100x20 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35x10 mm, four inner rings</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&#174;, Sleeve/20, 50x7 mm</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14027-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230-162&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437-028&#160;</td>
			<td>Aliquot in 50 ml tubes and store in -20&#176;C freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate - GlutaMAX supplement, 100 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TMS-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td>
			<td>Mountainside Medical</td>
			<td>TechMed4255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro (dissecting) knife &#8211; angled 30&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&#34;), 1 mm thick, white, pack of 72</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X), 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, 500 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prep Pad, Non Sterile&#160;</td>
			<td>Medline</td>
			<td>05136CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363719</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td>Autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #15</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>000000-1106-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>T756.30.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper Bag, Reclosable, 4&#39;&#39; x 6&#39;&#39; - 2 mil. thick</td>
			<td>Zipline</td>
			<td>0609132541599</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

過去数十年間にわたり聴覚研究において顕著な進歩があったが、内耳の繊細な機械感覚構造の損傷または喪失を典型的に伴う状態である感音神経難聴（SNHL）の治療法はまだない。近年、精巧なin vitroおよびex vivoアッセイが出現しており、SNHLの治療法を開発するためのリソースを最小限に抑えながら、潜在的治療化合物のスクリーニングを可能にしています。特定の細胞型の均質な培養物が現在の研究において重要な役割を果たし続けているにもかかわらず、多くの科学者は現在、蝸牛外植片としても知られているより複雑な器官型の内耳細胞培養に頼っています。内耳内の組織化された細胞構造の保存は、内外の有毛細胞、らせん状神経節ニューロン、神経細胞を含む蝸牛インフルエンザの様々な成分のin situ評価を容易にするites、および支持細胞。ここでは、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置、および免疫染色を提示する。これらの外植片の注意深い準備は、SNHLに寄与する機構の同定を容易にし、聴覚研究共同体にとって貴重なツールとなる。

多くのプロトコルがCorti外植片の器官に焦点を当てていますが、この技法はSGNを含む蝸牛ターン全体の解剖学的構造を保存しようとします。これにより、研究者は、Cortiの器官に加えて、SGNの神経突起および体細胞に対する所与の治療の効果を分析する機会を得ることができる。ここに記載されているように、モディオラスの一部を保存する解剖を行うことは、コルチ...

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聴覚研究における体外スクリーニングツールとしての新生児マウス蝸牛外植片技術 |医学 |ビデオ

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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17.4K ビュー.  Massachusetts Eye and Ear. このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。 

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Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

IMAPのテストバッテリー：リスニングの意味を理解する

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

医学

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

そのような自閉症や統合失調症のような一般的な疾患でのde novo変異を同定するための戦略

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental insults that disturb placenta development or function can cause early pregnancy loss in mice and humans. Nevertheless, simple in vitro assays to screen for potential effects on placenta formation are lacking. Here, we focus on modeling the first and critical step in placenta formation, which consists of the attachment of the allantois to the chorion. We describe a method to rapidly assess the attachment of allantoic explants on immobilized &#945;4&#946;1 integrin, which serves as a chorio-mimetic substrate.This in vitro approach enables a qualitative evaluation of the attachment and spreading behavior of multiple allantois explants at different consecutive time points. The protocol may be used to investigate the effect of targeted mouse mutations, drugs, or various environmental factors that have been linked to pregnancy complications or fetal loss on allantois attachment ex vivo.

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

We describe an in vitro assay to model chorioallantoic attachment, the first step in placenta formation. The protocol demonstrates the dissection and explant culture of murine allantoides on immobilized &#945;4&#946;1 integrin. Allantois attachment is evaluated microscopically at pre-determined time points.

郭清と尿の添付ファイルのIn Vitro解析マウス尿膜の培養

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression (TRD). VNS exhibits antidepressive and stabilizing effects. This method is particularly useful as a long-term treatment, in which up to two-thirds of patients respond. The vagus nerve stimulator is positioned on the left vagus nerve during a surgical procedure and is activated telemetrically by a wand connected to a handheld computerized device. The treating physician can perform various adjustments of the vagus nerve stimulator during in-office visits (e.g., by modifying stimulation intensity or stimulation frequency) to achieve maximum therapeutic effects with low side effects. Set-up of the device usually takes several months. Typical side effects include wound infection, temporary salivation, coughing, paralysis of the vocal cords, bradycardia, or even asystole. The patient can stop the VNS by placing a magnet over the generator. The current protocol describes delivery of the specific stimulation tool and methods for adjusting the tuning parameters to achieve the best remission rates in patients with TRD.

Vagus nerve stimulation (VNS) has been shown to be effective as an adjunct treatment for treatment-resistant depression (TRD). VNS leads to antidepressive and antisuicidal effects and quality of life improvements. This protocol offers a step-by-step guide to managing and adjusting a vagus nerve stimulator for efficient treatment of TRD.

治療抵抗性うつ病の補助神経ツールとして迷走神経刺激

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining endocochlear potential, ion transport, and fluid balance. Different forms of hearing disorders are reported to involve abnormal microcirculation in the cochlea. Investigation of how cochlear blood flow (CoBF) pathology affects hearing function is challenging due to the lack of feasible interrogation methods and the difficulty in accessing the inner ear. An open vessel-window in the lateral cochlear wall, combined with fluorescence intravital microscopy, has been used for studying CoBF changes in vivo, but mostly in guinea pig and only recently in the mouse. This paper and the associated video describe the open vessel-window method for visualizing blood flow in the mouse cochlea. Details include 1) preparation of the fluorescent-labeled blood cell suspension from mice; 2) construction of an open vessel-window for intravital microscopy in an anesthetized mouse, and 3) measurement of blood flow velocity and volume using an offline recording of the imaging. The method is presented in video format to show how to use the open window approach in mouse to investigate structural and functional changes in the cochlear microcirculation under normal and pathological conditions.

An open vessel-window approach using fluorescent tracers provides sufficient resolution for cochlear blood flow (CoBF) measurement. The method facilitates the study of structural and functional changes in CoBF in mouse under normal and pathological conditions.

開放血管窓と生体内蛍光顕微鏡を用いたマウス蝸牛の心房血流測定

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Performing Intracochlear Electrocochleography During Cochlear Implantation

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation of the ear. These potentials reflect the residual function of the cochlea. In cochlear implant candidates with residual hearing, the implant electrode can directly measure ECochG responses during the implantation process. Various authors have described the ability to monitor the inner ear function by continuous ECochG measurements during the surgery. The measurement of ECochG signals during surgery is not trivial. There are no interpretable signals in up to 20% of cases. For a successful recording, a standardized procedure is recommended to achieve the highest measurement reliability and avoid possible pitfalls. Therefore, seamless collaboration between the CI surgeon and CI technician is key. This video consists of an overview of the system setup and a stepwise procedure of performing intracochlear ECochG measurements during CI surgery. It shows the surgeon's and the CI technician's roles in the process, and how a smooth collaboration between the two is made possible.

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation. In cochlear implant (CI) candidates, such inner ear potentials can be measured directly with the implant electrodes. In this video, we systematically explain how to perform ECochG recordings during CI surgery.

蝸牛移植中の蝸牛内電気蝸牛造影の実施

Electrocochleography (ECochG) measures inner ear potentials generated in response to acoustic stimulation of the ear. These potentials reflect the ...

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar Langendorff over a century ago. Although this technique has been applied to mice over the last 25 years, its use in this species has been limited to adult animals. Development of a successful method to consistently cannulate the neonatal murine aorta would allow for the systematic study of the isolated retrograde perfused heart during a critical period of cardiac development in a genetically modifiable and low-cost species. Modification of the Langendorff preparation enables cannulation and establishment of reperfusion in the neonatal murine heart while minimizing ischemic time. Optimization requires a two-person technique to permit successful cannulation of the newborn mouse aorta using a dissecting microscope and a modified commercially available needle. The use of this approach will reliably establish retrograde perfusion within 3 min. Because the fragility of the neonatal mouse heart and ventricular cavity size prevents direct measurement of intraventricular pressure generated using a balloon, use of a force transducer connected by a suture to the apex of the left ventricle to quantify longitudinal contractile tension is necessary. This method allows investigators to successfully establish an isolated constant-flow retrograde-perfused newborn murine heart preparation, permitting the study of developmental cardiac biology in an ex-vivo manner. Importantly, this model will be a powerful tool to investigate the physiological and pharmacological responses to ischemia-reperfusion in the neonatal heart.

The present protocol describes aortic cannulation and retrograde perfusion of the ex-vivo neonatal murine heart. A two-person strategy, using a dissecting microscope and a blunted small gauge needle, permits reliable cannulation. Quantification of longitudinal contractile tension is achieved using a force transducer connected to the apex of the left ventricle.

ランゲンドルフ調製における新生児マウス心臓の使用のための修正技術

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...