Name: neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research at JoVE.com

Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (SD&#39;yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) tarafından desteklenmiştir. Nancy Sayles Day Vakfı (KMS) ve Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS). Yazı hakkında anlayışlı yorumlar için BA&#39;ya Jessica E. Sagers&#39;e teşekkür ediyoruz.

Çalışma protokolü, Massachusetts Eye and Ear&#39;ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler, Dünya Tıp Birliği Etik Kurallarına göre gerçekleştirildi. 1. Diseksiyonun Hazırlanması <ol><li> Cerrahi masanın hazırlanması <ol><li> Cerrahi masayı dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. </li><li> Mikroskop yanında iki steril olmayan hazırlık yastıkları yerleştirin. </li><li> Isı sterilize edilmiş ameliyat makası, bir bistüri sapı, bir mikro bıçak ve forseps (# 4 &amp; # 55 her biri iki) de dahil olmak üzere alet tablasını hazırlayın. Alet tablasını ve 50 mm&#39;lik, açık cidarlı, cam altı petri kabını steril olmayan bir pedin üzerine koyun. </li><li> Steril # 15 neşter bıçağı elde edin; Mühürlenebilir bir plastik torba veya konteynır (karkaları kurumsal kurallara uygun olarak atmak için); Kova içinde buz; Ve soğuk, steril Hank&#39;in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). Bu maddeleriDiğer steril olmayan ped. </li><li> HBSS&#39;yi 50 mL plastik bir laboratuar tüpüne aktarın ve buz üzerine koyun. </li></ol></li><li> Kültür hazırlama <ol><li> Tüm malzemeleri bir laminer akış davlumbazına hazırlayın. Her dört numune için, dört adet otoklavlanmış 10 mm yuvarlak cam kapak fişini 35 mm&#39;lik 4 oyuklu petri kabının dört girintisine koyun. </li><li> Her 4 numune için, mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakilerden oluşan toplam 300 μL&#39;lik bir hacim karıştırın: 10 μL doku yapıştırıcısı, 285 μL NaHCO 3 ve 5 μL NaOH. </li><li> Elde edilen çözeltinin 45 μL&#39;sini her kaplama kağıdına koyun ve oda sıcaklığında en az 20 dakika bekletin; Bu çözüm birkaç saat boyunca lamel kalmış olabilir ancak O / N bırakılamaz. </li><li> Kirlenmeye karşı iki bariyeri oluşturmak için bir veya iki 35 mm&#39;lik 4 oyuklu petri tabağını 10 cm&#39;lik bir Petri kabının içine yerleştirin. </li><li> % 98 Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir (mikro) santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL) ilave edildi. Çözümü kullanımdan önce 25 ° C&#39;ye ısıtın. </li></ol></li></ol> 2. Murin Koklear Explant Diseksiyonu <ol><li> Yenidoğan faresinin kesilmesi <ol><li> 60 mm plastik petri kabını alın ve yüzeyi ıslak olacak şekilde kapağına% 70 etanol püskürtün. </li><li> Soğuk HBSS&#39;yi plastik laboratuar tüpünden 60 mm plastik ve 50 mm net duvarlı, cam tabanlı petri tabağının alt kısmına dökün. Doku ayrılmadığı zaman soğuk tutmak için plastik laboratuar tüpünü ve her iki petri tabağını da buz üzerinde saklayın. </li><li> Bir lateks eldiveninin bir kesme parmağında buz üzerinde bir P3 - P5 yaşlı yenidoğan faresi yerleştirin ve hipotermi bilinç kaybına neden olana kadar bekleyin (yaklaşık 1-3 dakika). </li><li> Çalıştırma makası ile fare hızla kesilir ve gövdeyi mühürlenebilir plastik torbaya atın. Ayrılan yenidoğan kafasını60 mm plastik petri kapağının kapağında% 70 etanol. </li></ol></li><li> Temporal kemiğin makroskobik diseksiyonu <ol><li> Bıçak bıçağını kullanarak arka ucun önünden (doğrudan sajital dikişin üstünde) yüzeysel bir kesim yaparak kafatasının derisini çıkarın. </li><li> Her iki dış ses kanallarını bisturi bıçağıyla kesin ve craniumun tamamını ortaya çıkarmak için öne katlayın. NOT: Bu adım için genellikle bir diseksiyon mikroskopu gerekli olmasa da, gelişmiş görselleştirme için kullanılabilir. </li><li> # 15 Bıçak bıçağını kullanarak sajital sütür boyunca kafatası açın. Kokleanın sıkıştırılmasını önlemek için, bacıyı anteriordan posteriora hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek kafatasını kesdiğinizden emin olun. NOT: Kafatası o yaşta kemikleşmemelidir ve kolaylıkla kesilmelidir. </li><li> # 15 Dankel iğnesi kullanarak yörüngelere direkt olarak arka arkaya dikey keserek burun çıkarın ve atınBıçak. NOT: Kafatasının arka kısmı hala beyin ve kokleae içermelidir. </li><li> Önbeyin, beyincik ve beyin sapını # 4 forseps ile künt diseksiyon yoluyla atın. </li></ol></li><li> Kochleae&#39;nin mikroskobik ekstraksiyonu <ol><li> Mikroskopı (6.5X büyütme) ve ışık kaynağını, forsepsi kapsamın altına yerleştirerek ve aydınlatmayı ve odaklamayı optimize ederek ayarlayın. </li><li> Kraniumun iki yarısını soğuk HBSS ile dolu 60 mm plastik petri kabına yerleştirin. </li><li> Çevreleyen stapedial artere bitişik olarak bulunan kokleanın / e&#39;nin (temporal kemiğin içinde dolambaçlı bir arter) komple olarak ortaya çıkmasını sağlayın ve organı temporal kemiğe # 4 forseps kullanarak açıkça ayırın. </li><li> Kokleayı 50 mm, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabına aktarın ve çanağı mikroskop altında konumlandırın. </li><li> 60 mm plastik petri kabuğunun diğer yarısı buz üzerine yerleştirilir. </li&gt; <li> Kokleayı vestibüler sistemden çıkarın ve koklear otik kapsülü (tipik olarak bu yaştaki kıkırdaklı) # 4 forsepsle dikkatlice parçalayın. Diğer tüm adımlar için # 55 forseps kullanın. </li></ol></li><li> Doku işleme son adımları <ol><li> İç kulak dokusunun işlenmesine devam etmek için, mikro bıçak veya iki forseps kullanarak, kokleanın geri kalanından ve modiyolustan Corti organına yapışmış spiral ligament dikkatlice ayrılmalıdır. <ol><li> Spiral bağ ve saç hücresi bölgesi arasındaki aralıktaki daha koyu, yarı saydam bölüme doğru kesin ve spiral bağın en temel kısmını kavrayarak ve apikal hareket ederken hafifçe çözerek ilerlemeye devam edin. </li></ol></li><li> Kokleanın uzunlamasına, sagital bir görünümünü elde etmek için numuneyi konumlandırın ve mikro bıçağı kullanarak kokleayı iki ila üç bölüme kesin, bu kısımları apikal (orta,) ve b olarak sınıflandırınAsal dönüyor. Petri kabında yatay olarak yerleşebilen bir koklear eksplant parçası elde etmek için, doku üstünü ve alttaki saç hücrelerinin ve nevrit tabakasını aşağı kaldırın. NOT: Kültür çanağına kararlı yapışma için uygun bir boyut, bir koklear dönüşün yaklaşık yarısı kadardır. </li><li> Cortsi organının hemen üstündeki çok ince bir saydam katman olan ince doku zarını forsepsle hafifçe soyarak çıkarın. </li><li> Reissner&#39;ın membranını, SGN&#39;lerin hemen üstünde, her iki yanında da forsepsle dokunup soyarak çıkarın. NOT: Yanal olarak bulunan hasarlı saç hücresi alanlarını mikro bıçakla keserek çıkarın. </li></ol></li></ol> 3. Örneklerin Kültür Plakalarına Aktarılması <ol><li> Dört kapak fişinden 45 μL doku yapıştırıcı solüsyonu çıkarın. Her kapak kaymasını 50 μL steril H 2 O ile yıkayın. Suyu aspire edin. </li><li> 1 mL&#39;lik pipeti al. Numunenin içerisine yapışmasını önlemek için pipet ucunu yaklaşık 120 μL DMEM ile ıslatın. </li><li> Numuneleri 1 mL pipet kullanarak ayrı ayrı aktarın. HBSS dolu, küçük, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabından azami 70 mcL pipetleyin ve numuneyi, 4-kuyu petri kabında (kapak fişleri ile hazırlanmış) 4 kakmandan birinde sıvı ile birlikte yerleştirin . </li><li> Mikroskop (50X büyütme) altında numunenin doğru yönde olduğunu kontrol edin. Tectorial membranın çıkarıldığı saç hücrelerinin alanının yukarı baktığından emin olun. Baziler membranın, modiyolüsün kesilmiş, bazal kısmı ile birlikte aşağı baktığından ve lameline yapıştığından emin olun. <ol><li> Muayene üzerine numune ters çevrilmişse, pipet ucunda kalmış olan HBSS&#39;yi kılıfın içine yerleştirin ve doğru şekilde yönlendirilene kadar parçayı yeniden konumlandırın. YOK HAYIRTE: Bu, saç hücrelerinin, lamesten yapısal olarak destek almadan kültür ortamında yüzmesini önleyerek dejenerasyona neden olabilir. </li></ol></li><li> 1 mL&#39;lik pipeti kullanarak fazla HBSS&#39;yi aspire edin. 15 saniye bekleyin. </li><li> Hazırlanan sıcak kültür ortamından (% 98 DMEM,% 1 N-2 ve% 1 ampisilin) ​​doğrudan doğruya örnek üzerine pipetleyin. Numuneye pipet ile dokunmamaya dikkat edin. İç ve dış petri kapaklarını değiştirin ve O / N&#39;yi 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Stok çözümlerinin tümünü uygun yerlerine geri koyun, karkasları ve kalıntı atıkları imha edin, cerrahi masayı kurumsal talimatlara ( örn., Etanol veya hipoklorit) göre dezenfekte edin, aletleri temizleyin ve otoklavlayın ve kesikleri uygun kutuda atın . </li></ol> 4. Nihai Kültür Ortamı ve Çıkan Maddeleri Ekleme NOT: Koklear eksplantlar 10-16 saat sonra kullanıma hazır hale gelecektir. <ol><li> Bir karışık hazırla% 1 DMEM,% 1 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir mikro santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL; kullanımdan önce çözeltiyi 25 ° C&#39;ye ısıtın). </li><li> İlgili tedavi gruplarının çözümlerine diğer ilgi maddelerini ekleyin. Floresan maddeler eklenirse ( örneğin, yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eden virüsler; son yayında, 50 μL&#39;de 48 saat boyunca 10 10 GC Adeno-İlişkili Virüsler (AAVs) konsantrasyonu kullanıldı. Işık. </li><li> Kuluçkadan koklear eksplant içeren petri kaplarını aktarın ve bunları laminer akış kaputunun altına yerleştirin. </li><li> Eski kültür ortamını (w / o FBS) pipetlerle kakmalara aspire edin. </li><li> Hazırlanmış sıcak kültür (tedavi) ortamı (% 97 DMEM,% 1 FBS,% 1 N-2,% 1 ampisilin ve ilgi konusu maddeler) başına oyuk başına 60 mcL ekleyin. </li><li> Petri kabını tekrar kuluçka makinesine yerleştirin (37 ° C). </li><li> Görüntüle rHücresel göç veya koklear eksplantın ayrılması belirtilerini belirlemek ve en fazla 7 gün sonra boyama yapmak için mikroskop altında egularly kullanın. </li></ol> 5. İmmünofloresans - Gün 1 <ol><li> Bloke edici çözelti hazırlayın (% 94 Fosfat Tamponlu Tuz (PBS),% 5 normal keçi veya at serumu (ikincil antikorlara bağlı olarak NGS / NHS) ve% 1 noniyonik sürfaktan (Malzeme Tablosuna bakın) ve stok Antikor çözeltisi (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve ilgili antikorlar ile% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde). NOT: Antikorlar, 1: 400+ (iç ve dış saç hücreleri için miyozin 7A) ve fare anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulin, SGN&#39;ler için) VEYA fare (IgG1) anti konsantrasyonunda tavşan anti-Myo7A&#39;yı içerir 1: 50+ (postsinaps için postsinaptik yoğunluk) ve tavuk anti-NF-H1: 1000+ (nevrofilament, anti-PSD95 1: 200+ (presynap için c-terminal bağlama proteini), fare (IgG2a) SGN&#39;ler ve sinir lifleri için). &quot;+&quot; MeaNs &quot;veya daha yüksek.&quot; </li><li> Bir pipet kullanarak kültür ortamı aspire. Numuneye dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Laminer akış kaputunun altında, koklear eksplantları steril PBS ile iki kez durulayın, her yıkamadan sonra 5 dakika boyunca çalkalayıcıya numuneler koyun. </li><li> Çalkalayıcıda (kaputun altında) 20 dakika% 4 paraformaldehid (PFA - DİKKAT) içindeki dokuyu düzeltin. PFA&#39;yı aspire edin. </li><li> Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS&#39;yi aspire. 3 kez tekrarlayın. </li><li> Koklear eksplantları çalkalayıcıda 30 dakika boyunca hazırlanmış bloke etme çözeltisine (% 94 PBS,% 5 NHS ve% 1 noniyonik yüzeyaktif madde) yerleştirin. </li><li> Koklear eksplantlar RT&#39;de bir sayaçta O / N ilgili primer antikorlar (vorteks) kullanılmadan hazırlanmış bir stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 noniyonik sürfaktan) yerleştirin. NOT: Petri kaplarını nemli kağıt havluyla plastik sargıyla sarın (veya eklenen çözelti alüminyum folyoya sarınIyon, bulaşıkları nemli tutmak ve O / N antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için, GFP ifade eden virüsler gibi floresan materyalleri içerir). </li></ol> 6. İmmünofloresan - 2. Gün <ol><li> Adım 5.1&#39;de birincil antikorları tamamlayan doğru ikincil antikor karışımlarını elde etmek için 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) leke (300 nM) hazırlayın ve stok antikor çözeltisini kullanın. (IgG1) 568 1: 1000+, keçi anti-fare (IgG2a) 488 1: 500+, keçi anti-fare (IgG1) 568 1: 200+ ve keçi anti- Ve keçi anti-tavuk 647 1: 200+ VEYA Phalloidin 568 1: 200+ (iç ve dış saç hücreleri için)). </li><li> Birincil antikor çözeltisini aspire edin. </li><li> Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS&#39;yi aspire. 3 kez tekrarlayın. </li><li> Koklear eksplantlar hazır stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde) res ile yerleştirinSekonder antikorları (kullanımdan önce girdaplı) 1.5 saatlik bir sayaç üzerinde tutun ve ışığa karşı koruyun. </li><li> İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve koklear eksplantları DAPI lekesi ile durulayın (1 dakika çalkalayıcıya yerleştirin ve daha sonra aspire edin). </li><li> Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS&#39;yi aspire. 3 kez tekrarlayın. </li><li> 4 yuvalı plakadan örneklerle lamelleri çıkarmak için forseps kullanın, damıtılmış H 2 O ile dolu bir alıcıya batırın ve lamelleri dikey olarak kağıt havluyla temas ettirerek kurutun. </li><li> Mikroskop slayt üzerine antifade bir orta montaj bir damla yerleştirin ve orta aşağı doğru bakan doku batırın lamelleri ters çevirin. </li><li> Kenarları çevresel olarak temizleyen (camın altındaki örneği ezmeden) temiz tırnak cilasını kullanarak lamelleri mühürle. Slaydları, ışıktan uzakta kapalı bir alanda düz durarak bırakın ve 15 ila 20 dakika kuruyana kadar bekleyin.Bunları bir kutuya yerleştirin veya konfokal mikroskop altında inceleyin. NOT: Floresan boyama, slaytları 4 veya -20 ° C&#39;de saklayarak en iyi korunur. </li></ol> 7. Konfokal Görüntüleme <ol><li> Nöritleri ve SGN&#39;leri içeren Corti bölgesinin organı için genel bir bakış ve yakınlaştırılmış resimler elde edin. NOT: Görüntüleme işlemi için standart ayarlar: 1,024 x 1,024 piksel, 400 Hz hızı, 3 çerçeve ortalaması,% 20 toplam lazer yoğunluğu ve genellikle 20X ve 63X&#39;lık yağ daldırma lensi (potansiyel olarak 2X dijital zoom ile birlikte). DAPI, Myo7A ve TuJ1 boyama protokolü için kanal ayarları yukarıda özetlenmiştir: 405% 5 DAPI, &quot;Akıllı Kazanç&quot; 766,8V, &quot;Akıllı Ofset&quot;% 0,0 -% 488 15% floresan izotiyosiyanat (FITC), &quot;Akıllı Kazanç&quot; 622,2V , &quot;Akıllı Ofset&quot;% 0.0 -% 561 13 tetrametilhomadin izotiyosiyanat (TRITC), &quot;Akıllı Kazanç&quot; 562.4V, &quot;Akıllı Ofset&quot;% 0.0. </li><li> Resimleri kullanarak z-yığınını birleştirin.Yazılımı kullanarak z-ekseni projeksiyonu elde edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+strategies+for+hearing+restoration).">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062 (2014).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure:+evidence+of+a+misspent+youth.">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+&amp;#34;temporary&amp;#34;+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &amp;#34;temporary&amp;#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones.">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li><li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice.">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li><li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear.">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li><li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells.">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li><li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development.">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants.">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li><li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti.">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li><li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss.">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li><li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry.">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432 (2011).</li><li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation.">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260 (2015).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants.">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101 (2014).</li><li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro.">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li><li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear.">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li><li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage.">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599 (2015).</li><li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells.">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li><li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration:+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy.">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+&amp;#34;recovered&amp;#34;+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &amp;#34;recovered&amp;#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea.">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li><li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector.">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes.">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li><li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Araştırmacılar, koklear eksplantları içeren deneyleri yapmadan önce diseksiyon tekniğini mükemmelleştirmelidirler. Saç hücreleri, öğrenme eğrisinin başlarında gerçekleştirilen diseksiyonlar sırasında sıklıkla hasar görürler ve bütünlüğü için özellikle sorunlu bir an, sabit eller, uygun araçlar ve deneyim gerektiren, tectorial membranın çıkarılmasıdır. Zamandan ve kaynaklardan kazanmak için diseksiyon mikroskopu altında görsel bir kontrol yapılmalı ve potansiyel olarak hasar gö...

Sensorinöral İşitme Kaybı (SNHL), iç kulakta veya artan işitme yolunda hasar olduğunu gösterir. İşitme kaybı, insanlardaki en yaygın duyusal eksiklik iken, küratif terapiler henüz mevcut değildir 2 . Koklear veya işitsel beyin sapı implantları ağır derecede derinlemesine SNHL olan hastalara bir dereceye kadar işitme becerisi kazandırabilmesine rağmen, özellikle de sesli konuşmayı anlamaya veya müzik dinlemeye çalışırken, bu cihazların sağladığı işitme &quot;doğal&quot; işitme durumundan çok farklıdır. Saç hücresi dejenerasyonu, uzun süredir travmatik işitsel olayların ( örneğin, yüksek gürültüye maruz kalma) birincil sonuç olarak düşünülürken , bilginin saç hücrelerinden işitme sinirine iletildiği sinapsların en azından akustik travmaya karşı savunmasız olduğu yönünde artan bir kanıt vardır 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . İşitsel işlevi değerlendirmek için kullanılan altın standart olan insan odyometrik eşikleri, iç kulaktaki belirli hücresel hasarı öngörmemektedir, mümkün olduğunca çabuk hücresel dejenerasyonu saptamak ve uygun tedaviyi başlatmak için daha rafine edilmiş araçlar gerekmektedir. İşitme kaybı için umut verici farmasötik tedaviler genellikle homojen hücre kültürleri üzerinde in vitro olarak denenir, ancak bu tür sistemler koklear mikro çevreyi doğru bir şekilde modellememektedir. Koklear hücrelerin Corti 10 , 11 ya da Spiral Ganglion Nöronları (SGNs) 12 organı izole edildiğinde ya da ne zaman ne de olsa, koklea 8 , 9 içindeki diğer hücre tiplerini etkileyen trofik faktörleri salgılarlar. Moleküler belirteçler analiz edilirEf &quot;&gt; 13. Bununla birlikte,&quot; hassas tıp &quot;arayışında işitme kaybı için yeni ve kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak için in vitro verilerin geçerliliği için gerekli olabilecek in vivo çalışmalar önemli kaynaklara ve zamana ihtiyaç duymaktadır. Işitme testleri ve müteakip koklear tüm montajların diseksiyonu ile orta kulak veya yuvarlak pencere membran enjeksiyonlarını mükemmelleştirmek ve gerçekleştirmek için ne kadar çaba gerekir? Koklear eksplant olarak bilinen organotipik ex vivo kültürlerde umut verici bileşiklerin verimli taranması, ekonomik ve güvenilir bir alternatif sağlar 14 , 15 , 16 , 17 . Bu makalede, tedavi edilen koklear eksplantların üretilmesi, sürdürülmesi ve değerlendirilmesi için kullanılan bir protokol açıklanmaktadır. Taramada kullanımı da dahil olmak üzere, bu model için özel uygulamalar vurgulanmaktadırPotansiyel olarak terapötik bileşikler ve gen terapisi için viral vektörlerin karşılaştırmalı değerlendirmesi. Bir ex vivo eksplant yaklaşımı, araştırmacıların belirli bir tedavinin etkilerini , in situ olarak farklı hücre popülasyonları üzerinde görselleştirmesini ve hücre tipine özgü mekanizmaların tanımlanmasını ve daha sonra hedeflenen terapötiklerin arıtılmasını kolaylaştırır. Genel olarak, bu teknik, kokleada bir arada bulunan çok çeşitli hücre tipleri arasındaki yaşamsal çapraz konuşmayı korurken, kokleayı ex vivo çalışmak için bir model sağlar.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H antibody, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&amp;reg;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&amp;nbsp;</td><td>Aliquot in 50 mL tubes and store in -20&amp;deg;C freezer</td></tr><tr><td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (dissecting) knife &amp;ndash; angled 30&amp;deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&quot;), 1 mm thick, white, pack of 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Prep Pad, Non Sterile&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6&#039;&#039; - 2 mm thick</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

Son birkaç on yılda yapılan işitme araştırmalarında dikkate değer ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, tipik olarak iç kulaktaki hassas mekano-algılama yapılarına hasar veren veya kaybedilen bir durum olan Sensorineural İşitme Kaybı (SNHL) için herhangi bir tedavi yoktur. Son yıllarda sofistike in vitro ve ex vivo testler ortaya çıkmış ve kaynakları azaltmak ve SNHL için iyileştirme çabalarını hızlandırırken potansiyel olarak terapötik bileşiklerin sayısının artmasını mümkün kılmıştır. Bazı hücre türlerinin homojen kültürleri günümüz araştırmalarında önemli rol oynamaya devam etse de, birçok bilim adamı şimdi koklear eksplant olarak da bilinen daha kompleks organometalik faregiller arası kulak kültürlerine güveniyor. Organik hücresel yapıların iç kulak içinde korunması, iç ve dış kıl hücreleri, spiral ganglion nöronları, sinir hücreleriItes ve destekleyici hücreler. Burada neonatal farelerde koklear eksplantların hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanması sunulmuştur. Bu eksplantların dikkatli bir şekilde hazırlanması, SNHL&#39;ye katkıda bulunan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve işitme araştırmaları topluluğu için değerli bir araç teşkil eder.

Birçok protokol Corti eksplant organına odaklanırken, bu teknik SGN&#39;ler de dahil olmak üzere tüm koklear dönüşün anatomisini korumaya çalışmaktadır. Bu, araştırmacılara belirli bir tedavinin Corti organına ek olarak SGN&#39;lerin nöritleri ve somatları üzerindeki etkilerini analiz etme olanağı sağlar. Modülün bir bölümünü koruyan bir diseksiyon gerçekleştirmek, burada açıklandığı gibi, yalnızca Corti organını eksprese etmekten daha teknik açıd...

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research at JoVE.com

Araştırmalarda İn Vitro Tarama Aracı Olarak Yenidoğan Fare Koklear Eksplant Tekniği | Tıp | Video

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

17.5K Görüntüleme.  Massachusetts Eye and Ear.  Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir. 

Video: Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

Dinlemede Making Sense IMAP Test Batarya:

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

Tıp

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biyoloji

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Nörobilim

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Fare Koklear Saç Hücrelerinin Etkili In Vitro Yetiştiriciliği

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Yazar Spotlight: İşitsel Araştırmalar için Fare Saç Hücrelerinin Yetiştirilmesindeki Gelişmeler 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler