この研究はシカゴ大学女性委員会、ウェンディウィル症例基金、シカゴ大学総合がんセンター支援グラント（P30 CA014599）の支援を受けました。シカゴ大学のフローサイトメトリーコア（Flow Cytometry Core）に感謝したいと思います。この実験の設立には、ドゥ・ジョン研究所の他のメンバー、特にレスリー・ペドラザとショーン・マッコネルもお手伝いします。

ゼブラフィッシュのすべての手順は、シカゴ大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の承認を受けています。シカゴ大学は、実験動物管理（AAALAC）の評価と認定協会の認定を受けています。 1.ゼブラフィッシュにおける蛍光標識T-ALL細胞の生成および単離<ol><li> 同系ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション <ol><li>市販のキットを使用して、tol2トランスポゼース（プラスミドDNAの供給源については表を参照） 12によって認識される逆方向末端反復を含む環状rag2 ：c-mycおよびrag2 ：緑色蛍光タンパク質（ rag2 ：GFP）プラスミドDNAを単離し、滅菌水で洗浄した。 注：この研究ではGFPを使用していますが、蛍光タンパク質があれば動作します。 </li><li> pCS2-トランスポゼース（tol2）RNAを調製する<ol><li>市販のキットを用いてtol2プラスミドDNAを単離する（tプラスミドDNAの供給源の材料表） 12を用いて滅菌水でDNAを溶出させる。 </li><li>適切なバッファーに5単位のNotI制限酵素を加えて37℃で1時間、1μgのtol2 DNAをインキュベートしてプラスミドを線状化する。 NotIを65℃で20分間加熱失活させる。 </li><li>市販のRNA転写キット13を使用して、直鎖状DNAからSP6 RNAポリメラーゼでtol2 RNAを転写する。 -80°Cで1回分のアリコートにRNAを保存します。 </li></ol></li><li> 250ngのrag2 ：c-mycプラスミドDNA、250ngのrag2 ：GFPプラスミドDNA、150ngのtol2 RNA、および0.5μLのフェノールレッドを添加することによって、氷上で注入混合物を調製する。ヌクレアーゼフリーの水で10μLに調整する。 </li><li>先に確立された、ガラス毛細管から引き出されたマイクロインジェクターおよび針を使用して、1細胞段階の同系ゼブラフィッシュ胚の細胞に〜1nLの注射混合物を注入する。方法8,14を磨いた。 注：単為生殖により生成された同系ゼブラフィッシュは、移植後の遺伝的異種性および免疫拒絶を排除するためにここで使用される。しかし、野生型ゼブラフィッシュまたは任意の所望の株も使用することができる。 </li><li>注射後24時間および48時間で、死亡、発育不良、または不正な形式の胚を取り除く16 。 </li><li>注射後6日目に魚系に注射した魚を置き、標準プロトコールに従って魚を飼育する6 。 </li></ol></li><li> ゼブラフィッシュを注射し、腫瘍増殖をモニターする <ol><li>注入後21日目に、ペトリ皿上の胚培地の液滴中に単一注入幼虫を置き、エピ蛍光顕微鏡（励起バンドパス：470/40、放出バンドパス：525/50）を用いてGFP蛍光についてスクリーニングする。 注：ゼブラフィッシュの幼虫はhaveはrag2 ：c-mycとrag2 ：GFPの両方を統合し、緑色の蛍光胸腺（陽性魚）を有し、胸腺を越えて悪性緑色蛍光細胞の拡大をすでに示している可能性がある。 GFP +胸腺を有する全ての魚は、GFP + T-ALLを発症する。プラスミドの組込みを示さない幼虫は、緑色蛍光細胞（陰性魚）を有さない。 </li><li>陰性の魚（蛍光の欠如に基づいて）を別のタンクに分け、注射後28および35日に再び魚をモニターする。注射後28および35日目に、スクリーニング前に魚系水中の0.02％緩衝化トリカイン（MS-222）で魚を麻酔する。 </li><li>蛍光標識された胸腺または蛍光標識された腫瘍について陽性である各ゼブラフィッシュの幼虫を、腫瘍増殖をモニターするための個々のタンクに1週間に3回配置する。 </li></ol></li><li> 一次腫瘍魚からの蛍光標識T-ALL細胞の収集 <ol><li> 0.9Xのリン酸緩衝生理食塩水（FBS / PBS）中の10％熱不活性化ウシ胎児血清の少なくとも20ミリリットルを準備します。 </li><li>ヘパリンナトリウム塩（300単位）の1つのバイアルにFBS / PBSを1ml加えます。 </li><li>選択した魚の体の50％以上で腫瘍を保有する、またはこれらの魚は困難食べたり水泳を持ちます。トリカインまたは氷水浸漬することによって、それらを過剰投与により、魚を生け贄に捧げます。鰓の動きや心拍の欠如aで死亡を確認。 </li><li>魚の頭を削除するためにカミソリの刃を使用してください。 </li><li>余分な赤血球を除去するためにヘパリン溶液で魚の空洞を洗います。 <ol><li>ピペットを使用して、魚の体腔内に（ステップ1.3.2で調製した）ヘパリン溶液の100μLを注入します。こぼれ全ての液体を除去（これは血液細胞を含有する）および1.5mLのマイクロ遠心チューブにそれをピペット。 </li><li>再び体を洗うために、新鮮なピペットチップを使用してください。少なくとも3回の洗浄を行い、またはこぼれた液体は、BLの自由が表示されるまでおお</li><li>それ以上の分析には使用されないので、ステップ1.3.5.1および1.3.5.2の洗浄液からすべての液体を捨てる。 </li></ol></li><li>白血病細胞を収集する。 <ol><li> 100μLのFBS / PBSを魚の体腔に注入する。 </li><li>ピペットチップで魚の体の外側に穏やかな圧力をかけて、腫瘍細胞を絞る/押し出す。 注：このステップが解剖顕微鏡を使用して実行される場合、体腔から流出する腫瘍細胞が明らかになります。 </li><li>各洗浄液から1.5 mLのマイクロ遠心チューブに液体と細胞を集める。 </li><li>大部分の腫瘍細胞が採取されるまで（通常5〜10回）、ステップ1.3.6.1〜1.3.6.3を繰り返す。すべての腫瘍細胞を同じ1.5mLマイクロ遠心チューブに集める。細胞を室温に保つ。 </li></ol></li><li>穏やかにピペッティングすることにより、収集した腫瘍細胞をステップ1.3.6から混合し、細胞の塊を解離させる。細胞懸濁液を4つの0μmメッシュフィルター。 100μLのFBS / PBSでフィルターを1〜2回洗浄する。細胞を室温に保つ。 </li><li> 2μLの細胞懸濁液を18μLのトリパンブルー（0.4％、1:10に希釈して濾過したもの）と新しいチューブで混合する。血球計算器に10μLをロードし、生存（非青色）蛍光細胞の数を数えて、単離した腫瘍細胞の数を計算する。 注：非青色のGFP陰性細胞は、正常で非悪性のT細胞である可能性が高く、計数すべきではありません。 Hoechst 33342で細胞を染色するためには、少なくとも2×10 6個の細胞が必要である。 </li></ol></li></ol> Hoechst 33342を用いて蛍光標識したT-ALL細胞を染色し、側方集団を同定する。 <ol><li> Hoechst 33342 1:10をヌクレアーゼフリーのH 2 Oで希釈して、1mg / mLの作業濃度にする。 4℃および暗所で色素を保存する。 </li><li> 1 mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に49.1 mgを溶解して、ベラパミルの100 mM溶液を調製する。 注：ベラパミルはABCトランスポーターの阻害剤であり、側方集団実験の重要なコントロールである。サンプルにベラパミルを添加すると、Hoechst 33342色素を流出させるABCトランスポーターの能力が阻害される。したがって、ベラパミルをサンプルに添加すると、真の人口は消滅します。 </li><li>水浴を28℃に設定する。 </li><li>蛍光活性化セルソーター（FACS）チューブに細胞と溶液を加えることによって、暗所でサンプルとコントロールを準備します。 <ol><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、DMSO 2.5μLを加えてサンプルを調製します。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 </li><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、100 mMベラパミル2.5μLを加えてコントロールを調製する。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 注：少なくとも10 6細胞/サンプルが推奨されますが、より多くの細胞を染色することが推奨されます。特に、イオンセルは、さらなる分析のためにソートされます。 10個の6細胞/ mLを超え、及び15μgの/ mLのヘキスト33342濃度を維持しません。 10×10 6個の細胞が染色される場合、総反応容量は10 mLです。 </li></ol></li><li> 120分間、暗所で28℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、直ちに氷上に細胞を配置し、暗所に保管してください。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLで洗浄します。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLに細胞を再懸濁。 </li><li>細胞選別まで4℃で保管してください。 </li><li> 15分前に、ソーティング、細胞FBS / PBS（最終濃度を2μg/ ml）を各1 mLのヨウ化プロピジウム（PI）ストック（1mg / ml）の2μLを追加します。よく混ぜます。 </li></ol> 3. FACS蛍光標識T-ALL細胞集団内のサイドポピュレーションを検索します<ol><li&gt;染色されたゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を、Hoechst 33342色素励起用のUVレーザーとPI励起用の488nmレーザーとGFP + T-ALL細胞の検出用のセルソーターで分析する。 </li><li>生きたGFP + T-ALL細胞のゲートを決定する。 <ol><li>破片をゲートアウトするには、前方散乱（FSC）およびサイド散乱（SSC）領域を使用します。 注記：FSCはセルサイズを区別するために使用され、SSCはセルの細分性を区別するために使用されます。 </li><li>二重線を識別するためにFSCおよびSSC幅を使用する。 注：フローサイトメーターの検出器で識別される3つの成分、面積、高さ、幅があります。面積は、典型的には、細胞の蛍光を測定するために使用される。幅は飛行時間を測定し、2つの細胞が一緒に凝集する場合、幅は2倍になります。 </li><li>生存腫瘍細胞については、適切な検出器（ 例えば 、GFPの場合はFITC、PIの場合はPerCP Cy5-5）を使用して、GFP陽性細胞およびPI陰性細胞の周囲にゲートを描く。 </li></ol></li><li&gt;生細胞のゲートで、Hoechst BlueおよびHoechst Redバンドパスフィルター（それぞれ450/50および670/30）を介してHoechst 33342蛍光を測定します。 注：サイドポピュレーションが存在する場合は、これが設定された後に明らかになります。重要なことに、側方集団は、本当の側方集団とみなされるためには、ベラパミル対照において消失しなければならない。 </li><li>さらなる実験のために側方集団細胞を選別する場合は、大きなノズル先端（100μm）を使用し、3mLの100％FBSを含むFACSチューブに細胞を集める。選別後の細胞の生存率を向上させるには、より小さなチップ（70μm）ではなく、より大きなノズルチップ（100μm）を使用してください。 </li></ol>

<ol>
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著者は何も開示することはありません。

側方集団検定は非常に感度が高い。したがって、プロトコールのわずかな変更は、側方集団細胞を検出することを困難にする可能性がある。第1に、染色工程中の温度は、各動物/細胞系に特異的である。哺乳動物系では、側方集団検定は典型的には37℃で実施される 。ゼブラフィッシュT-ALL細胞を37℃でインキュベートすると、多くの細胞が死んだため、このインキュベーシ?...

側方集団アッセイは、細胞膜上の高レベルのATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質のために、DNA結合色素Hoechst 33342を流出させる組織内の特定の細胞の増強された能力を利用する。 Hoechst 33342色素を流出する細胞は、色素がUVレーザーによって励起された後、二波長フローサイトメトリー分析を用いて同定することができる。このアッセイは、マウス造血幹細胞（HSC） 1を同定するために最初に用いられたが、その後、多くの組織および癌において幹/前駆細胞集団を同定するために使用されている（参考文献2で検討されている）。しかし、細胞の集団のすべてに側面集団があるわけではなく、すべての側面集団が幹/前駆細胞に対して富化されているわけではありません。 ゼブラフィッシュは、ヒトの癌を研究するための強力な脊椎動物遺伝モデルシステムです3,4、伝統的なマウスよりも多くの利点がありますがんのうずき。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精され、光学的に透明であり、遺伝子導入および癌開始および進行を含む病理学的プロセスのインビボでの観察を促進する。今日まで、可能性のある幹細胞または前駆細胞を検出するための側方集団検定は、ゼブラフィッシュの腎臓骨髄にのみ適用され、HSCを同定したが、ゼブラフィッシュ癌モデルではなかった 5,6 。 T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルは、形態学的および遺伝的にヒトT-ALL 7,8,11に類似している。 T-ALLは、ヒトでは小児の10-15％、成人ALLの25％を占める攻撃的悪性腫瘍である9 。 T-ALLの治療が改善されたが、再発は依然として一般的であり、予後不良と関連している。 T-ALL腫瘍は異種遺伝子であるOUとは、白血病開始細胞（低所得国）を含む多くの異なる腫瘍細胞の亜集団を含みます。低所得国は、単一細胞から腫瘍全体を再成長する能力によって定義され、腫瘍細胞集団内で低所得国の周波数は、限界希釈移植アッセイ（LDA）を介して、レシピエントに変化する細胞用量を移植することにより算出することができます。 LDAの実験は低所得国8、10、11の周波数を計算するためにゼブラフィッシュで行われているが、この決意は、後知恵で作られており、低所得国の将来の分離を可能にしません。そのため、プロスペクティブにがん幹細胞活性のために濃縮された集団を分離する方法が欠けています。ゼブラフィッシュT-オールズからサイドポピュレーション細胞を同定および単離することは、この欠点に対処する第一歩です。 ここで紹介するプロトコルは、効率的にzebrでT-ALL腫瘍を生成する方法について説明しますT-ALL腫瘍細胞を採取し、Hoechst 33342でそれらを染色して、細胞の側面集団を同定する。ゼブラフィッシュT-ALLを用いた将来のin vivo実験には、側方集団細胞がLICに対して富化されているか、または他の幹または前駆体様の特性を有するかどうかが含まれ得る。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

異種細胞集団は、健常又は悪性のいずれかの組織から、DNA結合色素を流出する差動能力によって特徴づけられる細胞の集団を含んでいてもよいヘキスト33342細胞のこの「サイドポピュレーション」は、ヘキスト33342の後にフローサイトメトリー法を用いて同定することができます染料は、紫外線（UV）レーザによって励起されます。多くの細胞型のサイドポピュレーションは、ステムまたは前駆細胞様細胞が含まれています。しかし、全ての細胞型は、識別可能なサイドの人口を持っていません。 ゼブラフィッシュ 、ゼブラフィッシュは、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL） のin vivoモデルで堅牢なを持っているが、これらのゼブラフィッシュT-オールズは、サイドポピュレーションを持っているかどうかは不明です。ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュのT-ALLにおけるサイドポピュレーション細胞を単離する方法について説明します。開始するには、ゼブラフィッシュにおけるT-ALLは1細胞期胚にTOL2プラスミドのマイクロインジェクションを介して生成されます。腫瘍は、彼らがより多くのANIの半分以上に拡大した段階まで成長したらT-ALL細胞を回収することができる。次いで、細胞をHoechst 33342で染色し、側面集団細胞についてフローサイトメトリーにより検査する。この方法は、ゼブラフィッシュのT-ALL研究において幅広い用途を有する。ゼブラフィッシュには、これらの側方集団細胞が癌幹細胞様であるかどうかを確認する既知の細胞表面マーカーは存在しないが、 in vivo機能性移植アッセイが可能である。さらに、これらの側方集団細胞の遺伝的特徴を同定するために、単一細胞トランスクリプトミクスを適用することができる。

ゼブラフィッシュで蛍光myc誘導T-ALL腫瘍を効率的に生成するために、tol2トランスポザーゼ部位に隣接する環状DNA構築物をtol2 RNAと同時注入することができる。線状化DNAのゼブラフィッシュ胚への注射からの以前の研究は、5％のトランスジェネシス速度を報告している8 。プロトコールをtol2媒介性の遺伝子導入を含むように調整することにより、10〜44...

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K ビュー.  The University of Chicago. ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.