我々は最近、LCK GFPゼブラフィッシュの多くのB細胞がGFPの低レベルを発現することを発見した。これにより、この行は、B細胞だけでなく、T細胞を研究するための有用なツールになります.この技術の主な利点は、LCK GFPゼブラフィッシュからB細胞とT細胞を研究したり、癌を持つ魚からB-ALL細胞とT-ALL細胞を研究できることです。
これらの方法は、ゼブラフィッシュにおけるB細胞の発達およびB-ALL研究を可能にする。これは適応免疫システムを理解することに関連しており、小児がんによく見られる悪性腫瘍です。あなたが良い胸腺と骨髄サンプルを得ることができるまで、数回あなたの技術を洗練する前に、これらの解剖をしたことがない場合.
視覚的なデモンストレーションは、視聴者が魚の蛍光とB-ALLを認識し、その分離のためにB細胞とT細胞を識別するための正しい設定を選択するのに役立ちます。魚系水中の0.02%Tricaineで麻酔した後、エピフルエンス顕微鏡のGFPフィルターを使用して、枝腔の後内側の側面で2〜6ヶ月のシブラフィッシュの蛍光チミを調べます。胸腺を見つけると、ペトリ皿に安楽死させた魚を配置し、蛍光顕微鏡を使用してGFP陽性のチミを除去する。
そして、腎臓の骨髄と脾臓を収穫するための明視野顕微鏡設定。採取した各臓器を、500マイクロリットルの冷たい選別媒体を含む1.5ミリリットルのチューブに入れ、氷上の組織を均質化するために害虫マイクロチューブホモジナイザーを使用します。次に、35マイクロメートルのメッシュフィルターを介して均質化された組織をひずみ、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を氷の上に置く。
2〜4ヶ月から、蛍光顕微鏡を使用して二重トランスジェニックrag2:hMYC LCK EGFP魚を低暴露設定でスクリーニングし、明るいT細胞急性リンパ芽球性白血病またはT-ALLおよび高暴露設定を同定して薄暗いB-ALL動物を同定します。野生型制御および白血病前魚は、GFPが胸腺にのみ局在している。簡単な3つのカテゴリシステムを使用して、GFP蛍光の程度に基づいて魚を分類します。
レベル1の魚は、限られた局所的な広がりだけで胸腺腫瘍として蛍光シグナルを示す。レベル2の魚は、体の50%未満を含む胸腺を越えて蛍光シグナルを示す。そして、レベル3の魚は、体の50%を超えて伸びる蛍光シグナルを実証します。
魚をがんのない魚とALLで分離します。そして、新しいALLの開発のために毎月1回GFP陽性腫瘍のない白血病前の魚を監視します。TまたはB-ALL細胞分離のために、カミソリの刃を使用して、安楽死させたレベル3匹の魚の頭と胸腺領域を取り除き、体をシャーレに入れます。
P-1000ピペットを使用して、魚の腹膜腔を500マイクロリットルの冷たい選別媒体で洗浄し、5ミリリットルのチューブに細胞と培地を採取します。新鮮なピペットチップを使用すると、体腔に冷たい選別媒体の2〜3つの追加の200〜3マイクロリットルの量を注入し、ピペットの先端を使用して魚の体に穏やかな圧力を加え、体腔から5ミリリットルチューブに細胞を押し出します。次いで、35マイクロリットルのメッシュフィルターを介して細胞懸濁液をひずむ。
そして、フローサイトメトリーによる分析まで細胞を氷の上に置きます。全身均質化のために魚の体を均質化し、チューブに冷たい選別媒体の追加300マイクロリットルを追加するために、害虫マイクロチューブホモジナイザーを使用してください。35マイクロメートルのメッシュフィルターを通して細胞懸濁液を濾過し、必要に応じて、組織の破片だけがフィルターに残るまで、追加の選別媒体でフィルターを洗浄する。
次に、分析まで細胞を氷の上に置きます。分離細胞のフローサイトメトリック解析では、製造業者のガイドラインに従ってフローサイトメーターパラメータを設定します。リンパ球および前駆細胞ゲートを定義するための前方散乱および側面散乱パラメータを設定し、細胞の破片を除外するために10,000〜50,000のイベントを取得する。
細胞ダブレットを除外し、リンパ球および/または前駆体ゲートを使用して、GFP陽性細胞の数と割合を決定します。フィコエリスリンとGFP強度を使用すると、GFP陰性対GFP低対GFP高細胞のゲートが定義されます。GFP低細胞とGFP高細胞を単離するためのゲートをどこに配置するのかを学ぶことは、純粋なBおよびT細胞集団を得るために重要です。
2つの異なるGFP陽性集団、GFP低B細胞およびGFP高T細胞は、胸腺から得ることができる。生後3ヶ月のゼブラフィッシュの腎臓骨髄に存在するB細胞は、GFPの低レベルを発現する。しかしGFPの高細胞は乏しく、3ヶ月齢の骨髄にはTリンパ球のごく一部しか存在しない。
同様に、脾臓サンプルはGFP高細胞よりも低いGFPの割合が高いことを示す。急性リンパ芽球性白血病をまだ発症していない二重トランスジェニック魚では、胸腺、骨髄および脾臓におけるGFP発現は、単一トランスジェニックなLCK EGFP魚で観察されるのと同様である。しかし、臓器1個あたりのリンパ球数は増加する。
おそらく、RAG2プロモーターが活性である未熟なBおよびT細胞集団のMYC駆動型の拡張に起因する。6ヶ月までに蛍光癌を発症したBおよびT-ALLを有する二重トランスジェニック魚では、B-ALLはほとんどGFP低細胞を含む薄暗い蛍光癌である。対照的に、明るい蛍光魚は、GFP低B-ALLおよびGFP高T-ALL細胞の両方の単離されたT-ALLまたは混合集団のいずれかを収容することができる。
実際、定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析により評価されるように、GFP低細胞は高レベルのB細胞転写産物を発現する。そして、GFP高細胞は、より高いレベルのT細胞遺伝子、LCKおよびGFPマーカーを発現する。顕微鏡でB-ALLで魚を認識する方法を学ぶことが重要です。
そしてGFP低母集団とGFP高集団を分離するためのフローサイトメトリーゲートを適切に定義する方法。この手順に従うと、PCR、シーケンシング、血液または生体内移植実験のために、GFP低細胞およびGFP高細胞からDNA、RNA、またはタンパク質を分離することができます。LCK GFB魚がT細胞に加えて蛍光B細胞を持っていることを知ったら、同じ動物の両方の細胞タイプを研究してBとT-ALLを評価することができました。
