資金は、NIHの助成金5T32CA09216 - 26（JSB用）、およびK01 AR055619 - 01A1と3 K01 AR055619 - 03S1（DML用）によって、同様にアレックスのレモネードスタンド財団、ハーバード幹細胞研究所とアメリカがんによって提供されています社会。

1。ゼブラフィッシュ胚のDNAのマイクロインジェクション<ol><li> 37℃で一晩NotIで各プラスミドの10μgのを消化することによってGFP 11 DNA構築物：：cMycとRAG2：：RAG2を線形化する 。 </li><li>フェノール：クロロホルム抽出とは、プラスミドを沈殿させ、そして20μLH 2 Oのそれぞれを再懸濁します。 </li><li> 20μL、10μLと高域のDNAラダーの5μLを1％アガロースゲル上の各消化したプラスミドの1:1、1:5及び1:10希釈を実行することにより、DNAの濃度を決定する。定量化のこのタイプは、一般的に分光器の測定値よりも正確です。 </li><li> ：cMyc +30ng/μLRAG2：：：GFP CG1 -株（または他の同系株）30ng/μLRAG2を使用して、ゼブラフィッシュ胚に注入するための1MのKCl 0.5 X TEにおける60ng/μLの最終濃度にDNAを希釈する。 </li><li>注射は、以前に示した12、13として実行する必要があります。簡単に言うと、男性と女性のゼブラフィッシュは、注入前に交尾室で夜を設定されています。注射の日に、DNAが注射針にロードされ、圧力が50μmの直径を持つ気泡がステージのマイクロメータによって測定される、（30pg DNA）追放されるように調整されます。その後、胚は、DNAが細胞に直接注入されると、ではなく卵黄に、1細胞期で注入されています。注入CG1胚および幼虫の生存率は一般に低いと、そして魚のわずか5％は、正常に導入遺伝子を組み込む予定。従って、&gt; 600の胚は、いくつかの魚が白血病を発症することを保証するために注入されるべきである。 </li><li> 28.5 ° Cで注入された胚を保存し、24時間後に死亡胚を削除します。動物は、その後の人生の5日間で大きなタンクに移され、前述したように14を提起している。 </li></ol> 2。一次T - ALLゼブラフィッシュ幼生のためのスクリーニング<ol><li>注射後約28日後、ペトリ皿に魚系の水の25mLに4ng / M Tricane - Sの200μLを添加することにより幼虫のゼブラフィッシュを麻酔。 </li><li> GFP蛍光を（図1）を検出するために20分の485の励起波長と25分の530発光フィルターを使用して、20倍の倍率で落射蛍光顕微鏡を用いてT - ALL蛍光標識の開発のための幼虫を調べます。 </li><li>負であるものから別の腫瘍正の幼虫。負の幼虫が、後の時点で検査することができます、一度腫瘍はT - ALL正の魚が失われなかったことを保証するために、大きく成長している場合があります。 </li><li>モニターT - ALL腫瘍の成長を追跡するための落射蛍光顕微鏡を使用して週に最低でも一度に正の魚。 </li></ol> 3。蛍光標識一次性白血病細胞の単離および精製<ol><li> GFP陽性白血病細胞は動物の&gt; 50％を抜いているときに、9mL魚系の水を含むペトリ皿に4ng/mL Tricane - S液1mLを追加することで、魚を生け贄に捧げる。 </li><li>セルをバッファするために5％ウシ胎児血清を1mLの0.9 PBSを含む新しいペトリ皿に魚を置きます。 、かみそりの刃を持つ魚を痩せ衰えさせるピペット大きな細胞塊を解離するために混合し、50mLのチューブに40μmのメッシュのストレーナを介して細胞を通過する。それは単一の細胞にすべての組織の塊を解離させる必要はありません。 </li><li> 4mlのポリスチレンチューブに細胞のピペット500μL。死んだ細胞をラベルする1μL1mg/mLヨウ化プロピジウム（PI）を、追加。渦は、その後、氷上で細胞を維持する。 </li><li> 、野生型CG1魚を犠牲に柔らかくなると、合計で50mLのチューブに0.9 PBSでtransplant.Add 4mlの5％FBS中に腫瘍細胞の担体として正常な細胞を、収集する上記と同様にひずみ5mLの量。 </li><li> 96ウェルプレートのピペット100μL/wellし、0.9 PBSで5％FBSで正常細胞、希に3 × 10 5細胞/ mLを数える。 </li><li>以下の用量で血液細胞を含む96ウェルプレートに蛍光活性化細胞ソーター（FACS）、ソートのGFP陽性、PI陰性腫瘍細胞（図2A、B）を使用して：10個/ウェル48ウェル、100細胞/ウェルに24ウェル、/ウェル12ウェル、および10,000細胞/ウェル6ウェルにに1000細胞内へ。さらに、10,000個の細胞が正常な血液細胞なしでウェルにソートされ、再分析はソートされた細胞（図2C）の純度と実行可能性を評価するためにFACSを使用している必要があります。 </li></ol> 4。大人のゼブラフィッシュに希釈移植を制限する<ol><li> 10分間2000xgで96ウェルプレートを遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li>上清の95μLを削除し、残りの5μLに細胞を懸濁します。 </li><li>大人（&gt; 60日齢）同系ゼブラフィッシュ腹側をホールドアップ、および26G / 2&quot;マイクロシリンジを用いて、腹腔内に細胞懸濁液を注入する。ゼブラフィッシュは、移植前に麻酔である必要はありません。通常は、45魚、10白血病細胞を移植され、20は100個の細胞を移植され、7が1,000細胞と5魚を移植され、10,000 T - ALL細胞を移植されています。 </li></ol> 5。白血病、開始セルの周波数を決定するために分析<ol><li>移植後約28日後、GFP蛍光を検出するために20分の485の励起波長と25分の530発光フィルターを使用してepifluoresence顕微鏡で移植魚を調べます。注入された魚の合計数あたりの正の魚の数を記録。 </li><li>最大90日間14日ごとに魚を再検討し、正の魚の数を記録。腫瘍陽性魚が瀕死になると、Tricane - S過剰投与によって動物を生け贄に捧げる。 </li><li>図3Dに示すように、テーブルにその結果、入力。 Webベースのエルダ（エクストリーム限界希釈法）における統計ソフトウェアにデータをアップロード<a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a>で腫瘍の正と負の動物の周波数を使用する15一次T - ALLの中で白血病細胞が自己複製の頻度を決定するために、各移植の用量。 </li></ol> 6。代表的な結果： 同系の魚から胚へのDNAのマイクロインジェクションは、多くの場合、胚の&lt;60％が24時間生存して、注入胚の低い生存率をもたらす。さらに、注入された同系の魚の生存率は、しばしば&lt;20％が28日間の存続と、一般的に幼虫の開発中に悪いです。 T - ALL発症するトランスジェニックフィッシュを作成するために胚を大量に注入することが重要です。 例として、CG1ひずみ胚はRAG2を注入した：：cMyc + RAG2：：GFP。導入遺伝子は、GFPを発現するすべてのセルにもcMyc表現されるように、胚に共分離する。幼虫は、T - ALL 28日（図1）の後に一次スクリーニングを行った。前の仕事は、注入された魚の約5％が胸腺内T細胞（図1）GFP陽性、及びT -細胞が11を形質転換さとしてこれらの魚の100％が白血病を発症する。与えることが示されているゼブラフィッシュの小さな割合は、28日目で検出するのは非常に簡単です、より高度な白血病を持っているかもしれないが、ほとんどは、GFP陽性の胸腺（図1）を持っているので、幼虫はそのすべての正の確保するために高倍率下で個々に検討する必要があります魚が選択されています。 GFP陽性T - ALL細胞は日45から70の間に動物の&gt; 50％を追い越すだろう。 提供される例では、ゼブラフィッシュは、人生の65日で屠殺し、白血病細胞を単離し、FACSで希釈移植を制限するために選別した。ヨウ化プロピジウム陰性と（図2）のGFP陽性単一細胞を96ウェルプレートに分類された。再解析は実行可能性（理想的には&gt; 95％）と純度を評価するために10,000ソートされた細胞で行われていた（理想的には&gt; 92％、図2）。移植T -オールズは一般的に28日間前に発生するが、一部の腫瘍は開発するために60日以上かかる場合があります。いくつかのT -オールズがより進んでいたが、この例では、28日目で、初期段階の腫瘍は腹膜腔（図3C）を埋めるために拡大した、、注射部位の近くにGFP陽性細胞（図3B）の領域と見られ。 T -オールズつの異なるプライマリから希釈細胞移植アッセイの制限からのデータは、図3Dに示されています。これらの実験のために、220頭以上の動物は簡単に数時間内に一人で達成することができる、移植した。エルダのソフトウェアを使用してデータ分析は平均で、135の1はT - ALL細胞は白血病増殖型の細胞（図3E）自己複製された、ことを示した。 <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="図1"/> 図1 ぼろと1細胞期に注入ゼブラフィッシュの幼虫：。：- cMyc +ぼろ：：- EGFPは、一次性白血病の成長のためにスクリーニングした28日後に注射。魚は（*）胸腺内T細胞のGFP陽性だった; T -細胞が時間をかけて、変換になるとこの魚は、T - ALLを開発します。この段階では、28日目で非常に一般的です。一つの魚は（**）高度なT - ALLの軟組織に拡がっていることがありました。残りの二匹の魚は、腫瘍の成長のために否定的です。画像は16Xの倍率で撮影された。 <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="図2"/> 図2蛍光標識したT - ALL細胞は病気の動物からソートし、限界希釈細胞移植アッセイで使用されていた。最初に、ゲートが単一のセルを（左上のパネル）を選択して描画されて、その後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞（中央左のパネル）が選択されています。最後に、ゲートは（左下のパネル）のソートのためにのみGFP陽性白血病細胞を選択するために描かれました。ソートされた細胞は、移植（右パネル）の前に実行可能性と純度を評価するために再解析する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。ゼブラフィッシュは28日、移植後の白血病の成長を調べた。魚は、NEG腫瘍です。ativeは（）、注射部位（B）で成長して小さな腫瘍を持っている、または進行した白血病（C）を持っている。画像は7X倍率で撮影したもの。各希釈で移植魚の総数あたり白血病陽性魚の総数は、（D）のように、記録されます。データは自己再生白血病細胞と上側と下側95％信頼区間（E）の数を計算するためにWebベースのエルダのプログラムに入力される。

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利害の衝突は宣言されません。

がん研究にゼブラフィッシュを用いての主な強みは、動物の多数は、比較的低コストで使用できることです。これは移植総数に腫瘍を開発、移植動物の割合は腫瘍開始細胞の頻度を決定するために使用される希釈細胞移植アッセイを、制限することで特に重要です。ここで紹介した方法では、70以上の移植のレシピエント動物が腫瘍増殖細胞数の正確な推定値を提供する、アッセイごとに使用されています。使用する動物の数と移植腫瘍細胞の投与量の両方が与え癌モデル用に最適化されるべきである、例えば、初期の実験では腫瘍開始細胞はまれである示している場合、有用な移植の投与量は100,000、50,000、10,000と1,000の細胞かもしれない移植。 同系のゼブラフィッシュの株は希釈分析を制限するのに有用である。しかし、これらの株はまだ一般的に、すべてのラボで使用されていない、といくつかのゼブラフィッシュ癌モデルは、同種の魚にのみ存在します。自己複製細胞頻度が同系のゼブラフィッシュは8を使用した場合よりも10〜100倍高いとして計算されることがありますが、限界希釈細胞移植は、免疫アブレーションを受けた野生型株で行うことができます。いくつかの腫瘍細胞は、外国の微小環境に移植には耐えられないので、細胞の大きな用量は、非免疫整合、照射された受信者への移植のために使用されるべきであることに注意することは重要です。さらに、多くの腫瘍は、レシピエント動物の免疫系が回復2​​1日後に退縮し始めるので、動物は7日毎に移植後の腫瘍の成長のために評価すべきである。 ここで紹介する方法は任意のゼブラフィッシュ癌モデルでの使用に適しており、これまでT細胞急性リンパ芽球性白血病8、および固形腫瘍モデル、横紋筋肉腫16の両方で、セルの周波数を腫瘍開始を決定するために使用されています。これらの腫瘍は、蛍光癌遺伝子と蛍光マーカーの両方を持つ胚の同時注入によって標識した、DNA共偏析するため、癌遺伝子を発現している任意のセルには、蛍光タンパク質17を発現するであろう。それは動物を犠牲にすることなく腫瘍の増殖の追跡を容易にし、FACSによって腫瘍細胞を単離するために直接的な方法を提供するため、蛍光が推奨されますが、それは彼らの精製を容易にするための腫瘍特異メーカーに対する抗体で、腫瘍細胞を標識することが可能です。 、ゼブラフィッシュにおいても抗体の染色は、最適化が必要な場合があります。 最後に、一度腫瘍増殖細胞の発生率が特定の腫瘍タイプに対して決定された、それらの細胞の頻度を支配するメカニズムを識別するために、これらのアッセイを使用することが可能です。例えば、原発腫瘍の細胞は、希釈の移植、または移植された魚を制限する前に経路特異的阻害剤で治療することができます自体が薬物を投与することができます。さらに、腫瘍自体の遺伝学は、その結果、原発腫瘍の遺伝子を過剰発現するように、目的の遺伝子を一細胞期の魚を注入することによって操作され得る。これらの実験では、自己複製細胞の頻度には影響は限界希釈アッセイで観察される。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> NotI制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0189 </td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム</td><td> EMDの生化学</td><td> 6805 - OP </td></tr><tr><td> 5M塩化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100Xトリス- EDTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9285 </td></tr><tr><td>ハイレンジのDNAラダー</td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td>同系のゼブラフィッシュ</td><td></td><td>参考資料6月8日 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ギブコ</td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2&quot;マイクロシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μmのメッシュのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

自己複製癌細胞は腫瘍の成長を促進するために無限の能力を有する腫瘍内の唯一の細胞型であり、したがって、腫瘍増殖細胞、または腫瘍開​​始細胞として知られています。それは破壊のためにこれらの自己複製細胞を標的にすることが大幅患者の予後1を改善、腫瘍の進行を阻止し、再発を停止すると考えられている。腫瘍内で自己複製細胞の頻度を決定する最も一般的な方法は、腫瘍細胞を増加させる用量でレシピエント動物に移植されている限界希釈細胞移植アッセイ、であり、腫瘍を開発し、動物の割合は、数を計算するために使用されます元の腫瘍のサンプル2、3内自己複製細胞の。理想的には、動物の多数は、正確に腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために、各限界希釈実験に使用されます。しかし、マウスを含む大規模な実験は、高価であり、そしてほとんどの限界希釈アッセイは、実験ごとに10〜15マウスを使用してください。 ゼブラフィッシュは、それらの遺伝子操作の容易さと大規模な実験を実行できるようにするための経済のために大部分は、癌のモデルとして注目を得ています。さらに、ゼブラフィッシュでモデル化されたがんの種類は、密接に、相手の人間の病気4を模倣することが判明している。それは、レシピエント動物の致死照射して、1つの魚から別の腫瘍細胞を移植することは可能ですが、21日後の免疫システムの再生には、多くの場合、腫瘍の退縮5を引き起こします。同系ゼブラフィッシュの最近の作成 ​​が大幅に腫瘍移植の研究6-8を促進してきた。これらの動物は、遺伝的に同一、移植腫瘍細胞であるため、レシピエントの魚、および腫瘍の成長に確実に生着は、長期間にわたって監視することができます。同系のゼブラフィッシュは、自己再生細胞の周波数9、10を過小評価することが外国の微小環境で成長、に適応する必要がない腫瘍細胞に希釈移植アッセイを制限するために最適です。また、1セルの移植は成功し自己複製細胞頻度のより正確な見積もりを提供するために役立つ、どちらも同系ゼブラフィッシュ8および数百の動物が容易にかつ経済的に一度に移植することができますが、使用して完了しています。 ここで、メソッドは、同系のゼブラフィッシュの主要な、蛍光標識したT細胞急性リンパ芽球性白血病を（T - ALL）の作成、および自己複製細胞の頻度を決定するために、成魚に限界希釈法でこれらの腫瘍を移植するために提示されます。白血病は、例として提供されていますが、このプロトコルは、ゼブラフィッシュのすべてのがんモデルを用いて腫瘍増殖細胞の頻度を決定するために適しています。

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

限界希釈細胞移植アッセイは、腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために使用されます。このプロトコルは、蛍光標識された白血病と成人のゼブラフィッシュの腹腔内に限界希釈法でこれらの白血病細胞を分離して移植する方法の詳細を開発する同系のゼブラフィッシュを生成するための方法を説明します。

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.1K ビュー.  Harvard Medical School. 限界希釈細胞移植アッセイは、腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために使用されます。このプロトコルは、蛍光標識された白血病と成人のゼブラフィッシュの腹腔内に限界希釈法でこれらの白血病細胞を分離して移植する方法の詳細を開発する同系のゼブラフィッシュを生成するための方法を説明します。

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

気管切開：肺へ幹細胞の移植方法

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...