Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

著者らは、この研究に利用されたRhipicephalus microplus ticksとLucas Karbanowiczのビデオ撮影の支援について、Biosecurity Tick Colony（Queensland Agriculture＆Fisheries、Australia）に感謝したい。

1. R. microplusからのGut上皮の解剖<ol><li>実験の日に牛の半虫歯のダニを集める。宿主から取り出した後24時間以内にダニを解剖する。 </li><li> 92 mm×16 mmのペトリ皿の底にダクトテープのストリップを貼り付けます。スーパーグルーをテープに追加してください。ティックを腹側をスーパーグルーの上に置き、2分間乾燥させる。 </li><li> 100mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をペトリ皿に注ぎ、またはダニが完全に沈むまで。 </li><li>サイズ11のメスを使用して、目の上から下の祝祭に、ダニの両側を切ります。 </li><li>滅菌鉗子を使用して、完全に内部の器官を公開するために、 傷跡とalloscutumを削除します。 </li><li>汚染を防ぐために、細かい白い糸状の器官（気管）および他の膜を除去する。 </li><li>鉗子を使用して腸を取り除き、上部領域をつまみ、カーカス。他の組織が解剖されていないことを確認して、残りの腸組織を除去する。 </li><li>塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含まない氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を入れて腸管を保管する。ガットをドライアイスで凍らせ、-20℃で保存する。 注：腸内臓の切開および内臓器官の詳細を補助するために、D. Sonenshineの第3.1章、「生物学の目録」 19を参照のこと 。 </li></ol> 2.上皮細胞の解離<ol><li>解剖した腸を50 mLチューブの中の70μmセルストレーナーに注ぎます。 </li><li>溶液が透明になるまで腸組織をPICで50mLの氷冷HBSSで洗い流し、腸が白く/澄んだ外観になるようにする。 </li><li> PICを含む30 mLの氷冷HBSS中で腸を再懸濁し、穏やかに混合し、4℃で500 xgで10分間遠心して腸をペレット化する。上清を除去し、洗浄プロセスを3回繰り返す。 </li><l（DMEM）、2％ウシ胎仔血清（FCS）、0.5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMトリス（2mM）、​​10mMトリス-HCl （TCEP）、PICを添加し、6rpmのローラーを用いてゆっくりと回転させながら37℃で60分間インキュベートする。 </li><li>懸濁液を250μmの細胞ストレーナでろ過し、フロースルーをボルテックスし、70μmの細胞ストレーナに通して残りのフロースルーを集める。 </li><li>懸濁液を4℃で500 xgで20分間遠心分離して、単一細胞をペレット化する。 </li></ol>密度遠心分離勾配を用いた単一上皮細胞の単離<ol><li> AP15プレフィルターペーパーでろ過することにより、密度遠心分離勾配（ 例えば 、Percoll）を調製する。 mqH 2 0（v / v）中の40％および20％パーコールを調製し、4℃で1時間冷却してから、勾配を層状にする。 </li><li>蠕動の使用ポンプを最低速度でセットし、層3mLの40％密度遠心分離勾配を16mL超遠心管に入れ、氷上で15分間静置する。ポンプの速度は、1分あたり1mL未満の流速につながるはずです。 </li><li>チューブを45°の角度に傾け、蠕動ポンプを使用して40％層の上に20％密度の遠心分離勾配を層状にする。ポンプの速度は1分あたり1mL以下の流量になるはずです。層を氷上で15分間静置する。 </li><li>蠕動ポンプを流速1mL以下で使用して、20-40％密度遠心分離勾配上にダニ腸細胞を含むDMEM培地3mLを層状にする。 </li><li>最大加速と最小減速のために遠心機をプログラムします。 600×gで10分間遠心分離する。 DMEM：20％密度遠心分離勾配と20％：40％密度遠心分離勾配との間の中間相を収集し、上皮単細胞を単離する。その後の分析のために収集した中間相を4℃で保存する。 </li></ol><html> 4.細胞単離の評価<ol><li> 血球計算盤 <ol><li>赤血球計スライドをアルコールできれいにする。 </li><li>細胞を静かに上下にピペッティングして細胞を再懸濁する。 100μLの細胞懸濁液をピペットし、1.5mLのマイクロ遠心チューブに入れる。 </li><li> 400μLの0.4％トリパンブルーを加える。チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。 </li><li>トリパンブルー処理した細胞懸濁液100μLをピペットして、血球計の両室をゆっくりと満たす。 </li><li> 10倍の対物レンズを備えた血球計のグリッドラインに焦点を当て、光学顕微鏡下に血球計を置く。 </li><li>ハンドヘルドタリーカウンターを使用して、16個の正方形のセット内の生きていない染色されていない細胞を数えます。同じ広場内で、青色の死んだ細胞を数えます。 16個の四角形の4つのセットがカウントされるまでカウントを続けます。 </li><li>次の式を使用して、mLあたりの総細胞数を計算します。 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li>次の式を使用して、細胞の生存率を計算します。 <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li> 細胞分離の可視化 <ol><li>単離した細胞1μLをHBSS 9μLに1.5 mLのマイクロ遠心チューブで希釈します。微量遠心チューブを軽くたたいて混合します。 </li><li>スライドガラスの中央にHBSS中の単離された細胞5μLをピペットで加える。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて3滴のマウント媒体を塗布する。 </li><li>スライドを室温で5分間インキュベートする。気泡を避けて、慎重に準備の上にカバースリップを置きます。 </li><li> DAPIで染色した細胞を蛍光顕微鏡下で励起360nm、発光460nmで可視化する。 </li></ol></li></ol> 5.細胞表面タンパク質ビオチン化<ol><li>ビオチン化ビオチン（タイプA）コンジュゲーションを用いた100μLの単細胞上皮細胞キットに、製造者の指示に従って、1：1の表面タンパク質とコンジュゲートのモル比</li><li>細胞溶解のために、100μLのPBS、1％Triton X-100,10％グリセロール、100μM酸化型グルタチオンおよびPICをビオチン化細胞に加える。 10分ごとに穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートする。 </li><li>ビオチン化細胞を20,000 xgで4℃で20分間遠心分離し、不溶性物質をペレットにします。細胞質およびビオチン化膜タンパク質を含む上清を集める。 </li><li> Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 6.ビオチン化表面タンパク質の単離<ol><li> 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに50μLのストレプトアビジン磁性ビーズを加えます。 </li><li>チューブを磁気スタンドに入れ、ビーズをチューブの側面に集めます。上清を除去して捨てる。 </li><li> 1000μLのTBS、0.1％Tween-20をチューブに添加する。静かに混ぜて、磁性スタンでビーズを集めるd。上清を除去して捨てる。 </li><li> 40μgのビオチン化細胞表面タンパク質を、洗浄した磁気ビーズを含む1×PBS中で300μLに希釈する。撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 </li><li>磁気スタンドでビーズを回収し、上清を除去して捨てる。 </li><li>チューブに300μLのTBS、0.1％Tween-20を加え、穏やかに混合してビーズを再懸濁する。ビーズを回収し、上清を除去し、廃棄する。この洗浄工程を2回繰り返す。 </li><li> 100μLの0.1MグリシンpH2.0を磁気ビーズに添加し、室温で5分間インキュベートする。ビーズを回収し、溶出したビオチン化表面タンパク質を含む上清を除去する。 </li><li> 4〜20％Tris-MOPS SDS-PAGEゲル上で分離した表面タンパク質を可視化する。 </li></ol>ビオチン化表面タンパク質の評価<ol><li> ドットブロット <ol><li>ニトロセルロース膜の7cm×3cmのストリップを切断する。 </li><li>合計10μgを適用するt含有量（上記1.8から）、および10μgのビオチン化表面タンパク質を膜に添加した。室温で15分間乾燥させる。 </li><li>容器に移し、100mLのブロッキングバッファーに浸す。攪拌しながら室温で1時間インキュベートする。ブロッキングバッファーを破棄します。 </li><li>攪拌しながら100μLのPBS、0.05％Tween-20中でニトロセルロース膜を5分間洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。 </li><li> 100μLのPBS、0.05％Tween-20中の1/5000ストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を室温で2時間インキュベートし、残りの溶液を捨てる。 </li><li>ニトロセルロース膜を100μLのPBS、0.05％Tween-20中で5分間攪拌しながら洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。 </li><li>検出のために、4-クロロ-1-ナフトール1錠を10mLの氷冷メタノールに溶解する。メタノールストック4mLを20mLのTBSに加える。 10μLの新鮮な30％過酸化水素とイミドニトロセルロース膜に適用する。 </li><li>基質が不溶性青色最終生成物を生成するまで、室温で攪拌しながらインキュベートする。これには2〜15分かかります。 </li><li>検出溶液を捨て、膜を100μLのmqH 2 Oで3回洗浄する。 </li></ol></li><li> ELISAアッセイ <ol><li> 200 ngの各サンプルを100 mM炭酸塩コーティングバッファー400μLで希釈し、ELISAプレート（平底ウェル）の最初の列（A＃）の2レーンをコートし、 </li><li>列（BH）の他のすべての対応するウェルに100mM炭酸塩コーティングバッファー100μLを加えます。 </li><li>行Aの各ウェルから100μLをピペッティングし、行Bに移すことによって、各サンプルの連続希釈物を調製する。ピペットで穏やかに混合し、泡を発生させない。行Hの各ウェルから最後の100μLを捨てて、各列の希釈を繰り返す。 </li><li>プレートをパラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>板を洗う200μLのPBS、0.05％Tween-20 /ウェルで3回洗浄した。 </li><li>コーティングしたウェルに200μLのブロッキングバッファーを加え、Parafilmで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で1 / 15,000のストレプトアビジン-HRPを希釈し、100μLをプレートの各ウェルに加える。パラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ウェルあたり200μLのPBS、0.05％Tween-20でプレートを5回洗浄する。 </li><li>検出するために、1ウェル当たり100μLのTMB試薬を加える。十分な発色の後、通常10〜15分の間に、100μLの1Mリン酸を加えて反応を停止させる。 </li><li> λ= 450nmで各ウェルの吸光度を読み取る。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. 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著者は何も開示することはない。

蔓延をチェック牛が殺ダニ剤1、4の使用に頼るコントロールの最も一般的な方法で、世界の熱帯・亜熱帯地域で家畜産業にとって大きな問題となります。 Bm86は、以前に起因するBm86地理的配列変異と通常は4を昇圧する要件へのワクチン戦略として限られた成功を収め、R.のmicroplusの侵入に対する保護10抗原?...

それはウシダニ熱（バベシア症）、アナプラズマおよびウマピロプラズマ病1、2、3、4をベクターとして牛がダニリピセファルスmicroplusは 、熱帯及び亜熱帯地域の家畜産業上の経済的影響の点で最も重要な外部寄生虫です。化学殺ダニ剤の使用のような従来の方法は、ミルクおよび肉の化学的残留物の存在、化学的に耐性のあるマダニの有病率の増加などの暗黙の欠点を有するが、有害作用を減少させるために、ウシのダニ防除に努力が払われてきた5、6、7。その結果、耐性牛、生物学的防除（バイオ農薬）およびワクチンの使用など、ダニ防除の代替法の開発が研究されているINES 4、5、6、7、8、9。 ワクチン候補として利用できるタンパク質の追求において、現在の研究はダニの腸に焦点が当てられている。中腸壁は、基底板の外側が筋肉のネットワークを形成しながら、薄い基底板上に載っている上皮細胞の単一層から構築される。光および電子顕微鏡観察は、中腸が予備細胞（未分化細胞）、分泌細胞および消化細胞の3つのタイプからなることを示している。細胞型の数は、生理学的相によってかなり異なる。分泌及び消化細胞は予備セル18、19、20に由来両方。 cDNAライブラリーの構築ダニ腸の組成物は、潜在的なワクチン候補2、3、4のように、そのようなBm86などの抗原性タンパク質の同定につながっている調べました。糖タンパク質Bm86はダニ腸細胞の表面に局在し、ワクチン接種された牛のウマダニ （ R. microplus ）に対する防御免疫応答を誘導する。免疫された宿主により産生された抗Bm86 IgGは、ダニによって摂取され、ダニ腸細胞の表面上でこの抗原を認識し、その後ダニ腸組織の機能および完全性を妨げる。 Bm86抗原に基づくワクチンは、萌芽雌の数、体重および生殖能力を低下させることにより、 R. microplusおよびRhipicephalus annulatusの効果的な防除を示し、その後のダニ世代において幼虫の蔓延を減少させる4 。しかし、Bm86ベースのワクチンはすべてのティックステージに対して有効ではなく、R.のmicroplusのいくつかの地理的な株に対する不満足な有効性を示し、その結果、牛肉及び酪農産業が乏しいこれらのワクチン2,4を採用しています。 ダニの腸から上皮細胞を単離する能力は、異なる環境条件下での形態学および生理学を含むタンパク質膜組成を決定する研究の進行を可能にする重要な革新である。本明細書に記載の方法は、キレート剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および還元剤トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を利用して、その上皮支持組織10から上皮を放出させる。上皮は、振盪による組織の機械的破壊、続いてPercollにおける不連続勾配遠心分離の後に回収される。本稿では、ダニ腸内分泌腺の単離のための実現可能かつ新規な技術について述べる。真菌細胞。これらの上皮細胞の表面から単離されたビオチン化細胞表面タンパク質は、その後、FACSおよび/またはLC-MS / MS分析などの下流の用途で分析され得る。

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td></tr><tr><td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td><td>Cool in ice prior to gradient</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Stored at 4C</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>Labscene</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Tris-MOPS Gel</td><td>Gen Script</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Corning Blue</td><td></td><td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 filter paper</td><td>Millipore</td><td>AO1504200</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>2.2.1.195</td><td>Cell imagery software</td></tr><tr><td>Duct Tape</td><td>Home Handyman</td><td></td><td>48mm x 25mm Duct Tape</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - ice cold for protocol</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#9 Dumont - Switerzland</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol for molecular biology &gt;99%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Counter</td><td>Officeworks</td><td>JA0376230</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>H9394</td><td>HBSS &amp;ndash; ice cold for protocol</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Optik Lakor</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>L-Glutathione oxidized</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Separation Stand</td><td>Novagen</td><td>-</td><td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Water</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Life Sciences</td><td>66485</td><td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein Ladder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td><td>Thermo-Scientific</td><td>37573</td><td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &amp;ndash; stored at -20 &lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;C</td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>For Bradford Assay</td></tr><tr><td>Quick Start BSA Standards</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>BSA standards for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lab. Co</td><td></td><td>Size 11 Scalpel</td></tr><tr><td>SilverQuest TM Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM Safe Stain&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td><td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td><td>UHU</td><td></td><td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td></tr><tr><td>Table-top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - 家畜ダニ - いくつかの病原体のベクターとしての家畜への経済的影響の観点から、最も重要な外部寄生生物である。ダニ腸管上皮細胞の表面上に位置するBM86などのワクチン候補の発見に焦点を当てて、その有害な影響を減少させるための牛ダニ制御に努力が払われてきた。現在の研究は、他のワクチン候補をスクリーニングするために、cDNAおよびゲノムライブラリーの利用に焦点を当てている。ダニ腸細胞の単離は、ダニ腸細胞膜上の表面タンパク質の組成を調べる上で重要な利点を構成する。この論文は、半エンボスされたR. microplusのダニの腸内容物から、上皮細胞を単離するための新規かつ実行可能な方法を構成する。このプロトコルは、上皮細胞を上皮支持組織から放出させるためにTCEPおよびEDTAを使用し、不連続密度遠心分離グラジエント他の細胞型から上皮細胞を分離することができる。 FACSまたはLC-MS / MS分析での下流の適用を可能にするストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いて、細胞表面タンパク質をビオチン化し、ダニ消化管上皮細胞から単離した。

R. microplusの腸組織から上皮細胞を単離した（ 図1） 。 このプロトコールを用いて調製したダニ腸上皮細胞の代表的蛍光顕微鏡画像を図2Aに示す 2B。 セミエンゴールR.マイクロプラスで細胞単離を行うと、細胞は、特異的、球状、平滑な表面形態およ?...

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

9.4K ビュー.  The University of Queensland.  Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。 

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A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

がん研究

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

生化学

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

生物工学

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

遺伝学

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

生物学

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

免疫・感染学

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

神経科学

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

細胞表面ビオチン化アッセイ

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

細胞生物学

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

ビオチン誘導体を用いた標的表面タンパク質のインターナリゼーションの評価

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製

要約

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この動画の章

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

セルベースのL-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

細胞表面ビオチン化アッセイ

ビオチン誘導体を用いた標的表面タンパク質のインターナリゼーションの評価

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製

要約

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ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

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リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

細胞表面ビオチン化アッセイ

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ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

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