Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

Die Autoren möchten den Biosicherheit Tick Colony (Queensland Department of Agriculture &amp; Fischerei, Australien) für die Bereitstellung von Rhipicephalus Zecken micro für diese Studie verwendet, und Lucas Karbanowicz für die Unterstützung bei der Videoaufnahme danken.

1. Dissektion des Darm-Epithels aus R. microplus <ol><li> Sammeln Sie am Tag des Experiments halb engagierte Zecken aus Rindern. Dissect-Ticks innerhalb von 24 Stunden nach dem Entfernen vom Wirt. </li><li> Kleben Sie einen Streifen Klebeband auf den Boden der 92 mm x 16 mm Petrischale. Füge dem Tape einen Tropfen Superleim hinzu. Legen Sie die Zecke, ventral Seite nach unten auf den Super-Leim, lassen Sie für 2 min trocknen. </li><li> 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Petrischale geben oder bis die Zecke vollständig eingetaucht ist. </li><li> Unter Verwendung einer Skala der Größe 11, schneiden Sie von der Oberseite der Augen zu den unteren Girlanden, auf beiden Seiten der Zecke. </li><li> Mit sterilen Pinzetten, entfernen Sie vollständig das Scutum und alloscutum , um die inneren Organe freizulegen. </li><li> Entfernen Sie die feinen weißen fadenähnlichen Organe (Trachea) und andere Membranen, um eine Kontamination zu vermeiden. </li><li> Den Darm mit einer Pinzette entfernen, indem man den oberen Bereich einklemmt und aus demKarkasse. Entfernen Sie alle verbleibenden Darmgewebe, um sicherzustellen, dass keine anderen Gewebe seziert wurden. </li><li> Dose in eiskalter Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumsulfat mit Proteinase-Inhibitor Cocktail (PIC) aufbewahren. Schnappen Sie den Eingeweide in Trockeneis ein und lag bei -20 ° C auf. Anmerkung: Zur Unterstützung der Darmdissektion und Details der tick inneren Organe siehe Kapitel 3.1 von D. Sonenshine, &quot;Biologie der Zecken&quot; 19 . </li></ol> 2. Epithelzelldissoziation <ol><li> Gießen Sie den sezierten Darm auf einen 70 μm Zellsieb in einem 50 mL Röhrchen. </li><li> Spülen Sie das Darmgewebe mit 50 mL eiskaltem HBSS mit PIC, bis die Lösung klar läuft und die Eingeweide ein weißes / klares Aussehen annehmen. </li><li> Den Magen in 30 mL eiskaltem HBSS mit PIC suspendieren, vorsichtig mischen und bei 500 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren, um den Darm zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal. </li><lI&gt; Um epitheliale Darmzellen zu entfernen, suspendieren Sie den Darm in 10 ml Zellkulturmedium Dulbecco&#39;s modifiziertes Adlermedium (DMEM), 2% fötales Kälberserum (FCS), 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Tris (2 -carboxyethyl) phosphin (TCEP), PIC und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter langsamer Rotation unter Verwendung einer Walze bei 6 U / min. </li><li> Filtriere die Suspension durch einen 250 μm-Zellsieb, verwirre den Durchfluss und filtriere durch einen 70 μm-Zellsieb, der den verbleibenden Durchfluss sammelt. </li><li> Die Suspension bei 500 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um die einzelnen Zellen zu pelletieren. </li></ol> 3. Isolierung einzelner Epithelzellen unter Verwendung eines Dichte-Zentrifugationsgradienten <ol><li> Den Dichte-Zentrifugationsgradienten ( zB Percoll) durch Filtrieren durch ein AP15-Vorfilterpapier vorbereiten. 40% und 20% Percoll in mqH 2 0 (v / v) vorbereiten und bei 4 ° C für 1 h abkühlen, bevor der Gradient geschichtet wird. </li><li> Mit einem peristaltischenPumpe auf die niedrigste Geschwindigkeit eingestellt, Schicht 3 ml von 40% Dichte Zentrifugation Gradient in ein 16 mL Ultrazentrifugenröhrchen, so dass es auf Eis für 15 min absetzen. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu einer &lt;1 mL pro Minute Durchflussmenge führen. </li><li> Kippen des Rohres in einen 45 ° -Winkel, verwenden Sie die peristaltische Pumpe, um den 20% Dichte-Zentrifugationsgradienten auf der 40% -Schicht zu schichten. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu &lt;1 mL pro min Durchfluss führen. Lassen Sie die Schichten 15 Minuten lang auf Eis absetzen. </li><li> Verwenden Sie die peristaltische Pumpe bei &lt;1 mL pro Minute Durchflussmenge auf Schicht 3 ml DMEM-Medium, das Tick-Darmzellen über dem 20-40% Dichte-Zentrifugationsgradienten enthält. </li><li> Programmieren Sie die Zentrifuge für maximale Beschleunigung und minimale Verzögerung. Zentrifuge bei 600 xg für 10 min. Sammeln Sie Interphasen zwischen dem DMEM: 20% Dichte-Zentrifugationsgradient und den 20%: 40% Dichte-Zentrifugationsgradienten, um epitheliale Einzelzellen zu isolieren. Lagern Sie gesammelte Zwischenphasen bei 4 ° C für nachfolgende Analysen. </li></ol><html> 4. Bewertung der Zellisolation <ol><li> Hemacytometer <ol><li> Reinigen Sie den Hämacytometer mit Alkohol. </li><li> .Entfernen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren der Zellen nach oben und unten. 100 μl der Zellsuspension pipettieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben. </li><li> Fügen Sie 400 μl 0,4% Trypan Blue hinzu. Vorsicht mischen, indem man die Röhre schlägt. </li><li> 100 μl der mit Trypan Blue behandelten Zellsuspension pipettieren, um langsam beide Kammern des Hämocytometers zu füllen. </li><li> Legen Sie das Hämocytometer unter ein Lichtmikroskop und fokussieren auf die Gitterlinien des Hämocytometers mit einem 10fachen Objektiv. </li><li> Mit einem Hand-Tally-Zähler zählen die lebenden ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Quadraten. Innerhalb des gleichen Platzes zählen die blauen toten Zellen. Weiterzählen, bis vier Sätze von 16 Quadraten gezählt werden. </li><li> Berechnen Sie die Gesamtzellen pro ml mit der Formel: 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Berechnen Sie die prozentuale Zelllebensfähigkeit anhand der Formel: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Zelle isolieren Visualisierung <ol><li> 1 μl der isolierten Zellen in 9 μl HBSS in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen. Das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig mischen. </li><li> 5 μl isolierte Zellen in HBSS in die Mitte einer Glasrutsche pipettieren. Tragen Sie drei Tropfen Montagemedium mit 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) auf. </li><li> Inkubieren Sie den Objektträger bei Raumtemperatur für 5 min. Setzen Sie sorgfältig einen Deckel über die Vorbereitung, Vermeidung von Luftblasen. </li><li> Visualisierung der mit DAPI gefärbten Zellen bei Anregung 360 nm und Emission bei 460 nm unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 5. Zelloberflächenprotein-Biotinylierung <ol><li> Biotinylierung von 100 &amp; mgr; l Einzelzell-Epithelzellen unter Verwendung von Biotin (Typ A) KonjugationKit, bei einem Molverhältnis von 1: 1 Oberflächenprotein zu konjugieren, wie nach Herstellerangaben </li><li> Für die Zelllyse werden 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 100 μM oxidiertes Glutathion und PIC zu den biotinylierten Zellen gegeben. Inkubieren auf Eis für 1 h mit sanften Mischen alle 10 min. </li><li> Die biotinylierten Zellen bei 20.000 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um unlösliches Material zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der zytoplasmatische und biotinylierte Membranproteine ​​enthält. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. </li></ol> 6. Isolierung von biotinylierten Oberflächenproteinen <ol><li> 50 μl Streptavidin-Magnetperlen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben. </li><li> Legen Sie den Schlauch in einen Magnetständer und sammeln die Perlen gegen die Seite des Rohres. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Füge 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen hinzu. Mischen Sie sanft und sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen StanD. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Kombinieren Sie 40 μg biotinylierte Zelloberflächenproteine, verdünnt auf 300 μl in 1x PBS mit gewaschenen magnetischen Kügelchen. Inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren. </li><li> Die Perlen mit einem Magnetständer sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen. </li><li> Zugabe von 300 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen, sanftes Mischen zur erneuten Suspendierung der Perlen. Perlen sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. </li><li> 100 &amp; mgr; l des 0,1 M Glycin pH 2,0 zu den magnetischen Kügelchen geben und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Sammeln Sie Perlen und entfernen Sie den Überstand, der eluierte biotinylierte Oberflächenproteine ​​enthält. </li><li> Visualisiere isolierte Oberflächenproteine ​​auf einem 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE-Gel. </li></ol> 7. Bewertung von biotinyliertem Oberflächenprotein <ol><li> Dot Blot <ol><li> Schneiden Sie einen 7 cm x 3 cm Streifen Nitrozellulosemembran. </li><li> Tragen Sie 10 μg total Tick GuT-Gehalt (ab 1.8) und 10 μg biotinyliertes Oberflächenprotein an die Membran. Trocknen 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen. </li><li> Übertragen Sie in einen Container und tauchen Sie in 100 ml Blockierpuffer ein. Inkubieren bei Raumtemperatur unter Rühren für eine Stunde. Blockierpuffer verwerfen </li><li> Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren waschen. Verwerfen Sie Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschungen für dreimal. </li><li> Inkubieren in 1/5000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 2 h unter Rühren bei Raumtemperatur und entsorgen jede verbleibende Lösung. </li><li> Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren abwaschen. Waschpuffer verwerfen und dreimal wiederholen. </li><li> Zum Nachweis 1 Tablette 4-Chlor-1-napthol in 10 ml eiskaltem Methanol auflösen. Füge 4 ml Methanol-Stamm zu 20 ml TBS hinzu. Füge 10 μl frisches 30% iges Wasserstoffperoxid und sofort hinzuGelten für Nitrozellulosemembran. </li><li> Inkubieren unter Rühren bei Raumtemperatur, bis Substrat ein unlösliches blaues Endprodukt erzeugt. Dies kann zwischen 2-15 min dauern. </li><li> Die Erkennungslösung entsorgen und die Membran dreimal in 100 μl mqH 2 O waschen. </li></ol></li><li> ELISA-Assay <ol><li> Verdünnen Sie 200 ng jeder Probe mit 400 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer und beschichten Sie 2 Bahnen der ersten Reihe (A #) der ELISA-Platte (flache Bodenwannen) </li><li> Füge 100 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer zu allen anderen entsprechenden Vertiefungen in Reihen (BH) hinzu. </li><li> Vorbereiten der seriellen Verdünnungen jeder Probe durch Pipettieren von 100 &amp; mgr; l von jeder Vertiefung in Reihe A und Übertragen in Reihe B. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und vermeiden Sie die Herstellung von Blasen. Wiederholen Sie die Verdünnungen in jeder Zeile, wobei die letzten 100 &amp; mgr; l aus jeder Vertiefung in der Reihe H entsorgt werden. </li><li> Die Platte mit Parafilm bedecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren. </li><li> Waschen Sie die PlatE mit 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Well dreimal. </li><li> 200 μl Blockierungspuffer zu den beschichteten Vertiefungen geben, mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren. </li><li> 1 / 15.000 Streptavidin-HRP in Blockierungspuffer verdünnen und 100 μl zu jeder Vertiefung der Platte hinzufügen. Mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Platte in 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Brunnen fünfmal. </li><li> Um zu detektieren, fügen Sie 100 &amp; mgr; l TMB-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Nach einer ausreichenden Farbentwicklung, üblicherweise zwischen 10-15 min, werden 100 μl 1 M Phosphorsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. </li><li> Lesen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei λ = 450nm. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Vieh-Tick-Befall stellt ein großes Problem für die Viehwirtschaft in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar, wobei die gängigste Methode der Kontrolle von der Verwendung von Akariziden 1 , 4 abhängig ist. Bm86 wurde zuvor innerhalb der Tick-Darm-Epitheloberfläche als Schutz-Antigen gegen R. microplus- Befall 10 identifiziert, mit begrenztem Erfolg als Impfstrategie aufgrund der Bm86-geographischen Sequenzvariatio...

Rhipicephalus microplus , die Viehzuttel, ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomische Auswirkung auf die Viehwirtschaft der tropischen und subtropischen Regionen, da sie Rinder-Tick-Fieber (Babesiose), Anaplasmose und pferdeartige Piroplasmose 1 , 2 , 3 , 4 . Es wurden Anstrengungen zur Rindertickkontrolle unternommen, um die schädliche Wirkung zu verringern, aber herkömmliche Verfahren wie die Verwendung von chemischen Akariziden haben implizite Nachteile, wie das Vorhandensein von chemischen Rückständen in Milch und Fleisch und die Zunahme der Prävalenz von chemisch resistenten Zecken 5 , 6 , 7 Folglich wurde die Entwicklung alternativer Methoden der Zeckenkontrolle untersucht, wie die Verwendung von natürlichen Resistenzvieh, biologische Kontrolle (Biopestizide) und VaccInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Bei der Verfolgung von Proteinen, die als Impfstoffkandidaten verwendet werden können, konzentriert sich die aktuelle Forschung auf den Tick Darm. Die Mittelgutwand ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen aufgebaut, die auf einer dünnen Basallamelle ruht, wobei die Außenseite der Basallamina ein Netz von Muskeln bildet. Licht- und Elektronenmikroskop Beobachtungen zeigen, dass die Midgut besteht aus drei Arten von Zellen: Reserve (undifferenziert), sekretorischen und Verdauung. Die Anzahl der Zelltypen variiert in Abhängigkeit von der physiologischen Phase erheblich. Sekretorische und Verdauungszellen stammen beide aus Reservezellen 18 , 19 , 20 . Der Aufbau von cDNA-BibliothekenUm die Zusammensetzung des Zeckendarms zu untersuchen, hat zur Identifizierung von antigenen Proteinen wie Bm86 als potentielle Impfstoffkandidaten 2 , 3 , 4 geführt . Das Glykoprotein Bm86 ist an der Oberfläche der Tick-Darmzellen lokalisiert und induziert eine schützende Immunantwort gegen die Rindertick ( R. microplus ) bei geimpften Rindern. Anti-Bm86-IgGs, die durch den immunisierten Wirt produziert werden, werden von der Zecke eingenommen, erkennen dieses Antigen auf der Oberfläche von Tick-Darmzellen und stören anschließend die Tick-Darm-Gewebefunktion und die Integrität. Impfstoffe basieren auf Bm86 Antigene wirksame Kontrolle von R. micro und Rhipicephalus annulatus, in einem reduzierten Larvenbefall durch die Verringerung der Zahl, Gewicht und Fortpflanzungsfähigkeit von Verschlingen Weibchen, was 4 in nachfolgenden Generationen tick gezeigt. Allerdings sind Bm86-basierte Impfstoffe nicht wirksam gegen alle Tick-Stufen und habenZeigte eine unbefriedigende Wirksamkeit gegen einige geographische Stämme von R. microplus , folglich haben die Rindfleisch- und Milchindustrie diese Impfstoffe schlecht angenommen 2 , 4 . Die Fähigkeit, Epithelzellen aus dem Tick-Darm zu isolieren, ist eine signifikante Innovation, die es ermöglicht, die Projektion der Forschung zu bestimmen, um die Proteinmembranzusammensetzung einschließlich Morphologie und Physiologie unter verschiedenen Umgebungsbedingungen zu bestimmen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und das Reduktionsmittel Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), um das Epithel aus seinen subepithelialen Trägergeweben 10 freizusetzen. Das Epithel wird nach mechanischer Zerstörung der Gewebe durch Schütteln gewonnen, gefolgt von einer diskontinuierlichen Gradientenzentrifugation in Percoll. Dieses Papier beschreibt eine machbare und neuartige Technik für die Isolierung von Tick Darm epiThelialen Zellen Biotinylierte Zelloberflächenproteine, die von der Oberfläche dieser Epithelzellen isoliert wurden, können anschließend in nachgeschalteten Anwendungen wie FACS und / oder LC-MS / MS-Analyse analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td></tr><tr><td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td><td>Cool in ice prior to gradient</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Stored at 4C</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>Labscene</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Tris-MOPS Gel</td><td>Gen Script</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Corning Blue</td><td></td><td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 filter paper</td><td>Millipore</td><td>AO1504200</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>2.2.1.195</td><td>Cell imagery software</td></tr><tr><td>Duct Tape</td><td>Home Handyman</td><td></td><td>48mm x 25mm Duct Tape</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - ice cold for protocol</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#9 Dumont - Switerzland</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol for molecular biology &gt;99%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Counter</td><td>Officeworks</td><td>JA0376230</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>H9394</td><td>HBSS &amp;ndash; ice cold for protocol</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Optik Lakor</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>L-Glutathione oxidized</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Separation Stand</td><td>Novagen</td><td>-</td><td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Water</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Life Sciences</td><td>66485</td><td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein Ladder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td><td>Thermo-Scientific</td><td>37573</td><td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &amp;ndash; stored at -20 &lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;C</td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>For Bradford Assay</td></tr><tr><td>Quick Start BSA Standards</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>BSA standards for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lab. Co</td><td></td><td>Size 11 Scalpel</td></tr><tr><td>SilverQuest TM Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM Safe Stain&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td><td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td><td>UHU</td><td></td><td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td></tr><tr><td>Table-top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - die Rindertick - ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomischen Auswirkungen auf Viehbestand als Vektor von mehreren Krankheitserregern. Bemühungen wurden der Vieh-Tick-Kontrolle gewidmet, um ihre schädlichen Wirkungen zu verringern, wobei der Fokus auf die Entdeckung von Impfstoffkandidaten wie BM86, die sich auf der Oberfläche der Tick-Darm-Epithelzellen befinden, Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Nutzung von cDNA und genomischen Bibliotheken, um für andere Impfstoffkandidaten zu screenen. Die Isolierung von Tick-Darmzellen stellt einen wichtigen Vorteil bei der Untersuchung der Zusammensetzung von Oberflächenproteinen auf der Tick-Darm-Zellmembran dar. Dieses Papier stellt eine neuartige und machbare Methode für die Isolierung von Epithelzellen dar, von den Tick-Darm-Inhalten von halb engorgestem R. microplus . Dieses Protokoll nutzt TCEP und EDTA, um die Epithelzellen aus dem subepithelialen Stützgewebe und einem diskontinuierlichen Dichtezentrifugationsgradie freizusetzenNt, um Epithelzellen aus anderen Zelltypen zu trennen. Zelloberflächenproteine ​​wurden biotinyliert und aus den Tick-Darm-Epithelzellen isoliert, wobei Streptavidin-verknüpfte magnetische Perlen verwendet wurden, die nachgeschaltete Anwendungen in FACS- oder LC-MS / MS-Analyse erlaubten.

Epithelzellen wurden aus dem Darmgewebe von R. microplus gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Schema isoliert. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Tick-Darm-Epithelzellen, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, sind in Fig. 2A gezeigt Und 2B. Da die Zellisolation auf halb engorgestem R. microplus durchgef?...

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

9.4K Aufrufe.  The University of Queensland.  Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt. 

Serie: Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Forschung

Krebsforschung

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Biochemie

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Biotechnik

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Genetik

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biologie

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Immunologie und Infektion

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Neurowissenschaften

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Zellbiologie

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus

Zusammenfassung

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Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1^{- / -} Mäusen

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus

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Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1^{- / -} Mäusen