IP는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC # 418233-2012)의 지원을받습니다. Frans de Recherche du Québec-Santé (FRQS), Quebec Breast Cancer Foundation 경력 상 및 캐나다 재단 혁신 재단 (Canadian Foundation for Innovation)으로부터 Leader Founds 보조금을 받았다. ED는 Fondation 유니버설 Armand-Frappier에서 장학금을 받았습니다.

이 연구에서 사용 된 모든 동물 프로토콜은 University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada)의 승인을 받았습니다. 1. 단백질 공 동화 확인 <ol><li> 조직에서 현미경 슬라이드까지 참고 : 조직 및 섹션은 드라이 아이스로 처리해야합니다. <ol><li> 동물에서 유선을 절단하십시오 (이 절차에 대한 완전한 설명은 Plante et al. 참조 ) . 14 . </li><li> 드라이 아이스에 동결 / 장착 매체에 excised 조직을 삽입하십시오. 글 랜드를 덮기에 충분한 매질을 첨가하십시오. 배지가 고형화되면 나중에 -80 ℃에서 냉동실로 옮겨 조직을 만듭니다 9 . </li><li> cryomicrotome을 -35 ° C 이하로 설정하고 조직을 7-10 μm 두께의 절편으로 자르고 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 참고 : 가능하면 각 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치하십시오. 왼쪽 섹션은예를 들어 항체의 특이성과 조직의 자기 형광을 확인하기위한 예 통제. 오른쪽면은 항체로 표지됩니다. </li><li> 나중에 사용할 수 있도록 섹션을 -80 ° C에 유지하십시오. </li></ol></li><li> Co-IF 염색 <ol><li> 냉동고에서 적절한 현미경 슬라이드를 검색하고 즉시 실온 (RT)에서 15 분 동안 포름 알데히드 4 %에 담가 섹션을 수정. </li><li> 그런 다음 실온에서 인산염 완충 식염수 (PBS)에 슬라이드를 담그십시오. 다음 단계로 진행할 때까지 RT에서 PBS에 슬라이드를 남겨 둡니다. </li><li> 시중에서 구할 수있는 소수성 벽 또는 발수성 실험용 펜을 사용하여 슬라이드의 각 부분에 동그라미를 채 웁니다 (재료 표 참조). 조직을 만지지 않도록주의하십시오. 즉시 조직에 PBS 방울을 추가하고 프로 시저의 나머지 부분에 대한 습한 조직학 챔버에 슬라이드를 놓으십시오. 참고 : 조직 절편은 보습 상태를 유지해야합니다. 대안상자에 뚜껑이 달려 있고 바닥에 젖은 종이 타월을 둡니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) - 트리스 버퍼 식염수 (TBS) -0.1 % 폴리 소르 베이트 20 ( 표 2 참조)의 100-200 μL로 각 조직 섹션을 차단하십시오. 샘플이 차단되는 동안 TBS-0.1 % 폴리 소르 베이트 20에 항체를 희석하여 1 차 및 2 차 항체 용액을 준비하십시오. 참고 : 항체에 필요한 농도는 제조자가 제공한다; 예를 들어, 표 1 및 2 와 Dianati et al. 의 표를 참조하십시오 . 9 . 대부분의 형광 단 결합 항체를 사용할 때 어둠 속에서도 작업 할 필요는 없지만 항체 용액이나 염색 된 조직을 강렬하고 밝은 빛에 노출시키지 마십시오. </li><li> 흡인하여 차단 솔루션을 제거하고 RT에서 60 분 동안 희석 기본 항체 100-200 μL의 섹션을 품어. 대안y, 일차 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하십시오. </li><li> 흡인하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 250-500 μL와 섹션을 씻으십시오. 흡인으로 세척 용액을 제거하고 세척을 두 번 반복하십시오. </li><li> 흡인하여 세척 솔루션을 제거하고 RT에서 60 분 동안 적절한 fluorophore - 이차 항체 100-200 μL와 섹션을 품어. </li><li> 흡인하여 보조 항체 솔루션을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 250-500 μL와 섹션을 씻으십시오. 세척 용액을 제거하고 두 번 반복하십시오. </li><li> 관심 단백질 (들)에 대한 기본 및 보조 항체의 적절한 조합을 사용하여 2.5-2.8 단계를 반복합니다. </li><li> 흡인하여 세척 용액을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20에 1 밀리그램 / ML 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)의 100-200 μL와 섹션 잠복하여 핵 얼룩을 수행RT. </li><li> 흡인으로 DAPI 솔루션을 제거하고 수용성, 비 형광 마운트 매체 (자료 참조) 및 coverslips를 사용하여 슬라이드를 마운트합니다. 한 번에 한 슬라이드 씩 진행하십시오. 참고 : 핵 얼룩을 5 분 이상 배양해도 염색의 강도는 변하지 않습니다. 또는 모든 슬라이드에서 DAPI 솔루션을 제거하고 슬라이드를 장착하는 동안 PBS에서 조직을 품어. </li><li> 적어도 8 시간 동안 4 ° C의 냉장고에 슬라이드를 평평하게 놓습니다. 형광 현미경 이미징 ( 그림 1과 2 참조)로 진행하십시오. </li></ol></li><li> 현미경 이미징 <ol><li> 특정 파장에서 형광 물질을 여기시키는 데 필요한 다양한 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경을 사용하여 형광 물질이 결합 된 2 차 항체를 시각화합니다. 참고 : 덕트 및 폐포를 시각화 할 수 있도록 0.95의 개구 수를 가진 40X 대물 렌즈가 제안됩니다. example는 그림 1 에 나와 있습니다. </li><li> 한 번에 한 파장의 이미지를 스캔하여 각 단백질의 위치를 ​​개별적으로 확인하십시오. 참고 :이 단계에서 접합 단백질의 위치를 ​​비판적으로 분석하는 것이 중요합니다. junctional 넥서스를 형성 할 수 있으려면 이러한 단백질이 원형질막에 국한되어야합니다. </li><li> 서로 다른 파장의 레이저로 스캔 한 이미지를 병합하여 단백질의 공동 위치를 결정합니다. 참고 : 동일한 위치에서 2 개 이상의 형광체 방출로 인한 색상 변화로 단백질 공 동화를 시각화 할 수 있으며 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정 할 수 있습니다 ( 그림 1 및 2 , 참고 자료 9 참조). </li></ol></li></ol> 2. PPI 연구 주 : 가슴 땀샘은 가슴과 밀접한 관련이 있기 때문에 복부 유방 땀샘을 사용하여 PPI를 연구해야합니다.근육. 유방 땀샘을 잘라내어 (이 절차에 대한 자세한 설명은 Plante et al . 참조) 14 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관하십시오. <ol><li> 용 해물 준비 <ol><li> 다음 단계를 진행하기 전에 드라이 아이스에 계량 종이와 2 mL 미세 원심 분리 튜브를 넣어 사전 냉각하십시오. </li><li> -80 ° C에서 유선 조직을 가져 와서 드라이 아이스에 보관하십시오. </li><li> 미리 냉각 된 계량 종이에서 조직의 무게를 측정 한 다음 조직을 2 mL 미세 원심 분리 튜브 (드라이 아이스 처리)로 옮깁니다. 시료 당 50 ~ 100mg의 조직을 사용하십시오. 단계 2.1.5까지 조직을 드라이 아이스에 보관하십시오. </li><li> NaF, NaVO 3 및 protease / phosphatase inhibitor가 첨가 된 3 중 세제 용해 완충액을 다음 표에 나와있는 재료 표에 나와 있는대로 필요한 양으로 준비하십시오. 마우스 : 필요한 완충액 (μL) = 마우스 조직 중량 (mg) x 3; 쥐 : 필수완충액 (μL) = 래트 조직 중량 (mg) × 5. </li><li> 조직이 들어있는 2mL 튜브에 필요한 양의 얼음처럼 차가운 용해 완충액 (단계 2.1.4에서 계산)을 첨가합니다. 참고 : 2.1.5-2.1.6 단계에서 한 번에 하나의 튜브로 진행하십시오. </li><li> 조직 분쇄기에서 연속 균질화를 사용하여 30-40 초 동안 조직을 균질화하십시오. 항상 얼음에 튜브를 유지. 조직 균질기를 중간 속도로 조정하고 부드럽게 분쇄기를 튜브 내부에서 위아래로 움직입니다. </li><li> 다른 튜브와 함께 1.6 및 1.7 단계를 반복하십시오. </li><li> lysate를 10-30 분 동안 얼음에 품습니다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 170 Xg에서 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 그 사이에, 각 견본을위한 6-10의 microcentrifuge 관 (0.6 ML)를 확인하고 그들을 얼음에 붙드십시오. </li><li> 원심 분리가 끝나면 튜브를 확인하십시오. 이 물질에 발달 단계에 따라 뚱뚱하고 깨끗한 황색에서 분홍색의 용 해물과 펠릿이 최상층에 있는지 확인하십시오. </li><li> 지질 층에 구멍을 만듭니다.200 μL 피펫 팁을 사용하여 액상에 접근하십시오. 팁을 변경하고 펠렛을 방해하거나 지질 층을 흡입하지 않고 lysate를 수집하십시오. 얼음에 미리 라벨이 붙은 튜브 (1 단계 2.1.11 단계)에 lysate를 분주하고 -80 ° C에 보관하십시오. </li><li> 적절한 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하여 단백질 농도를 정량 할 수 있습니다 (재료 표 참조). </li></ol></li><li> 간접 면역 침전 <ol><li> 얼음 위에서 이전에 준비된 총 유선 lysates의 두 aliquots을 해동. 참고 : 하나의 분취 량은 목표 단백질의 IP에 사용되며, 다른 분취 량은 음성 대조군으로 사용됩니다. </li><li> 500-1,000 μg의 lysate를 모으고 각각의 1.5 mL 튜브에서 200 μL의 최종 용량에 도달하도록 PBS로 희석한다. 참고 : 사용되는 용 해물의 양은 관심있는 단백질의 양과 항체의 효율에 달려 있습니다 ( 그림 3 참조).n 예 및 재료 표 ). 각각의 표적에 대해 최적화하기 위해서는 다른 양의 lysate (500, 750, 1,000 μg)와 항체 ( 즉, 5, 10, 20 μg)를 사용해야합니다. 다음 단계를 수행하십시오 (2.2.3-2.3.7.4). </li><li> lysate의 첫 번째 튜브에 관심 항원에 대한 항체를 추가하고 얼음에 보관하십시오. 참고 : 필요한 금액은 각 회사에서 제공하는 지침서 ( Table of Materials 참조)에 제시되어 있습니다. </li><li> 두 번째 튜브에서 2.2.3 항에 사용 된 항체와 동일한 농도의 이소 타입 IgG 대조군을 첨가하여 음성 대조군을 준비한다. </li><li> 튜브를 4 ° C에서 밤새 품어 둔다. 저속에서 튜브 롤러 믹서를 사용한다. </li><li> 다음날, 미리 세척을위한 새로운 1.5 ML 튜브에 자기 구슬 50 μL를 추가합니다. <ol><li> 항체에 대한 상대적인 친화력을 기준으로 Protein A 또는 Protein G 자기 비드를 선택하십시오. </li&gt; <li> 응집 된 구슬을 사용하지 않는 것이 중요합니다. 부드럽게 그것이 튜브에 추가하기 전에 균일하게 다시 일시 중지 될 때까지 비드 서스펜션을 섞는다. </li></ol></li><li> 자석 스탠드에 비즈가 들어있는 튜브를 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오. 200 μL 피펫을 사용하여 구슬에서 저장 버퍼를 제거하십시오. </li><li> PBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 500 μL를 추가하여 구슬을 씻고 10 초 동안 격렬하게 튜브를 와동시킨다. </li><li> 튜브를 다시 자기 스탠드 위에 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오. </li><li> 200 μL 피펫으로 pipetting하여 초과 세척 버퍼를 제거하십시오. </li><li> 롤러 믹서에서 RT에서 90 분 동안 비즈와 부화로 2.2.5 단계에서 반응 복합체 (lysate - 항체)를 추가합니다. </li><li> 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오. 200 μL 피펫을 사용하여 lysate를 대기음하고 폐기하고 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> 구슬을 씻으십시오500 μL의 PBS를 첨가하고, 자성 스탠드에 튜브를 놓고, 200 μL 피펫을 사용하여 액체를 제거합니다. 이 세척 단계를 반복하십시오. 세척 단계 동안 볼 텍싱을 피하고 샘플을 얼음에 보관하십시오. </li><li> 소용돌이 치지 않고 PBS-0.1 % 폴리 소르 베이트 20로 비즈를 한 번 씻고 200 μL 피펫 팁을 사용하여 마지막 세척 완충액을 버립니다. </li><li> 용리 시키려면 0.2 M 산성 글리신 (pH = 2.5) 20 μL를 튜브에 넣고 7 분 동안 롤러 믹서에서 흔들어줍니다. </li><li> 수초 동안 빠른 속도로 원심 분리하고 (빠른 스핀) 신선한 얼음처럼 차가운 튜브에 뜨는 물을 모은다. </li><li> 각 튜브에 대해 2.2.14 및 2.2.15 단계를 반복합니다. 참고 : 최종 볼륨은 40 μL입니다. </li><li> 단계 2.2.16에서 40 μL eluted 샘플에 4x Laemmli 버퍼 10 μL를 추가합니다. 참고 : 산성 pH로 인해 색상이 노란색으로 변합니다. </li><li> 즉시 2.2 M의 용리 된 시료에 1M Tris (pH = 8)를 한 번에 한 방울 씩파란색으로 변합니다. 다음 튜브로 진행합니다. </li><li> 단계 2.2.18의 시료를 70-90 ° C에서 10 분간 끓여줍니다. 즉시 겔 전기 영동으로 진행하십시오. 또는 시료를 -80 ° C에서 냉동실로 옮길 때까지 시료를 옮깁니다. </li></ol></li><li> 다운 스트림 적용 : 겔 전기 영동 후 Western blot <ol><li> 표준 절차에 따라 SDS-PAGE 아크릴 아마이드 젤 (1.5 mm 두께)을 분리하고 쌓아서 준비하십시오 15 . 참고 : 겔 (8-15 % 아크릴 아미드, 그라디언트 : 재료 표 참조)의 선택은 침전 될 단백질의 분자 크기와 잠재적 결합 파트너를 분석하여 결정해야합니다. 이러한 단백질은 적절한 면역 검출을 위해 서로 분리되어야합니다. </li><li> 얼음 위에서 면역 침전 (IP) 용출 시료 (단계 2.2.20)를 해동합니다. </li><li> 동일한 샘플 (단백질 IP 절차에 사용)에서 단백질 용 해물을 준비하십시오. 50 사용총 용 해물 μg을 첨가하고 4X Laemmli 샘플 버퍼를 첨가한다. 샘플을 70-90 ° C에서 5 분간 끓여 얼음이 칠 때까지 올려 놓습니다. 참고 :이 샘플은 전체 용 해물에 침전 된 단백질의 존재를 설명하기 위해 용출 IP 샘플 옆에로드됩니다. </li><li> 아크릴 아미드 겔에서 단계 2.3.3의 준비된 용 해물과 단계 2.2.20의 침전 된 시료를 나란히 놓고 달리기 완충액 (10x 달리기 완충액 : Tris 30.3g, 글리신 144.1g 및 10 g의 SDS를 1L의 증류수에) 약 95 분 동안 또는 이동하는 단백질의 가장자리가 겔의 바닥에 도달 할 때까지. </li><li> 표준 프로토콜 9 , 15 를 사용하여 젤을 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮기십시오. </li><li> 5 % 건조 우유 -TTBS (20 MM 트리스, 500 MM NaCl 및 0.05 % 폴리 소르 베이트 20)에서 저속으로 로커에서 막을 차단한다. </li><li> 강수량이 suc인지 확인하십시오그만. <ol><li> 느린 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 4 ° C 밤새 제조 업체가 권장 농도에서 5 % 건조 우유 TTBS로 희석 된 침전 된 단백질에 대한 첫 번째 항체를 사용하여 막을 프로브하십시오. 참고 : 권장 사항 은 재료 표를 참조하십시오. </li><li> 다음날, 높은 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 TTBS로 막을 5 분씩 3 회 세척한다. </li><li> 천천히 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 RT에서 1 H를 위해 TTBS로 희석 한 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)와 함께 적절한 보조 항체에 막을 품어. 주 : 또는 신호를 검출하기위한 적절한 장치가 이용 가능하다면 형광 색소와 접합 된 2 차 항체를 사용할 수있다. </li><li> 높은 교반과 함께 흔들어 놓는 플랫폼에서 TTBS로 3 분에서 6 분 동안 5 분씩 씻어냅니다. 상용 멤브레인과 함께 멤브레인을 배양하여 보조 항체의 신호를 분석사용 가능한 루미놀 용액 ( 재료 표 참조)을 따르고 제조업체의 지침을 따르십시오. 화학 발광 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다 ( 재료 표 참조). 참고 : Western blot 분석에 대한 자세한 프로토콜은 참고 자료 16을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 상호 작용하는 단백질을 확인하기 위해 동일한 블롯에서 적절한 항체를 사용하여 2.3.7.1-2.3.7.4 단계를 수행하십시오. 참고 : 단백질이 상호 작용하는 경우, 결합 파트너는 표적 단백질과 공 - 면역 침전 될 것이며, 따라서 웨스턴 블 랏팅에 의해 검출 될 것이다. 단백질의 분자량이 젤과 막에서 잘 분리되기에 충분하다면 다른 단백질이 같은 단백질 복합체에 존재 하는지를 결정하기 위해 더 많은 항체로 단계 2.3.8을 반복 할 수 있습니다. </li><li> 확인 된 바인딩 파트너가 아티팩트가 아닌지 확인하려면 상호 IP를 수행해야합니다. 참고 : 이것은 반복하여 수행됩니다.단계 2.2.1-2.2.20을 동일한 용 해물로 수행하지만 단계 3.8에서 확인 된 결합 파트너 중 하나를 침전시킨다. 그런 다음 관심있는 첫 번째 단백질에 대한 1 차 항체를 사용하여 3.1-3.8 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>

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T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Fredriksson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+surrounding+occludin+and+claudin-4+reveals+their+proximity+to+signaling+and+trafficking+networks.">Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes.">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li></ol>

저자는 선언 할 것이 없다.

접합부를 통한 세포 - 세포 상호 작용은 유방샘과 같은 많은 기관의 적절한 기능과 발달에 필요합니다. 연구 결과 junctional 단백질은 서로의 기능과 안정성을 조절할 수 있고 세포막에서 서로 연결되어 신호 전달을 활성화 할 수 있습니다. 현재의 원고에 제시된 프로토콜은 접합 단백질의 차별화 된 발현, 위치 및 정상적인 쥐의 혈관 발달 중 상호 작용에 대한 흥미있는 발견을 제공했다. junctional ?...

유선의 성장 및 발달은 주로 출생 후 발생합니다. 이 기관은 포유류의 번식을 통해 끊임없이 변모합니다 1 . 성인 유선 선 상피는 내막 상피 세포의 내층과 기저 세포의 외층으로 이루어져 있으며, 주로 상피 세포로 이루어져 있으며 기저막으로 둘러싸여있다. 유선 구조와 발달에 대한 좋은 검토를 위해 독자는 Sternlicht 1 을 참고할 수 있습니다. 글 랜드 1 , 3 , 4 , 5 , 6 의 정상적인 발달과 기능을 위해서는 gap (GJ), tight (TJ), adherens (AJ) junction을 통한 세포 - 세포 상호 작용이 필요합니다. 쥐 유선에서 이들 접합부의 주요 구성 요소는 Cx26, Cx30, Cx32 및 Cx43 (GJ)입니다. 클로 딘 -1, -3, -4, -7 그리고ZO-1 (TJ); 및 E-cadherin, P-cadherin 및 β-catenin (AJ) 7,8 . 이러한 서로 다른 접합 단백질의 발현 수준은 유선 발달 동안 단계에 따라 달라 지므로 차별화 된 세포 - 세포 상호 작용 요구 사항을 제시합니다. GJ, TJ 및 AJ는 구조적 및 기능적으로 연결되어 있고 인접한 세포의 인접한 사이트에 다른 구조적 또는 조절 단백질을 연결하여 교차 결합 관계를 만듭니다. junctional 연결의 구성은 기본 cytoskeleton뿐만 아니라 넥서스 투자율과 안정성과 다리에 영향을 미칠 수 있으며 결과적으로 글 랜드의 기능에 영향을 줄 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 접합부 넥서스에 있거나 서로 다른 곳에서 상호 작용하는 세포 간 접합의 구성 요소최근 유방암 발달 단계를 co-immunofluorescence (co-IF)와 co-immunoprecipitation (co-IP)을 이용하여 분석 하였다. 다른 기술은 단백질 간의 기능적 연관성을 평가할 수 있지만,이 방법은이 원고에 제시되어 있지 않습니다. 단백질은 단지 기능 만 수행하기 때문에 신호 전달 및 생화학 적 계통과 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 연구하는 것은 많은 연구자에게 필수적이며 단백질의 기능에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 공동 IF 및 현미경 분석은 동일한 세포 내 공간을 공유하는 몇 가지 단백질을 평가하는 데 도움이됩니다. 그러나 다른 동물에서 키워야하는 항체와 다른 파장의 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경 및 멀티플렉싱을위한 스펙트럼 검출기를 사용하여 표적의 수를 제한합니다. Co-IP는 친화적 인 물리적 상호 작용을 확인하거나 공개합니다.단백질 복합체 내에 존재하는 둘 이상의 단백질. 단백질의 위치와 상호 작용을 동시에 감지 할 수있는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 12 및 근접 연결 분석 (PLA) 13 과 같은 새로운 기술의 개발에도 불구하고, co-IP는 적절한 상호 작용을 연구하는 적절한 기술이다 내생 단백질. 이 원고에서 설명한 단계별 방법은 유방 땀샘의 내인성 PPI를 연구 할 때 피하기 위해 단백질 지방화 및 PPI의 연구를 촉진하고 함정을 지적합니다. 이 방법론은 각 기술에 필요한 조직에 대한 다양한 보존 절차를 제시하는 것으로 시작합니다. 1 부는 i) 유방 땀샘의 구분, ii) co-IF 기법을 이용한 여러 단백질의 이중 또는 삼중 표지, iii)단백질 지방화. Part 2는 내인성 단백질을 침전시키고 상호 작용하는 단백질을 i) 용 해물 준비, ii) 간접 단백질 면역 침전 및 iii) SDS-PAGE 및 Western blot에 의한 결합 파트너 식별의 세 단계로 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 각 단계는 설치류 유선 조직에 최적화되어 있으며 고품질의 특이적이고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 이 프로토콜은 다른 조직이나 세포주의 PPI 연구의 시작점으로 사용할 수도 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice strain and stage&#160;</td>
			<td>St. Constant, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4&#8226;7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.4&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS 10X (stock)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water.&#160; 
			2)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Adjust the PH to 7.5&#160; 
			3)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Add water to reach to the 1 litre final volume.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing media</td>
			<td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td>
			<td>95067-840</td>
			<td>VMR frozen sections compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>956640</td>
			<td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&#160;Scientifiques&#160;ESBE&#160;St-Laurent, QC, Canada</td>
			<td>&#160;BLM1001C</td>
			<td>High profile gold coated blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>8899</td>
			<td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>FOR201.1</td>
			<td>Forlmadehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Oakville, ON, Canada</td>
			<td>P 9416</td>
			<td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Cedarlane, Burlington, ON</td>
			<td>17984-25(EM)</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&#160;</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>&#946;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First &#38; secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in Column D</td>
			<td>Connexin26&#160; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei stain</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software of IF images analysis</td>
			<td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td>
			<td></td>
			<td>NIS-elements software (version 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2-Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1) Mix 50mM TRIS (F.W.&#160;:121.14), 150mM NaCl (F.W.&#160;:58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O.&#160; 
			2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 
			3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge.&#160; 
			At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: 
			Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>78441</td>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein dosage</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td>Pierce BCA protein assay kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinder</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>FTH-115</td>
			<td>Power 125, Model FTH-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads and stand</td>
			<td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution for IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td>
			<td>Mentioned in coulmn D</td>
			<td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &#181;l/200 &#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td>
			<td>1610747</td>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &#946;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>PB381-5</td>
			<td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 M (pH=8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE acrylamide gels&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1610180 -5</td>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer 10x&#160;</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704272</td>
			<td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer method</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1704155</td>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Milk</td>
			<td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing solutions for blots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TBS-Tween 20 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)&#160; 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary and secondary antibodies for blots (10ml)</td>
			<td>Life technologies, Waltham, MA, USA &#38; Abcam, Toronto, ON, Canada</td>
			<td>Mentioned in column D</td>
			<td>Claudin3&#160; (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody&#160; (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution for signal detection on blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1705061&#160;</td>
			<td>Clarity Western ECL Blotting Substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>1708280</td>
			<td>ChemiDoc MP imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analayzing blots</td>
			<td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td>ImageLab 5.2 software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

세포 - 세포 상호 작용은 조직의 보전과 유방의 여러 구획 사이의 장벽을 보존하는 데 중추적 인 역할을합니다. 이러한 상호 작용은 인접 세포간에 넥서스를 형성하는 접합 단백질에 의해 제공됩니다. Junctional protein mislocalization과 결합 파트너와의 물리적 연관성 감소는 기능 상실, 결과적으로 장기 기능 부전을 초래할 수 있습니다. 따라서 정상 및 질병 관련 조직에서 단백질 위치 파악 및 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 확인하는 것은 발달 상태의 질병이나 변화의 진행을 유도하는 새로운 증거와 메커니즘을 찾는 데 필수적입니다. 이 원고는 마우스 유선에서 PPI를 평가하는 2 단계 방법을 제시합니다. 프로토콜 섹션 1에서는 관심있는 단백질에 대해 생성 된 항체와 형광 색소로 표지 된 2 차 항체를 사용하여 동시 면역 형광 (co-immunofluorescence) (co-IF)을 수행하는 방법을 설명합니다. co-IF all단백질의 근접성을 입증해야하기 때문에 신체적 상호 작용을 연구하는 것이 가능합니다. 따라서 co-immunoprecipitation (co-IP)에 대한 자세한 프로토콜은 프로토콜 섹션 2에 나와 있습니다.이 방법은 이러한 상호 작용이 직접적인지 간접적인지를 확인하지 않고 단백질 간의 물리적 상호 작용을 결정하는 데 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 co-IF 및 co-IP 기술은 유 전선 발달 동안 변이성 접합부 연결을 생성하면서 세포 간 접합의 특정 구성 요소가 함께 위치하고 상호 작용한다는 것을 입증했습니다.

유방 내에서 GJ, AJ 및 TJ 성분이 상호 작용할 수 있는지를 결정하기 위해 co-IF 분석이 먼저 수행되었습니다. GJ 단백질 인 Cx26과 AJ 단백질 인 β-Catenin을 각각 특정 항체로 탐침하고 fluorophore-conjugated 마우스 -647 (녹색, pseudocolor) 및 염소 -568 (적색) 항체를 사용하여 나타냈다 ( 그림 1B 및 C ) . 데이터는 노란 색 ( 그림 1D )에 의해 반영된 바와...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

analysis-protein-protein-interactions-co-localization-between

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K 조회수.  INRS, Institut Armand-Frappier.  세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다. 

비디오: Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Vasculogenesis의 운동 분석 역학 Vasculogenesis 및 신생에서 생체 외에서 의 단정

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...