私たちの方法は、研究者が組織の形態と機能に対する個々の系統の寄与を調査するために異なる細胞型を分離し、操作することを可能にするので、重要である。この手法は、細胞タイプを分離するための穏やかで効率的な方法であり、その結果、細胞の完全性が3D培養のために保存されます。この技術は、十分に特徴付けられているバイオマーカーを持たない細胞を分離するために他のシステムにも適用できます。.
生後10~14週齢の雌マウスから2、3、4、5個の乳腺を収穫するには、まず2つの後肢の間の正中線で1センチメートルの切開を行う。首まで切り傷を伸ばし、中線の切開部から手足に向かって小さな横切りを行います。その後、動物の両側にピンでそれを固定する前に教えられた皮膚を伸ばします。
鉗子を使用して、数4腺からリンパ節を収集する。乳腺を取り除くために、鋭いはさみを使用して組織の各領域の下で切断し、5%FBSと抗生物質抗抗薬を加えた4度の50ミリリットルのDMEM-F12に組織を収穫する。すべての組織が収集されたら、必要に応じてプレートを回転させる1ミリリットルのピペットチップを通して、すべての組織が均等にミンチされるように、部分が簡単に収まるまで腺を刻みます。
その後、3ミリリットルの消化培地の断片を、摂氏37度と5%の二酸化炭素で14時間、6ウェル低接着皿の単一の井戸に移します。翌朝、1ミリリットルのマイクロピペットで組織を10回軽くピペットし、組織断片を15ミリリットルのチューブに移す。遠心分離によって組織を収集し、新鮮なDPBSの5ミリリットルでペレットを再中断します。
プレウェット70マイクロメートルナイロンセルストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングし、洗浄ごとに37°CのDMEM-F12の10ミリリットルでストレーナーでチューブを4回洗い流します。組織断片を解放するには、手袋をした指でストレーナータブを保持し、60ミリメートルの組織培養皿の上にストレーナーを反転させます。ストレーナーの底を通して維持媒体の4つの1ミリリットルのアリコートを渡し、逆顕微鏡の下で単一細胞、脂肪滴、および汚染組織の皿を素早く調べる。
その後、細胞培養インキュベーターにプレートを24時間置き、組織断片が皿に付着し、二重層状の断片を生成するようにします。筋上皮細胞を発光上皮細胞から分離するには、新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを1ミリリットルの新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを細胞に加える前に、1ミリリットルのDPBSで皿を洗いす。逆顕微鏡で消化を注意深く監視します。
筋上皮細胞の外層は3〜6分以内に剥離し始める。筋上皮細胞が剥離したら、上清をDPBSで10%FBSの2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに移します。明るい上皮細胞を乱すことなく、残りの細胞に新鮮なミリリットルのトリプシンEDTAを加える前に、DPBSの2ミリリットルで皿をそっと洗いす。
7~15分後、PBSで10%FBSの2ミリリットルで酵素反応を焼き付け、細胞を新しい15ミリリットルチューブに移します。微分トリプシン化中に細胞を注意深く監視し、細胞を過剰に消化しないことが重要です。両方の分画が採取された場合、遠心分離して細胞に残留解離試薬を除去し、1管当たり250マイクロリットルの維持培地でペレットを再懸濁する。
計数後、各細胞集団を、新鮮な維持培地中のウェル濃度当たり4細胞に1.2倍10倍に希釈する。8ウェルチャンバースライドの各ウェルにフェノールレッドなしでDMEM-F12に50%細胞外マトリックスの90マイクロリットルを加えます。すべてのウェルがコーティングされたら、細胞培養インキュベーター内の基層を30分間固化する。
この重合の間、遠心分離によって細胞画分を収集し、ウェル当たり90%の増殖培地で10%細胞外マトリックスの100マイクロリットルの各集団を再懸濁する。次に、各細胞懸濁液を100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、共培養液を細胞培養インキュベーターで20分間沈着させます。インキュベーションの終了時に、各チャンバー壁の側面に100マイクロリットルの成長培地を慎重に加え、スライドを細胞培養インキュベーターに戻します。
細胞を24時間ごとに画像化して成長を追跡し、2~3日ごとに成長培地を静かに更新します。免疫染色用のオルガノイドを固定するために、適当な実験時に、各スライドから培地を慎重に吸引し、各スライドを画像化し、各ウェルあたり200マイクロリットルのDPBSで十分にリンスする。オルガノイドを4度のパラホルムアルデヒド200マイクロリットルを室温で10分間固定してから、室温で30分間、DPBSあたり200マイクロリットルの0.2%グリシンでオルガノイドを治療します。
インキュベーションの終了時に、DPBSで0.25%トリトンX-100でオルガノイドを室温で10分間透過させ、続いて5%ロバ血清またはDPBS中の二次抗体の種と一致する適切な血清による非特異的結合の遮断を揺らしながら1時間行う。次に、DPBSで1%ロバ血清に関心のある適切な一次抗体の125〜200マイクロリットルをロッキングで摂氏4度で一晩で標識します。翌朝、200マイクロリットルのDPBSとトリトンX-100でそれぞれ2回洗浄し、オルガノイドに適切な蛍光コンジュゲート二次抗体を室温で45分間標識し、光から保護されたロッキングを使用します。
次に、新鮮なDPBSとトリトンX-100を使用してそれぞれを2回洗浄し、標準的なプロトコルに従って蛍光顕微鏡でオルガノイドを画像化します。24時間のインキュベーションの後、精製された上皮断片は、ミオエピテリアル細胞の外層を有する平らなパンケーキ様構造を形成する培養皿の底に付着し、ルミナル上皮細胞の内層を囲む。トリプシン治療は、ミオエピテリアル細胞を最初に剥離し、残りの立方体の明るい上皮細胞のコアを囲む明るい丸みを帯びた細胞として現れる細胞を差し出す。
2つの細胞区画の全体の純度は、ケラチン-14および2つの集団内のEカドヘリン発現によって評価される約90%である。10%細胞外マトリックスで10日間培養した後、50%細胞外マトリックス塩基上で実証されたように、筋上皮細胞オルガノイドは、よく発達した内腔を有する大きな分岐構造を形成した。5日目の分化は、アルボロ産生培地に添加して、より大きく、より分岐した乳含有オルガノイドの形成を誘導する。
上皮を採取する際には、ストロマ質の汚染物質がないことを確認するために、慎重にストレーナーを洗浄することを忘れないでください。遺伝子発現の変化を問い合わせるために、研究者は回収溶液を使用して細胞外マトリックスからRNAを放出することによって、オルガノイドからRNAを収集することができます。パラホルムアルデヒドは危険であると考えられ、研究者は個人的な保護具を使用し、この試薬を使用する際にヒュームフードの内部で作業する必要があります。
