HC11およびEpH4細胞は、培養中に分化し得るマウス乳房上皮細胞株である。同時に、これらの細胞は、多数の腫瘍遺伝子によって形質転換され得る。これらの細胞は、分化と腫瘍性の形質転換との相互関係の研究に最適です。
これらの技術は、がん治療の標的を発見するためにシグナル伝達研究で使用することができる。例えば、小さなGTPase Racおよび他の分子は、高レベルに発現すると乳房上皮細胞の形質転換を引き起こす可能性があるが、驚くべきことに低レベルでは分化を誘発する可能性がある。他の信号トランスデューサも同様の動作をする場合があります。
この原理は、細胞合流が重要な役割を果たす他のタイプの分化(例えば、有数細胞または筋管の分化)にも適用される。この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。これは、細胞間接触が分化に重要であるためである。
注意すべきもう一つのポイントは、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出がタンパク質定量に重要であるということです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルの一部の詳細を紙に記述することが困難であるため、便利です。原稿の指示に従ってHC11細胞培地の50ミリリットルのボトルを準備することによって開始します。
細胞をプレートするには、5つの6センチメートル50%コンフルエントペトリ皿から培地を吸引し、無菌9インチの綿を差し込んだパスツールピペットを使用して約1.8ミリリットルのトリプシンで細胞を洗います。その後、プレートあたり200マイクロリットルのトリプシンを加え、プレートを旋回して取り付けられた細胞を取り除きます。4Xの目的で位相対視下の細胞を観察し、外れ始めたことを確認します。
その後、無菌9インチのパスツールピペットで約1.5ミリリットルのHC11培地を吸引し、飛び散らないように皿を回転させながら細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞をHC11培地でボトルに移し、渦巻いてボトルに均等に分散させます。その後、1皿あたり2ミリリットルの細胞をピペット処理することによって、細胞懸濁液を20の3センチメートルのペトリ皿にアリコートする。
ペトリ皿を揺らし、細胞を広げ、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。次の日に細胞が90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、それをFBSで培地に置き換えますが、EGFを使用しない。24時間EGFなしで培地で細胞を成長させた後、10皿に分化培地を追加し、コントロールとして他の10の料理を維持するために最大10日間細胞を成長させます。
HIP処理細胞とコントロールセルの両方で、2~3日ごとに培地を交換します。分化を監視するには、位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察します。細胞が緑色蛍光タンパク質を発現している場合は蛍光顕微鏡を使用してください。
さらに、HIP処理細胞からタンパク質を抽出し、細胞を1日1回コントロールし、ウェスタンブロット分析を行うことで、分化の程度を定量化します。EpH4成長培地、EHSマトリックス、および2つの円錐50ミリリットルチューブを氷の上に集めて配置します。マイナス20°Cのピペットチップを備えた組織培養プレートをプレチルし、2つの50ミリリットル円錐形チューブで10または20%マトリックスを添加したEpH4成長培地を準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管します。
プレチルド組織培養プレートをマイナス20度で取り出した後、ピペットでマトリックスを広げ、希釈されていないマトリックスの150マイクロリットルで24ウェルプレートのウェル10をコーティングします。マトリックスを広げるときには、バブルを作成しないようにします。その後、プレートの側面をそっとタップし、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、マトリックスを固めます。
一方、先に述べたEpH4細胞をトリプシン化し、トリプシン化細胞の再懸濁後に単細胞懸濁液を確保することにより、分化に備える。次に、ヘモサイトメーターで懸濁液中の細胞を数える。1.5ミリリットルの無菌円錐型遠心分離管にウェルあたり4つの細胞に5回10回移し、5分間gの250倍でそれらを回転させます。
上清媒体を慎重に吸引し、チューブを氷の上に置きます。1ミリリットルのピペットチップを使用して、20%マトリックスを補充したEpH4成長培地の350マイクロリットルの細胞を再懸濁し、氷上のチューブを気泡を避けるようにします。底層が固まったら、コーティングされた各ウェルに350マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層を固化させるために1時間摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに入れます。
位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察し、単一の細胞が見えるようにします。その後、上に10%マトリックスを持つEpH4培地の200マイクロリットルを加え、37°Cでプレートをインキュベートします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日に分化誘導を開始する。
慎重にトップ10%マトリックス培地の150マイクロリットルを除去し、HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地の200マイクロリットルを追加し、コントロールのためにHIPなしの10%マトリックス培地を追加します。位相コントラスト顕微鏡で最大10日間の監視用の培地を2日ごとに交換します。分化を定量化するには、10%マトリックスHIP培地をウェルから慎重にピペットオフし、氷冷PBSの350マイクロリットルで20%マトリックス層をすすいだ。
その後、1ミリモルEDTAを持つ氷冷PBSの70〜100マイクロリットルを直接井戸に加え、ピペットチップで100%マトリックスの底層を静かに取り外します。プレートを摂氏4度で30分間軽く振ります。慎重に円錐形のチューブにスフェロイド懸濁液を移し、残りのスフェロイドを回復するためにPBS EDTAの500マイクロリットルでウェルをすすいだ。
さらに30分間氷の上でチューブを揺らし、マトリックスが完全に溶解することを確認します。可視マトリックスの塊が見られる場合は、PBS EDTAを追加するか、長く振ります。溶液を350倍gで遠心分離し、スフェロイドをペレットする。
次いで上清を吸引し、スフェロイドをライスし、ウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAPの細胞をプローブする。HC11細胞のRacシグナルの強さに対する分化の顕著な依存性がある。内因性CRAC1は分化に必要であり、変異活性化RacV12の低レベルは分化能力の増加を引き起こすが、高いRacV12レベルは分化のブロックを誘発し、新生物を誘導する。
EpH4細胞の分化特性を3Dマトリックス培養で調べたところ、βカゼイン産生は8~10日でピークに達し、CYCLIN D1発現はHIP刺激後4~6日で最大であったことがわかりました。個々の細胞の位置を決定するために、それらはDAPIで染色され、共焦点顕微鏡でイメージングした。内部細胞死および中空腔の形成はマンモスフィアで観察され、HGFの添加は管状構造の形成をもたらした。
この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。また、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出は、タンパク質定量のために重要です。この手法を使用して、同様の方法で動作する他の信号トランスデューサを調べることができます。
癌にドライバー突然変異がある場合、残りの低レベルが実際に分化を誘発するので、その完全な阻害は必要ありません。
