IP wird von einem Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaftsrat von Kanada finanziert (NSERC # 418233-2012); Ein Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), ein Trainerpreis der Quebec-Brustkrebs-Stiftung und ein Leader Founds-Stipendium der kanadischen Stiftung für Innovationsträger. ED erhielt ein Stipendium der Fondation universitaire Armand-Frappier.

Alle Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Universitäts-Tierpflege-Komitee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada) genehmigt. 1. Identifizierung der Protein-Co-Lokalisation <ol><li> Vom Gewebe bis zu mikroskopischen Objektträgern HINWEIS: Gewebe und Abschnitte sollten auf Trockeneis gehandhabt werden. <ol><li> Heben Sie die Brustdrüsen von einem Tier an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al. ) 14 . </li><li> Das ausgeschnittene Gewebe im Gefrier- / Montagemedium auf Trockeneis einbetten. Füge genug Medium hinzu, um die Drüse zu bedecken. Wenn das Medium verfestigt ist, übergeben Sie das Gewebe in einen Gefrierschrank bei -80 ° C für die spätere Verwendung 9 . </li><li> Unter Verwendung eines Kryomikrotoms bei ≤ -35 ​​° C schneiden Sie die Gewebe in 7-10 μm dicke Abschnitte und legen sie auf Mikroskop-Objektträger. HINWEIS: Wenn möglich, legen Sie zwei Abschnitte auf jede Folie. Der linke Abschnitt wird als verwendetUm die Spezifität der Antikörper und die Autofluoreszenz des Gewebes zu verifizieren, während die rechte Seite mit den Antikörpern markiert wird. </li><li> Halten Sie die Abschnitte bei -80 ° C für späteren Gebrauch. </li></ol></li><li> Co-IF-Färbung <ol><li> Die entsprechenden mikroskopischen Objektträger aus dem Gefrierschrank abholen und sofort die Abschnitte durch Eintauchen in Formaldehyd 4% für 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren. </li><li> Dann tauchen Sie die Folien in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei RT ein. Lassen Sie die Folien in PBS bei RT, bis Sie zum nächsten Schritt gehen. </li><li> Umkreisen Sie jeden Abschnitt des Objektträgers mit einer handelsüblichen hydrophoben Barriere oder einem wasserabweisenden Laborstift (siehe Tabelle der Materialien ). Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren. Fügen Sie sofort Tropfen PBS in das Gewebe und legen Sie die Folie in eine feuchte Histologie Kammer für den Rest des Verfahrens. HINWEIS: Die Gewebeabschnitte müssen befeuchtet bleiben. AlternativeLy, verwenden Sie eine Schachtel mit einem Deckel und legen Sie nasse Papiertücher auf den Boden. </li><li> Blockieren Sie jeden Gewebeabschnitt mit 100-200 μl 3% Rinderserumalbumin (BSA) -Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) -0,1% Polysorbat 20 (siehe Tabelle der Materialien ) für 30 min bei RT. Während die Proben blockieren, werden die primären und sekundären Antikörperlösungen durch Verdünnen der Antikörper in TBS-0,1% Polysorbat 20 hergestellt. HINWEIS: Die erforderliche Konzentration für den Antikörper wird vom Hersteller bereitgestellt; Siehe die Tabelle der Materialien und die Abbildungen 1 und 2 für Beispiele, sowie Dianati et al. 9 Obwohl es nicht notwendig ist, im Dunkeln zu arbeiten, wenn man die meisten Fluorophor-konjugierten Antikörper verwendet, vermeiden Sie, die Antikörper-Lösungen oder gefärbten Gewebe einem intensiven, hellen Licht auszusetzen. </li><li> Entfernen Sie die Blockierungslösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte in 100-200 &amp; mgr; l des verdünnten primären Antikörpers für 60 min bei RT. AlternativY mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. </li><li> Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte mit 100-200 &amp; mgr; l des geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers für 60 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Die Waschlösung entfernen und zweimal wiederholen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.5-2.8 mit der entsprechenden Kombination von primären und sekundären Antikörpern für die nachfolgenden Proteine ​​(n) von Interesse. </li><li> Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und führen Sie die Kernfärbung durch Inkubieren des Abschnitts mit 100-200 &amp; mgr; l 1 mg / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min beiRT </li><li> Entfernen Sie die DAPI-Lösung durch Absaugen und montieren Sie die Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Montagemedium (siehe Tabelle der Materialien ) und Deckgläschen. Gehen Sie jeweils eine Folie vor. HINWEIS: Die Inkubation des Kernflecks für mehr als 5 min wird nicht die Intensität der Färbung verändern. Alternativ entfernen Sie die DAPI-Lösung auf allen Folien und inkubieren die Gewebe in PBS bei der Montage der Folien. </li><li> Legen Sie die Objektträger für mindestens 8 Stunden in einen 4 ° C-Kühlschrank. Gehen Sie zur fluoreszenzmikroskopischen Bildgebung vor (siehe Abb. 1 und 2 ). </li></ol></li><li> Mikroskopische Bildgebung <ol><li> Visualisierung der fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, das mit den verschiedenen Lasern ausgestattet ist, die erforderlich sind, um die Fluorophore bei ihren spezifischen Wellenlängen anzuregen. Hinweis: Um Kanäle und Alveolen visualisieren zu können, wird ein 40X Objektiv mit einer numerischen Blende von 0,95 vorgeschlagen. Ein BeispielE der spezifischen Einstellungen ist in Abbildung 1 dargestellt . </li><li> Überprüfen Sie die Lokalisierung jedes Proteins einzeln durch Scannen des Bildes eine Wellenlänge zu der Zeit. Anmerkung: In diesem Stadium ist es wichtig, die Lokalisation der junctionalen Proteine ​​kritisch zu analysieren. Um junctionale Nexusse bilden zu können, müssen diese Proteine ​​an der Plasmamembran lokalisiert werden. </li><li> Bestimmen Sie die Co-Lokalisierung von Proteinen durch Zusammenführen der mit den Lasern gescannten Bilder bei den verschiedenen Wellenlängen. Anmerkung: Die Protein-Co-Lokalisierung kann durch die Veränderung der Farbe, die sich aus der Emission von zwei oder mehr Fluorophoren an der gleichen Stelle ergibt, visualisiert werden und kann mit der entsprechenden Software gemessen werden ( Abb. 1 und 2 , siehe auch Referenz 9). </li></ol></li></ol> 2. Studieren von PPIs ANMERKUNG: Bauchdrüsendrüsen sollten verwendet werden, um PPIs zu studieren, da Thoraxdrüsen in enger Verbindung mit dem Brustkorb sindMuskeln Heben Sie die Milchdrüsen an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al .) 14 und halten Sie sie bei -80 ° C für spätere Verwendung. <ol><li> Lysatvorbereitung <ol><li> Legen Sie das Wägepapier und 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis, um sie vorzukühlen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. </li><li> Nehmen Sie das Brustdrüsengewebe von -80 ° C und halten Sie sie auf Trockeneis. </li><li> Die Gewebe auf den vorgekühlten Wägepapieren wiegen und dann das Gewebe auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen (Griff auf Trockeneis). Verwenden Sie zwischen 50 und 100 mg Gewebe pro Probe. Halten Sie das Gewebe auf Trockeneis bis Schritt 2.1.5. </li><li> Bereiten Sie die erforderliche Menge an Triple-Detergens-Lyse-Puffer, ergänzt mit NaF, NaVO &amp; sub3 ; und Protease / Phosphatase-Inhibitor, wie in der Tabelle der Materialien , unter Verwendung der folgenden Formeln angegeben. Mäuse: erforderlicher Puffer (μL) = Mausgewebegewicht (mg) x 3; Ratte: erforderlichPuffer (μL) = Rattengewebegewicht (mg) x 5. </li><li> Fügen Sie die erforderliche Menge an eiskaltem Lysepuffer (berechnet in Schritt 2.1.4) dem 2-ml-Röhrchen, das das Gewebe enthält, hinzu. HINWEIS: In den Schritten 2.1.5-2.1.6 fahren Sie mit einem einzigen Schlauch zu einem Zeitpunkt fort. </li><li> Homogenisieren des Gewebes für 30-40 s unter kontinuierlicher Homogenisierung auf einer Gewebemühle; Halten Sie immer die Tube auf Eis. Stellen Sie den Gewebehomogenisator auf mittlere Geschwindigkeit ein und bewegen Sie den Schleifer vorsichtig nach oben und unten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 mit den anderen Röhren. </li><li> Inkubieren Sie die Lysate auf Eis für 10-30 min. </li><li> Die Röhrchen bei 170 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Mittlerweile 6-10 Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml) für jede Probe identifizieren und auf Eis aufbewahren. </li><li> Sobald die Zentrifugation durchgeführt ist, überprüfen Sie die Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass sie eine obere Schicht von Fett, klare, gelb-rosa-Lysate (je nach Entwicklungsstadium) und ein Pellet enthalten. </li><li> Erstellen Sie ein Loch in der LipidschichtMit einer 200-μl-Pipettenspitze, um auf die flüssige Phase zuzugreifen. Ändern Sie die Spitze und sammeln Sie das Lysat, ohne das Pellet zu stören oder die Lipidschicht zu saugen. Aliquot das Lysat in vorbeschrifteten Röhrchen auf Eis (Schritt 2.1.11) und lagern bei -80 ° C. </li><li> Verwenden Sie ein Aliquot, um die Proteinkonzentration mit einem geeigneten handelsüblichen Kit zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien ). </li></ol></li><li> Indirekte Immunpräzipitation <ol><li> Auf Eis, Tauwetter zwei Aliquots der gesamten Brustdrüsen-Lysate vorbereitet vor. HINWEIS: Ein Aliquot wird für die IP des Zielproteins verwendet, während das andere als Negativkontrolle dienen wird. </li><li> Sammle 500-1000 μg des Lysats und verdünne es in PBS, um ein Endvolumen von 200 &amp; mgr; l in jedem 1,5 ml Röhrchen zu erreichen. ANMERKUNG: Die Menge des zu verwendenden Lysats hängt von der Häufigkeit des Proteins von Interesse und der Effizienz des Antikörpers ab (siehe Abbildung 3 für aN Beispiel, sowie die Tabelle der Materialien ). Zur Optimierung für jedes Ziel sollten unterschiedliche Mengen an Lysat ( dh 500, 750 und 1.000 μg) und Antikörper ( dh 5, 10 und 20 μg) verwendet werden. Gehen Sie mit den folgenden Schritten vor (2.2.3-2.3.7.4). </li><li> Füge den Antikörper gegen das Antigen von Interesse zum ersten Röhrchen des Lysats hinzu und halte es auf Eis. HINWEIS: Der erforderliche Betrag wird in der Regel auf dem von jedem Unternehmen zur Verfügung gestellten Gebrauchsanweisung empfohlen (siehe Tabelle der Materialien ). </li><li> In der zweiten Röhre eine negative Kontrolle durch Zugabe der gleichen Konzentration der Isotyp-IgG-Kontrolle wie der in Schritt 2.2.3 verwendete Antikörper herstellen. </li><li> Die Röhrchen über Nacht bei 4 ° C auf einem Rohrwalzenmischer bei niedriger Geschwindigkeit inkubieren. </li><li> Am nächsten Tag werden 50 μl magnetische Perlen zu neuen 1,5 mL Röhrchen zum Vorspülen gegeben. <ol><li> Wählen Sie entweder Protein A oder Protein G magnetische Perlen auf der Grundlage der relativen Affinität zum Antikörper. </lI&gt; <li> Es ist wichtig, die Verwendung von aggregierten Perlen zu vermeiden. Die Wulstsuspension vorsichtig mischen, bis sie gleichmäßig wieder suspendiert ist, bevor sie den Röhrchen zugesetzt wird. </li></ol></li><li> Legen Sie die Röhrchen mit den Perlen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus den Perlen mit einer 200 μl Pipette. </li><li> Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 500 μl PBS-0,1% Polysorbat 20 zugeben und die Röhrchen für 10 s kräftig vortexen. </li><li> Setzen Sie die Röhren wieder auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. </li><li> Den überschüssigen Waschpuffer durch Pipettieren mit einer 200 μl Pipette entfernen. </li><li> Den Reaktionskomplex (Lysat-Antikörper) aus Schritt 2.2.5 zu den Perlen zugeben und für 90 min bei RT auf dem Walzenmischer inkubieren. </li><li> Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Mit einer 200 μl Pipette aspirieren und das Lysat entsorgen und die Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Waschen Sie die PerleS durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS, Aufbringen der Röhrchen auf den Magnetständer und Entfernen der Flüssigkeit unter Verwendung einer 200 &amp; mgr; l Pipette. Wiederholen Sie diesen Waschschritt. Während der Waschstufen vermeiden Sie Vortexen und halten die Proben auf Eis. </li><li> Waschen Sie die Perlen einmal mit PBS-0,1% Polysorbat 20 ohne Vortexen und verwerfen Sie den letzten Waschpuffer mit einer 200 μl Pipettenspitze. </li><li> Zur Elution werden 20 μl 0,2 M saures Glycin (pH = 2,5) zu den Röhrchen gegeben und 7 min auf dem Walzenmischer geschüttelt. </li><li> Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit für ein paar Sekunden (schnelles Spin) und sammeln Sie den Überstand in einem frischen eiskalten Rohr. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.14 und 2.2.15 für jedes Rohr. HINWEIS: Das Endvolumen beträgt 40 μl. </li><li> Füge 10 μl 4x Laemmli-Puffer zu der 40 μl eluierten Probe aus Schritt 2.2.16 hinzu. HINWEIS: Die Farbe wird aufgrund des sauren pH-Werts gelb. </li><li> Fügen Sie sofort 1 M Tris (pH = 8), ein Tropfen zu einer Zeit, zu der eluierten Probe von Schritt 2.2.18 bis zu seiner Farbe hinzuWird blau. Fahren Sie zu den nächsten Röhren. </li><li> Die Proben aus Schritt 2.2.18 bei 70-90 ° C für 10 min kochen. Gehen Sie sofort zur Gelelektrophorese vor. Alternativ die Proben in einen Gefrierschrank bei -80 ° C bis zum Beladen transportieren. </li></ol></li><li> Downstream Anwendung: Gelelektrophorese gefolgt von Western Blot <ol><li> Trennung und Stapelung von SDS-PAGE-Acrylamidgelen (1,5 mm Dicke) nach Standardverfahren vorbereiten 15 . HINWEIS: Die Wahl des Gels (8-15% Acrylamid, Gradient: siehe Tabelle der Materialien ) sollte auf der Grundlage der Molekulargröße des zu präzipitierenden Proteins und der zu analysierenden potentiellen Bindungspartner bestimmt werden. Diese Proteine ​​müssen voneinander gelöst werden, um eine ordnungsgemäße Immunodetektion zu ermöglichen. </li><li> Tauen Sie die Immunopräzipitation (IP) - unvermittelten Proben (Schritt 2.2.20) auf Eis. </li><li> Bereiten Sie Protein-Lysate aus den gleichen Proben (für die IP-Verfahren oben verwendet). Verwenden Sie 50Μg Gesamtlysat und fügt 4X Laemmli Probenpuffer hinzu. Kochen Sie die Proben bei 70-90 ° C für 5 min und legen Sie auf Eis bis zum Laden. HINWEIS: Diese Proben werden neben der eluierten IP-Probe geladen, um das Vorhandensein von ausgefällten Proteinen im Gesamtlysat zu demonstrieren. </li><li> Laden Sie die vorbereiteten Lysate aus Schritt 2.3.3 und die ausgefällten Proben aus Schritt 2.2.20 Seite an Seite in ein Acrylamidgel und führen sie in laufenden Puffer (10x Laufpuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g Glycin und 10 G SDS in 1 l destilliertem Wasser) bei 100 V für ca. 95 min oder bis der Rand der wandernden Proteine ​​den Boden des Gels erreicht. </li><li> Übertragen Sie die Gele auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran unter Verwendung eines Standardprotokolls 9 , 15 . </li><li> Blockieren Sie die Membran für 1 h auf einer Wippe bei niedriger Geschwindigkeit in 5% Trockenmilch-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl und 0,05% Polysorbat 20). </li><li> Identifizieren Sie, ob der Niederschlag erfolgreich warSchüchtern <ol><li> Sonde die Membran unter Verwendung des ersten Antikörpers gegen das ausgefällte Protein, verdünnt in 5% Trockenmilch-TTBS in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration über Nacht bei 4 ° C auf einer Schaukelplattform mit langsamer Bewegung. HINWEIS: Siehe die Tabelle der Materialien für Empfehlungen. </li><li> Am nächsten Tag die Membran 3 mal für jeweils 5 min mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Rührung waschen. </li><li> Inkubieren Sie die Membran in dem geeigneten sekundären Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), verdünnt in TTBS, für 1 h bei RT auf einer Schaukelplattform mit langsamen Rühren. ANMERKUNG: Alternativ kann ein mit einem Fluorochrom konjugiertes sekundäres Antikörper verwendet werden, wenn eine entsprechende Vorrichtung zur Erkennung des Signals verfügbar ist. </li><li> Führen Sie 3 bis 6 Wäschen, jeweils für 5 min, mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Bewegung. Analysieren Sie das Signal des sekundären Antikörpers durch Inkubieren der Membran mit einem kommerziellen aVailable luminol solution (siehe Tabelle der Materialien ) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Erfassen Sie das Signal mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien ). HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Western-Blot-Analyse siehe Referenz 16. </li></ol></li><li> Um interagierende Proteine ​​zu identifizieren, führen Sie die Schritte 2.3.7.1-2.3.7.4 mit den entsprechenden Antikörpern auf dem gleichen Blot durch. HINWEIS: Wenn die Proteine ​​interagieren, werden die Bindungspartner mit dem Zielprotein co-immunpräzipitiert und sind somit durch Western-Blotting nachweisbar. Schritt 2.3.8 kann mit mehr Antikörpern wiederholt werden, um festzustellen, ob sich andere Proteine ​​in demselben Protein-Komplex befinden, solange sich die Molekulargewichte der Proteine ​​so stark unterscheiden, dass sie auf dem Gel und der Membran gut getrennt sind. </li><li> Um zu bestätigen, dass die identifizierten Bindungspartner keine Artefakte sind, sollte reziproke IP durchgeführt werden. HINWEIS: Dies wird durch Wiederholen durchgeführtSchritte 2.2.1-2.2.20 mit dem gleichen Lysat, aber Ausfällen eines der in Schritt 3.8 identifizierten Bindungspartner. Dann werden die Schritte 3.1-3.8 unter Verwendung des primären Antikörpers gegen das erste interessierende Protein wiederholt. </li></ol></li></ol>

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Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Fredriksson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+surrounding+occludin+and+claudin-4+reveals+their+proximity+to+signaling+and+trafficking+networks.">Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes.">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Zell-Zell-Interaktionen über Kreuzungen sind für die richtige Funktion und Entwicklung von vielen Organen, wie die Brustdrüse erforderlich. Studien haben gezeigt, dass junctionale Proteine ​​die Funktion und Stabilität voneinander regulieren und die Signaltransduktion durch die Bindung an der Zellmembran 10 aktivieren können. Die Protokolle, die in der aktuellen Manuskript präsentiert wurden, haben interessante Ergebnisse über die junctionale Protein-Differential-Expression, Lokalisier...

Mamma-Drüsenwachstum und -entwicklung erfolgt vor allem nach der Geburt. Dieses Organ umgibt sich ständig während des Fortpflanzungslebens eines Säugetiers 1 . Das erwachsene Brustdrüsenepithel besteht aus einer inneren Schicht von luminalen Epithelzellen und einer äußeren Schicht von Basalzellen, die hauptsächlich aus Myoepithelzellen besteht und von einer Basalmembran 2 umgeben ist. Für eine gute Übersicht über die Brustdrüsenstruktur und -entwicklung kann sich der Leser auf Sternlicht 1 beziehen. Für die normale Entwicklung und Funktion der Drüse 1 , 3 , 4 , 5 , 6 sind Zell-Zell-Wechselwirkungen über Lücke (GJ), enge (TJ) und Adhärens (AJ) -Knoten erforderlich. Die Hauptbestandteile dieser Übergänge in der Mäuse-Brustdrüse sind Cx26, Cx30, Cx32 und Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 und -7 undZO-1 (TJ); Und E-Cadherin, P-Cadherin und β-Catenin (AJ) 7 , 8 . Die Expressionsniveaus dieser verschiedenen junctionalen Proteine ​​variieren in einer stadienabhängigen Weise während der Brustdrüsenentwicklung, was auf differentielle Zell-Zell-Interaktionsanforderungen hindeutet. GJ, TJ und AJ sind strukturell und funktionell verknüpft und fesseln andere strukturelle oder regulatorische Proteine ​​an die benachbarten Stellen benachbarter Zellen und schaffen so einen Junction-Nexus 10 . Die Zusammensetzung des Junction-Nexus kann die Überbrückung mit dem darunter liegenden Zytoskelett sowie die Nexus-Permeabilität und -Stabilität beeinflussen und kann folglich die Funktion der Drüse 8 , 9 , 10 , 11 beeinflussen. Die Bestandteile von interzellulären Übergängen, die sich in junctionalen Nexusionen befinden oder miteinander in difDie Entwicklungsstadien der Entwicklung der Brustdrüsen wurden vor kurzem mit Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) und Co-Immunpräzipitation (Co-IP) 9 analysiert. Während andere Techniken die Auswertung der funktionalen Assoziation zwischen Proteinen erlauben, werden diese Methoden in diesem Manuskript nicht dargestellt. Da Proteine ​​nur alleine funktionieren, ist das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs), wie Signaltransduktionen und biochemischen Kaskaden, für viele Forscher von wesentlicher Bedeutung und kann signifikante Informationen über die Funktion von Proteinen liefern. Co-IF und mikroskopische Analyse helfen, einige Proteine ​​zu bewerten, die denselben subzellulären Raum teilen. Allerdings ist die Anzahl der Ziele durch die Antikörper begrenzt, die bei verschiedenen Tieren angehoben werden müssen, und durch den Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das mit verschiedenen Wellenlängenlasern und einem Spektraldetektor zum Multiplexen ausgestattet ist. Co-IP bestätigt oder zeigt hochaffine physikalische Wechselwirkungen zwischenZwei oder mehr Proteine, die sich innerhalb eines Proteinkomplexes befinden Trotz der Entwicklung neuartiger Techniken wie der Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 12 und dem Proximity-Ligation Assay (PLA) 13 , die gleichzeitig die Lokalisierung und Interaktionen von Proteinen nachweisen können, bleibt Co-IP eine geeignete und erschwingliche Technik, um Wechselwirkungen zwischen ihnen zu untersuchen Endogene Proteine. Die Schritt-für-Schritt-Methode, die in diesem Manuskript beschrieben wird, erleichtert das Studium der Proteinlokalisierung und der PPIs und weist auf Fallstricke hin, um beim Studium endogener PPIs in den Brustdrüsen zu vermeiden. Die Methodik beginnt mit der Präsentation der verschiedenen Konservierungsverfahren für die für jede Technik benötigten Gewebe. Teil 1 präsentiert, wie man die Protein-Co-Lokalisation in drei Schritten untersucht: i) die Sektion von Milchdrüsen, ii) die Doppel- oder Dreifachmarkierung verschiedener Proteine ​​unter Verwendung der Co-IF-Technik und iii) die Abbildung vonProteinlokalisierung Teil 2 zeigt, wie man ein endogenes Protein ausfällt und seine interagierenden Proteine ​​in drei Schritten identifiziert: i) Lysatpräparation, ii) indirekte Proteinimmunpräzipitation und iii) Bindungspartneridentifikation durch SDS-PAGE und Western Blot. Jeder Schritt dieses Protokolls ist für Nagetier-Brustdrüsengewebe optimiert und erzeugt qualitativ hochwertige, spezifische und reproduzierbare Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch als Ausgangspunkt für PPI-Studien in anderen Geweben oder Zelllinien verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Mice strain and stage</td><td>St. Constant, Quebec, Canada</td><td></td><td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;&lt;br/&gt; 2) Adjust the PH to 7.4;&lt;br/&gt; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.</td></tr><tr><td>TBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;&lt;br/&gt;2) Adjust the pH to 7.5;&lt;br /&gt;3) Add water to reach to the 1 L final volume.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Part 1: Immunofluorescence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Freezing media</td><td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td><td>95067-840</td><td>VMR frozen sections compound&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Mississauga, ON, Canada</td><td>956640</td><td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz</td></tr><tr><td>Blades</td><td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&amp;nbsp;Scientifiques&amp;nbsp;ESBE&amp;nbsp;St-Laurent, QC, Canada</td><td>BLM1001C</td><td>High profile gold coated blades</td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td><td>8899</td><td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td></tr><tr><td>Microscopic slides</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>12-550-15</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Superfrost Plus Microscope Slides</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td><td>FOR201.1</td><td>Forlmadehyde</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>3% BSA in TBS</td></tr><tr><td>Wash solution</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Oakville, ON, Canada</td><td>P 9416</td><td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Cedarlane, Burlington, ON</td><td>17984-25(EM)</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&amp;nbsp;</td><td>See Comments</td><td>&amp;beta;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>Connexin26&amp;nbsp; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclei stain</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>D1306</td><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td><td></td><td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Software of IF images analysis</td><td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td><td></td><td>NIS-elements software (version 4)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Part 2: Immunoprecipitation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Triple-detergent Lysis buffer (100&amp;nbsp;mL) pH=8.0</td><td></td><td></td><td>1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150&amp;nbsp;mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&lt;br/&gt; 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6&amp;nbsp;N (~0.5&amp;nbsp;mL).&lt;br/&gt; 3) Adjust the volume to 100&amp;nbsp;mL. Keep it in fridge.&lt;br/&gt; At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:&lt;br/&gt; Sodium Fluoride (stock) solution 1.25&amp;nbsp;M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1&amp;nbsp;M (F.W.: 183.9)</td></tr><tr><td>Protease/phosphatase inhibitor</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>78441</td><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td></tr><tr><td>Protein dosage</td><td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td><td>23225</td><td>Pierce BCA protein assay kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue grinder</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>FTH-115</td><td>Power 125, Model FTH-115</td></tr><tr><td>Magnetic beads and stand</td><td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td><td></td><td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td></tr><tr><td>Wash solution for IP</td><td></td><td></td><td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4&amp;nbsp;&amp;micro;L/200&amp;nbsp;&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Laemmli buffer&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td><td>1610747</td><td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &amp;beta;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td></tr><tr><td>Acidic glycine&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>PB381-5</td><td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>BP152-1</td><td>1 M (pH=8)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS-PAGE acrylamide gels&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1610180 -5</td><td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td></tr><tr><td>Running buffer 10x&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>Tris 30.3&amp;nbsp;g/glycine 144.1&amp;nbsp;g /SDS 10&amp;nbsp;g in 1 L distilled water</td></tr><tr><td>Membranes</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td></tr><tr><td>Transfer method</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704155</td><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td></tr><tr><td>Dry Milk</td><td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td><td></td><td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td></tr><tr><td>Blocking solution for blots</td><td></td><td></td><td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Washing solutions for blots</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Luminol solution for signal detection on blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1705061</td><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td></tr><tr><td>Imaging blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1708280</td><td>ChemiDoc MP imaging system</td></tr><tr><td>Analayzing blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td></td><td>ImageLab 5.2 software&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

Zell-Zell-Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Gewebeintegrität und der Barriere zwischen den verschiedenen Kompartimenten der Brustdrüse. Diese Wechselwirkungen werden durch junctionale Proteine ​​bereitgestellt, die Nexus zwischen benachbarten Zellen bilden. Junctional Protein-Mislocalisierung und reduzierte physikalische Assoziationen mit ihren Bindungspartnern können zum Verlust der Funktion und damit zur Organ-Dysfunktion führen. Somit ist die Identifizierung von Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in normalen und krankheitsbezogenen Geweben unerlässlich, um neue Beweise und Mechanismen zu finden, die zum Fortschreiten von Krankheiten oder Veränderungen im Entwicklungsstatus führen. Dieses Manuskript stellt eine zweistufige Methode zur Beurteilung von PPIs in murinen Brustdrüsen dar. Im Protokollabschnitt 1 wird ein Verfahren zur Durchführung von Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die interessierenden Proteine ​​angehoben werden, gefolgt von sekundären Antikörpern, die mit Fluorochromen markiert sind, beschrieben. Obwohl Co-IF alleOws für die Demonstration der Nähe der Proteine, macht es möglich, ihre physikalischen Wechselwirkungen zu studieren. Daher wird im Protokollabschnitt 2 ein detailliertes Protokoll zur Co-Immunpräzipitation (Co-IP) bereitgestellt. Dieses Verfahren wird verwendet, um die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen, ohne zu bestätigen, ob diese Wechselwirkungen direkt oder indirekt sind. In den letzten Jahren haben Co-IF- und Co-IP-Techniken gezeigt, dass bestimmte Komponenten von interzellulären Knotenpunkten zusammen lokalisieren und miteinander interagieren, wodurch stadienabhängige Junction-Nexusen entstehen, die während der Brustdrüsenentwicklung variieren.

Um zu bestimmen, ob GJ-, AJ- und TJ-Komponenten in der Brustdrüse zusammenwirken können, wurden zuerst Co-IF-Assays durchgeführt. Cx26, ein GJ-Protein und β-Catenin, ein AJ-Protein, wurden mit spezifischen Antikörpern untersucht und unter Verwendung von Fluorophor-konjugierten Maus-647 (Grün-, Pseudofarb-) und Ziegen-568 (roten) Antikörpern ( 1B und C ) . Die Daten zeigten, dass sie sich an der Zellmembran von Epithelzellen in der Mäuse-Brustdrü...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Interzelluläre Übergänge sind Requisiten für Brustdrüsen-Bühnenspezifische Funktionen und Entwicklung. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Co-Lokalisierung mit Hilfe von murinen Brustdrüsen. Diese Techniken erlauben die Untersuchung der Dynamik der physikalischen Assoziation zwischen interzellulären Übergängen in verschiedenen Entwicklungsstadien.

Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Aufrufe.  INRS, Institut Armand-Frappier.  Interzelluläre Übergänge sind Requisiten für Brustdrüsen-Bühnenspezifische Funktionen und Entwicklung. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Co-Lokalisierung mit Hilfe von murinen Brustdrüsen. Diese Techniken erlauben die Untersuchung der Dynamik der physikalischen Assoziation zwischen interzellulären Übergängen in verschiedenen Entwicklungsstadien. 

Serie: Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Forschung

Krebsforschung

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Entwicklungsbiologie

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biotechnik

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biologie

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...