著者は、このプロジェクトの技術的な専門知識とサポートのために、Pam Ovwigho、Tenette Jones、NIEHSのNatasha Claytonに感謝します。

この研究のための全ての動物の使用および処置は、NIEHS実験動物ケア・ユース委員会を設置し、 実験動物保護認定施設。 1.乳腺ホールマウント調製2、3、6、7 <ol><li>参考文献3に記載されているように、妊娠していないCD-1雌マウスの片側から鼠径乳腺を取り出し、それらを静電気帯電したスライド上に置く。 </li><li>グランドを覆っていない紙やフィルムで覆い、別のスライドを上に置きます。滑り止めのためにグランドがスライドにくっつくように、グランドを平らに広げるためにスライドに圧力（ すなわち水の重量）を加えます。 </li><li>スライドを固定液（ 例えば、エタノール、クロロホルム、氷酢酸を6：3：1の比で 100％）に浸し、室温で一晩インキュベートする。 </li><li>固定液から腺を取り出し、エタノールで15〜30分間洗浄する。 30分の洗浄後、エタノールの1/3を注ぎ水を加えて徐々に水に変えます。毎回約5分間洗っておき、水を3回加えることを繰り返す。 </li><li> 12〜24時間、染色（ 例えば、カルミンミョウバン溶液）。 注：厚い組織はより長い染色時間を必要とします。染色の詳細については、参考文献3を参照のこと。 </li><li>割り当てられた時間の後に汚れをはがし、水中で30秒間すすいでください。 70％エタノール中でスライドを15分間洗浄することにより組織を脱水し、続いて95％エタノール中で15分間洗浄し、100％エタノール中で最終洗浄を20分間行う。 </li><li>組織から脂肪を取り除くには、少なくとも24時間キシレンに入れてください。組織が厚い場合は、不透明または白色の部分が除去されるようにしてください。 </li><li>組織をキシレンから取り出し、すぐにm組織の脱水を避けるためにスライドに培地を滲ませる;カバースリップを上に置きます。スライドを少なくとも48時間乾燥させる。 </li><li> 2。で説明したように、異常がないかどうかを評価する。 注：病変が全体的に検出され、識別が必要な場合は、以下の手順に従ってください。 </li></ol> 2.ガラススライドからの乳腺全体の除去<ol><li>乳腺の全マウントスライドをキシレンで満たしたガラス染色ジャーに一晩浸して、カバースリップおよびマウント媒体を除去する。 注：余分なマウントソリューションを持つ厚い組織やスライドは、カバースリップの取り外しに時間がかかることがあります。 </li><li>最初に一晩浸漬した後、新鮮なキシレンにスライドを置き、6時間浸す。新鮮なキシレンで一晩最終浸漬を行う。 注：カバースリップは最後の浸漬後にスライドから容易に外れます。 </li><li> agとスライドを保持し、慎重にそれが一体に取り外されることを確認するために鉗子のペアでカバースリップを削除します。 注：カバースリップがガラススライドに取り付けられている場合は、少しでも取り除くことができるまで浸漬を続けます。 </li><li>カバースリップが除去されたら、スライドをキシレンを含むガラスペトリ皿に垂直に保持し、注意深く鋭利な使い捨てのカミソリの刃をとり、スライドを1回の動きでブレードをスライドさせます。 </li><li>組織が除去されたら、速やかに乳房パッドをキシレンで満たされたガラスペトリ皿に沈め、組織が空気乾燥しないようにします。 注：この手順に注意してください。マウント全体は薄く（1mm以下）、キシレン処理では壊れやすい。いずれの印象または涙も組織の形態を変化させ、後の評価を複雑にする可能性がある。 </li></ol> 3.組織処理<ol><li>組織がペトリ皿に入ったら、慎重にそれを移す標識された組織学的カセットに移す。組織の損傷を最小限に抑えるために、鈍い鼻、鋸歯状の鉗子で脂肪パッドの端をつかみます。 <ol><li>カミソリを使用して、より大きな組織（特にラットの場合）を半分にカットし、組織サイズに適合する2つの別々のラベル付きカセットにそれらを入れる。右に組織を置きます（参照としてリンパ節を使用してください）。リンパ節のない組織は、カセットに移したときに、直立した同じ位置に保持されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>カセットをキシレンの容器に最大2時間入れてからティッシュプロセッサーに入れます。 注：サンプルをカセットに入れた同じ日に処理することをお勧めします。キシレン中での長期浸漬は試験されていない。 </li><li>最大数のカセットを手で組織処理装置に装填する。 </li><li>開始前に、このプロセスで使用するすべての試薬をプロセッサの試薬リストに登録してください。動きを自動化するあるステーションから次のステーションへ、メニューオプションを使用して新しいプログラムを作成します。すべてのステップが完了したら、「OK」を選択して続行します。 注：プロセッサは、開始する前にすべてのステーションの詳細を確認することができます。 <ol><li>プロセッサーを自動化して、37℃で30分間キシレンに浸し、同じ条件下で新鮮なキシレンで2回浸漬します。プロセッサーを自動化して、キシレン溶液からカセットを取り出し、60℃に設定した1：1キシレン：溶融パラフィン混合物を含む次のステーションに組織を30分間移す。 注：プロセッサは、カセットを溶融パラフィンが入った新しいチャンバーに1時間移します。 1時間後、試料は新しい溶融パラフィンの新しいチャンバーに自動的に移され、さらに2時間処理される。両方の工程を60℃で行う。 </li><li>次いで、プロセッサは、カセットを溶融パラを含むステーションに移送する1時間ffin。次に、試料を新しい溶融パラフィンの最終ステーションに自動的に移し、さらに2時間処理する。両方の工程を60℃で行う。 </li></ol></li></ol> 4.処理された乳腺組織の包埋<ol><li>金型に組織を埋め込む準備が整うまで、包埋ステーションの58°Cパラフィン保持タンクにカセットを置きます。 </li><li>カセットカバーを取り外して、組織の最適なモールドサイズを決定します。金型が組織を収容するのに十分な大きさであることを確認し、周囲にパラフィンの組織がない境界を有する十分な空間を残す。 </li><li>溶融パラフィン3〜4mmを金型に​​加え、スライドガラスの底面とカセットの底面に隣接している乳房全面マウント面を金型内に向けます。 </li><li>金型を冷却プレートに移し、必要に応じて金型bと平行になるように組織をすばやく調整しますオットム。 注：パラフィンが硬化すると、組織は固定されます。 </li><li>温かい鉗子を使用して、ラベルの付いたカセットの下半分をモールドの上に置きます。鉗子をしっかりと押してください。 </li><li>カセット全体を覆う連続的な動きでモールドに溶融パラフィンを追加します。金型を温かいプレートからコールドプレートに移動して、ブロックの硬化を完了させます。 </li><li>パラフィンが完全に凝固して亀裂や気泡が発生しないように、モールドからブロックを取り外します。 注意：パラフィン包埋した組織は、切片ができるまで室温で保管してください。 </li></ol> 5.ミクロトーム上にパラフィン包埋された乳房組織を切片化する<ol><li>切片化する前にパラフィンブロックを-20℃で1時間インキュベートする。 注：元のカバーガラス付き全マウントティッシュから、ブロック内に残っているマウントメディアがあります。ブロックを冷やすと、ブロックのセクションとリボンが改善されます。 </li><li>マイクを準備する新鮮な蒸留水を入れた水浴をオンにし、温度を42〜45℃に調整することにより、ロトームを得る。新しく薄型のブレードをミクロトームに置き、4μmにセットします。 注記：セクションの品質は、ティッシュに残っているマウント媒体があるため、4μmよりも厚いセクションでは減少します。 </li><li>ワックスをブレー​​ドに向け、垂直面に合わせてブロックをミクロトームに挿入します。次に、冷水中のガーゼパッドの部分を湿らせ、ブロックに数分間置きます。 </li><li>粗い前進した車輪と組み合わせて、大きな輪を時計回りの方向に回転させて、ブロックの全面または代表部分が得られるまでブロックを切断する。 注記：全マウントプロセス中にキシレンが除去されるため、ティッシュは薄いです。代表的なセクションを取得する際のカット数を最小限に抑えるため、ブロックをブレードと適切に揃えます。 </li><li>リボンを選ぶ（45℃）のウォーターバス（前もって準備されています）にリボンを慎重に浮かせて、組織のしわが消散して清潔なガラススライド上に注意深く浮かせます。 </li><li>余分な水分を除去するためにスライドを乾燥ラックに直立させて置きます。スライドをわずかに開いたスライドボックスに37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 6.切片化乳腺組織の自動および手動H＆E染色<ol><li>染色前に、スライドを室温で保存する。 </li><li>自動染色の場合は、メインメニューの染色オプションからH＆Eを選択します。脱パラフィン、染色、および脱水はすべて、自動化された染色装置で完了する。マウントメディアとカバーガラスを使用してセクションをマウントします。 </li><li>手動でスライドを染色する場合は、スライドをキシレンに5分間浸漬して切片を脱パラフィンする。新しいキシレンに移し、5分間繰り返す。 </li><li> thを浸してスライドを再水和する100％エタノール中でそれぞれ3分間2回、続いて新鮮な95％エタノール中で2回反復し、5分間毎に1X洗浄緩衝液中で2回洗浄した。 </li><li>スライドを蒸留水ですすいでください。 </li><li>スライドを1-2分間ヘマトキシリンに添加する。スライドを取り出し、水道水で5分間すすいでください。 注：各使用前にヘマトキシリンをろ過する。 </li><li>スライドを1％氷酢酸中に30秒間置いて色分化を促進させ、次いで水道水を1分間すすいですすいでください。 </li><li>スライドを1X PBSに30秒〜1分間添加して組織切片を青色にし、続いて水道水で5分間すすぎ、次に95％アルコールで15〜20秒間すすぎます。 </li><li>エオシン溶液で30秒〜1分間対比染色する。これに続いて、新鮮な95％エタノール中でスライドを2回脱水し​​、続いて100％エタノール中で2回新鮮な繰り返しを行う。各洗浄を5分間行う。 </li><li> 5分間キシレンを2回変えて、キシレン中のスライドを透明にする。 </li><li> Coverslip培地を載せた組織切片を室温で一晩乾燥させた。 </li></ol>

<ol>
	<li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+exposures+and+mammary+gland+development:+State+of+the+science,+public+health,+implications,+and+research+recommendations.">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li><li>Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+via+Nurture:+Effect+of+Diet+on+Health,+Obesity,+and+Safety+Assessment.">Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment.</a> Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).</li><li>Stanko, J. P., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+branching+density+in+rat+mammary+gland+whole+mounts+using+the+Sholl+analysis+method.">Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Filgo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+evaluation+in+juvenile+toxicity+studies:+Temporal+developmental+patterns+in+the+male+and+female+Harlan+Sprague+Dawley+Rat.">Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high-quality+hematoxylin+and+eosin-stained+sections+from+rodent+mammary+gland+whole+mounts+for+histopathologic+review.">Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li><li>Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+preparation+of+tissue+sections+from+the+rat+mammary+gland.">An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland.</a> Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).</li><li>Munoz-de-Toro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+exposure+to+bisphenol-A+alters+peripubertal+mammary+gland+development+in+mice.">Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice.</a> Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).</li><li>Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+exposure+to+the+phytoestrogen+genistein+alters+mammary+gland+growth+and+developmental+programming+of+hormone+receptor+levels.">Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels.</a> Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).</li><li>Nikaido, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+maternal+xenotestrogen+exposure+on+development+of+the+reproductive+tract+and+mammary+gland+in+female+CD-1+mouse+offspring.">Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring.</a> Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).</li></ol>

著者は、この記事の研究、著者、および/または出版に関して、矛盾する利益を宣言することはない。

乳腺全体マウントは、内分泌かく乱物質を含む化学物質への暴露後に生じる可能性のある正常な乳腺発達および形態変化を説明するのに使用できる強力なツールである。同じ動物の全体のマウントとH＆Eセクションが一緒に評価されると、早期の変化の正確な視覚的スナップショットを提供することができ、より病的な状態に進化することができる。 この有用な情報を得...

乳房全体のマウントは、正常および化学的に誘発された異常な発達の両方を理解するために、多くのラットおよびマウスの研究で実施される有用で安価な方法である。一般に、げっ歯類発達中の様々な段階（ すなわち、青年期、思春期、中期〜後期妊娠期、および退縮段階）で収集された乳腺は、パラクリン、内分泌およびオートクリン因子によって影響される組織および細胞構造の形態変化を示す1 。老化ラットでは、腺の上皮および間質部分がますます稠密になり、全体的に形態学的パラメーターを測定することが困難になる。したがって、顕微鏡レベルでの変化を同定するために組織学的評価のために腺を採取することが一般的なプラクティスである。両方のプロセスは、化学暴露（ すなわち、環境または薬学的）を伴う研究、または遺伝子改変を伴う形態学的変化を調べる研究において特に有用であるations。 リスク評価において乳腺を使用するための技術および能力は進化し続けている。全マウント準備ルーチンと標準化されながら、切片の変更は2、3を続けます。いくつかの研究室が依然として皮膚4を介してクロスカット部を使用しながら、様々なバックグラウンド（ すなわち、学界、政府、産業界）から多くの研究グループが、好ましい方法として、乳房組織の縦/冠状切片を適応しています。後者の方法は、興味のある組織ではなく、表皮（皮膚）の過度の表現をもたらす：乳腺上皮2 。冠状部または縦断面は、正常組織5の特徴付けに有用であり、存在する表面積および構造の数の増加による異常および病変の検出を大幅に改善する。全体的にみると、乳腺1,2の比較組織病理学的評価のためUNT適した方法。マウスまたはラットを使用するかどうかにかかわらず、 第 4および第 5鼠径部の腺の回収および保存は、対側H＆Eセクション全体との比較に強く推奨されます。 H＆Eセクションとマウント全体を組み合わせて使用​​すると、環境暴露によって引き起こされる細胞と形態変化を正確に説明することができます。これは、モデルが腫瘍形成に対する低い感受性を有するか、または腫瘍が肉眼で見えない特定のげっ歯類株において特に当てはまる。状況によっては、両方の技術（ すなわち、不十分な組織量、リソース、または予期しない実験結果）を使用して、必要な組織を得ることが常に可能であるとは限らない場合もある。本発明者らの場合、乳房全体の異常が観察されたが、組織病反対側のH＆E腺における論理的所見はほとんど正常であった。反対側の腺間の圧倒的な不一致は、我々がマウント全体の異常を特定するための経済的で効率的な手順を開発するように導いた。改良された処理および包埋手順を用いて、パラフィン包埋された全マウントから高品質のH＆E染色切片を調製した。我々は、このプロトコルが化学物質曝露効果の強力な検出ツールとなり、実験室間比較を強化することを想像している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Xylene</td>
			<td style="width:309px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">214736</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>mounting media for coverslipping whole mounts and H&#38;E sections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Leica automated processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Model # ST5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">HM 355S Automatic Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>905200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Paraffin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:152px;">EM-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">4951PLUS-001</td>
			<td>electrostatically charged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Fisher Finest 24x60x1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">12-548-5P</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Varistain Gemini ES Automatic slide stainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A78000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Sta-On</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803107</td>
			<td>liquid adhesive; used in water bath at sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Harris Hematoxylin 72711</td>
			<td>Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific)</td>
			<td>72711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Lithium Carbonate</td>
			<td>SkyTech Laboratories</td>
			<td style="width:152px;">LCQ500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">A38-500</td>
			<td>needed in Carnoy&#39;s fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Chloroform</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:152px;">4440-04</td>
			<td>needed in Carnoy&#39;s fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">100% Ethanol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td style="width:152px;">6505001050000</td>
			<td>needed in Carnoy&#39;s fixative and washing slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">95% Ethanol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td style="width:152px;">6505011137320190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Carmine Alum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">C1022-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:385px;">Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A7210-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Automation wash buffer, 20X</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>TWB945</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification

正常な乳腺発達は、環境毒素および医薬品への暴露、ホルモンへの過剰な暴露、および遺伝子改変によって変更される可能性がある。乳腺マウント全体は、暴露後に起こる形態変化の進行を捕捉するための安価な方法である。しかし、後の人生では、異常がより発生しやすい場合、この1つの方法に依存するだけでは、異常の適切な診断を行うのに十分な情報を提供できない場合があります。歴史的に、化学的試験ガイドライン研究では、単一の乳腺が剖検時に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色セクションとして調製される。反対側の乳房全身収集および分析の導入は、偽陰性評価の可能性を減少させる。マウント全体の評価は、スライド上の1つまたは2つの乳腺全体の存在によって制限され、ある場合には、マウント全体で観察される異常は、H＆Eセクションで一様に表現されています。この研究の目的は、カバーされていない乳腺全体マウントをH＆E染色された切片に変換するためのプロトコールを開発し、そうしなければ欠落していたかまたは診断困難な病変を同定できるようにすることであった。ここでは、最初に全体のマウントとして準備された乳腺から、高品質でパラフィン包埋されたH＆Eセクションを生成する方法を詳述します。 H＆E切片化のために意図的に調製された組織と比較して、全体のマウントは、組織の除去および処理のためのさらなる準備を必要とする。しかしながら、この方法は、一般的なラボ試薬および追加の時間をほとんど必要としないので、安価であると考えられている。結果として、この方法は、化学的および環境的曝露がどのようにして正常な哺乳類の発達を変化させるか、ならびに遺伝子改変のために生じる変化の表示に関する貴重な情報を提供することができる。

この方法は、乳房パッドの最初の反対側のH＆Eセクションが組織学的変化を示さなかった場合に欠けていたかもしれない診断を支援するのに有効である。しかし、組織学的評価のための組織の調製の間だけでなく、最初の全マウント調製中に注意を払う場合には、結果は有用である。パラフィン包埋は保護を提供し、将来の断裂のために組織を保存するのに役立つで?...

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。

病変同定のための乳腺全体マウントの分割

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

sectioning-mammary-gland-whole-mounts-for-lesion-identification

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. 当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

がん研究

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations occurring in these genes are often related to tumorigenesis in human. No data are available today regarding the possible correlation between OTX genes and tumors of the nasal cavity. The aim of this work is to understand if OTX1 and OTX2 can be considered as molecular markers in the development of nasal tumors. We selected nasal and sinonasal adenocarcinomas to investigate the expression of OTX1 and OTX2 genes through immunohistochemical and real-time PCR analyses.Both OTX1 and OTX2 were absent in all the samples of sinonasal Intestinal-Type Adenocarcinomas (ITACs). OTX1 mRNA was identified only in Non-Intestinal Type Adenocarcinomas (NITACs) while OTX2 mRNA was expressed only in Olfactory Neuroblastomas (ONs). We have demonstrated that the differential gene expression for both OTX1 and OTX2 genes might be a useful molecular marker to distinguish the different types of sinonasal tumors.

Homeobox genes are regulatory genes often associated with tumors in the adult organisms. We investigated their comparative expression by immunohistochemical and real-time PCR analysis, in normal and inflammatory nasal mucosae and in sinonasal neoplasms in order to use them as possible diagnostic and therapeutic targets.

副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are instrumental in gaining insights into these complex processes. Although many mouse models have been developed to study contributions of various oncogenic events and cells of origin to breast tumorigenesis, these models are often not cell-type or organ specific or cannot induce the initiation of mammary tumorigenesis in a temporally controlled manner. Here we describe a protocol to generate a new type of breast cancer mouse models based on the intraductal injection of Cre-expressing adenovirus (Ad-Cre) into mouse mammary glands (MGs). Due to the direct injection of Ad-Cre into mammary ducts, this approach is MG specific, without any unwanted cancer induction in other organs. The intraductal injection procedure can be performed in mice at different stages of their MG development (thus, it permits temporal control of cancer induction, starting from ~3-4 weeks of age). The cell-type specificity can be achieved by using different cell-type-specific promoters to drive Cre expression in the adenoviral vector. We show that luminal and basal mammary epithelial cells (MECs) can be tightly targeted for Cre/loxP-based genetic manipulation via an intraductal injection of Ad-Cre under the control of the Keratin 8 or Keratin 5 promoter, respectively. By incorporating a conditional Cre reporter (e.g., Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP reporter), we show that MECs targeted by Ad-Cre, and tumor cells derived from them, can be traced by following the reporter-positive cells after intraductal injection.

The goal of this protocol is to describe a new breast cancer modeling approach based on the intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into mouse mammary glands. This approach allows both cell-type- and organ-specific manipulation of oncogenic events in a temporally controlled manner.

マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

ケノハブディティス・エレガンスを用いたEGFRおよびRAS阻害剤の同定

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...