Name: sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
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著者は、このプロジェクトの技術的な専門知識とサポートのために、Pam Ovwigho、Tenette Jones、NIEHSのNatasha Claytonに感謝します。

この研究のための全ての動物の使用および処置は、NIEHS実験動物ケア・ユース委員会を設置し、 実験動物保護認定施設。 1.乳腺ホールマウント調製2、3、6、7 <ol><li>参考文献3に記載されているように、妊娠していないCD-1雌マウスの片側から鼠径乳腺を取り出し、それらを静電気帯電したスライド上に置く。 </li><li>グランドを覆っていない紙やフィルムで覆い、別のスライドを上に置きます。滑り止めのためにグランドがスライドにくっつくように、グランドを平らに広げるためにスライドに圧力（ すなわち水の重量）を加えます。 </li><li>スライドを固定液（ 例えば、エタノール、クロロホルム、氷酢酸を6：3：1の比で 100％）に浸し、室温で一晩インキュベートする。 </li><li>固定液から腺を取り出し、エタノールで15〜30分間洗浄する。 30分の洗浄後、エタノールの1/3を注ぎ水を加えて徐々に水に変えます。毎回約5分間洗っておき、水を3回加えることを繰り返す。 </li><li> 12〜24時間、染色（ 例えば、カルミンミョウバン溶液）。 注：厚い組織はより長い染色時間を必要とします。染色の詳細については、参考文献3を参照のこと。 </li><li>割り当てられた時間の後に汚れをはがし、水中で30秒間すすいでください。 70％エタノール中でスライドを15分間洗浄することにより組織を脱水し、続いて95％エタノール中で15分間洗浄し、100％エタノール中で最終洗浄を20分間行う。 </li><li>組織から脂肪を取り除くには、少なくとも24時間キシレンに入れてください。組織が厚い場合は、不透明または白色の部分が除去されるようにしてください。 </li><li>組織をキシレンから取り出し、すぐにm組織の脱水を避けるためにスライドに培地を滲ませる;カバースリップを上に置きます。スライドを少なくとも48時間乾燥させる。 </li><li> 2。で説明したように、異常がないかどうかを評価する。 注：病変が全体的に検出され、識別が必要な場合は、以下の手順に従ってください。 </li></ol> 2.ガラススライドからの乳腺全体の除去<ol><li>乳腺の全マウントスライドをキシレンで満たしたガラス染色ジャーに一晩浸して、カバースリップおよびマウント媒体を除去する。 注：余分なマウントソリューションを持つ厚い組織やスライドは、カバースリップの取り外しに時間がかかることがあります。 </li><li>最初に一晩浸漬した後、新鮮なキシレンにスライドを置き、6時間浸す。新鮮なキシレンで一晩最終浸漬を行う。 注：カバースリップは最後の浸漬後にスライドから容易に外れます。 </li><li> agとスライドを保持し、慎重にそれが一体に取り外されることを確認するために鉗子のペアでカバースリップを削除します。 注：カバースリップがガラススライドに取り付けられている場合は、少しでも取り除くことができるまで浸漬を続けます。 </li><li>カバースリップが除去されたら、スライドをキシレンを含むガラスペトリ皿に垂直に保持し、注意深く鋭利な使い捨てのカミソリの刃をとり、スライドを1回の動きでブレードをスライドさせます。 </li><li>組織が除去されたら、速やかに乳房パッドをキシレンで満たされたガラスペトリ皿に沈め、組織が空気乾燥しないようにします。 注：この手順に注意してください。マウント全体は薄く（1mm以下）、キシレン処理では壊れやすい。いずれの印象または涙も組織の形態を変化させ、後の評価を複雑にする可能性がある。 </li></ol> 3.組織処理<ol><li>組織がペトリ皿に入ったら、慎重にそれを移す標識された組織学的カセットに移す。組織の損傷を最小限に抑えるために、鈍い鼻、鋸歯状の鉗子で脂肪パッドの端をつかみます。 <ol><li>カミソリを使用して、より大きな組織（特にラットの場合）を半分にカットし、組織サイズに適合する2つの別々のラベル付きカセットにそれらを入れる。右に組織を置きます（参照としてリンパ節を使用してください）。リンパ節のない組織は、カセットに移したときに、直立した同じ位置に保持されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>カセットをキシレンの容器に最大2時間入れてからティッシュプロセッサーに入れます。 注：サンプルをカセットに入れた同じ日に処理することをお勧めします。キシレン中での長期浸漬は試験されていない。 </li><li>最大数のカセットを手で組織処理装置に装填する。 </li><li>開始前に、このプロセスで使用するすべての試薬をプロセッサの試薬リストに登録してください。動きを自動化するあるステーションから次のステーションへ、メニューオプションを使用して新しいプログラムを作成します。すべてのステップが完了したら、「OK」を選択して続行します。 注：プロセッサは、開始する前にすべてのステーションの詳細を確認することができます。 <ol><li>プロセッサーを自動化して、37℃で30分間キシレンに浸し、同じ条件下で新鮮なキシレンで2回浸漬します。プロセッサーを自動化して、キシレン溶液からカセットを取り出し、60℃に設定した1：1キシレン：溶融パラフィン混合物を含む次のステーションに組織を30分間移す。 注：プロセッサは、カセットを溶融パラフィンが入った新しいチャンバーに1時間移します。 1時間後、試料は新しい溶融パラフィンの新しいチャンバーに自動的に移され、さらに2時間処理される。両方の工程を60℃で行う。 </li><li>次いで、プロセッサは、カセットを溶融パラを含むステーションに移送する1時間ffin。次に、試料を新しい溶融パラフィンの最終ステーションに自動的に移し、さらに2時間処理する。両方の工程を60℃で行う。 </li></ol></li></ol> 4.処理された乳腺組織の包埋<ol><li>金型に組織を埋め込む準備が整うまで、包埋ステーションの58°Cパラフィン保持タンクにカセットを置きます。 </li><li>カセットカバーを取り外して、組織の最適なモールドサイズを決定します。金型が組織を収容するのに十分な大きさであることを確認し、周囲にパラフィンの組織がない境界を有する十分な空間を残す。 </li><li>溶融パラフィン3〜4mmを金型に​​加え、スライドガラスの底面とカセットの底面に隣接している乳房全面マウント面を金型内に向けます。 </li><li>金型を冷却プレートに移し、必要に応じて金型bと平行になるように組織をすばやく調整しますオットム。 注：パラフィンが硬化すると、組織は固定されます。 </li><li>温かい鉗子を使用して、ラベルの付いたカセットの下半分をモールドの上に置きます。鉗子をしっかりと押してください。 </li><li>カセット全体を覆う連続的な動きでモールドに溶融パラフィンを追加します。金型を温かいプレートからコールドプレートに移動して、ブロックの硬化を完了させます。 </li><li>パラフィンが完全に凝固して亀裂や気泡が発生しないように、モールドからブロックを取り外します。 注意：パラフィン包埋した組織は、切片ができるまで室温で保管してください。 </li></ol> 5.ミクロトーム上にパラフィン包埋された乳房組織を切片化する<ol><li>切片化する前にパラフィンブロックを-20℃で1時間インキュベートする。 注：元のカバーガラス付き全マウントティッシュから、ブロック内に残っているマウントメディアがあります。ブロックを冷やすと、ブロックのセクションとリボンが改善されます。 </li><li>マイクを準備する新鮮な蒸留水を入れた水浴をオンにし、温度を42〜45℃に調整することにより、ロトームを得る。新しく薄型のブレードをミクロトームに置き、4μmにセットします。 注記：セクションの品質は、ティッシュに残っているマウント媒体があるため、4μmよりも厚いセクションでは減少します。 </li><li>ワックスをブレー​​ドに向け、垂直面に合わせてブロックをミクロトームに挿入します。次に、冷水中のガーゼパッドの部分を湿らせ、ブロックに数分間置きます。 </li><li>粗い前進した車輪と組み合わせて、大きな輪を時計回りの方向に回転させて、ブロックの全面または代表部分が得られるまでブロックを切断する。 注記：全マウントプロセス中にキシレンが除去されるため、ティッシュは薄いです。代表的なセクションを取得する際のカット数を最小限に抑えるため、ブロックをブレードと適切に揃えます。 </li><li>リボンを選ぶ（45℃）のウォーターバス（前もって準備されています）にリボンを慎重に浮かせて、組織のしわが消散して清潔なガラススライド上に注意深く浮かせます。 </li><li>余分な水分を除去するためにスライドを乾燥ラックに直立させて置きます。スライドをわずかに開いたスライドボックスに37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 6.切片化乳腺組織の自動および手動H＆E染色<ol><li>染色前に、スライドを室温で保存する。 </li><li>自動染色の場合は、メインメニューの染色オプションからH＆Eを選択します。脱パラフィン、染色、および脱水はすべて、自動化された染色装置で完了する。マウントメディアとカバーガラスを使用してセクションをマウントします。 </li><li>手動でスライドを染色する場合は、スライドをキシレンに5分間浸漬して切片を脱パラフィンする。新しいキシレンに移し、5分間繰り返す。 </li><li> thを浸してスライドを再水和する100％エタノール中でそれぞれ3分間2回、続いて新鮮な95％エタノール中で2回反復し、5分間毎に1X洗浄緩衝液中で2回洗浄した。 </li><li>スライドを蒸留水ですすいでください。 </li><li>スライドを1-2分間ヘマトキシリンに添加する。スライドを取り出し、水道水で5分間すすいでください。 注：各使用前にヘマトキシリンをろ過する。 </li><li>スライドを1％氷酢酸中に30秒間置いて色分化を促進させ、次いで水道水を1分間すすいですすいでください。 </li><li>スライドを1X PBSに30秒〜1分間添加して組織切片を青色にし、続いて水道水で5分間すすぎ、次に95％アルコールで15〜20秒間すすぎます。 </li><li>エオシン溶液で30秒〜1分間対比染色する。これに続いて、新鮮な95％エタノール中でスライドを2回脱水し​​、続いて100％エタノール中で2回新鮮な繰り返しを行う。各洗浄を5分間行う。 </li><li> 5分間キシレンを2回変えて、キシレン中のスライドを透明にする。 </li><li> Coverslip培地を載せた組織切片を室温で一晩乾燥させた。 </li></ol>

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著者は、この記事の研究、著者、および/または出版に関して、矛盾する利益を宣言することはない。

乳腺全体マウントは、内分泌かく乱物質を含む化学物質への暴露後に生じる可能性のある正常な乳腺発達および形態変化を説明するのに使用できる強力なツールである。同じ動物の全体のマウントとH＆Eセクションが一緒に評価されると、早期の変化の正確な視覚的スナップショットを提供することができ、より病的な状態に進化することができる。 この有用な情報を得る能力は、組織を除去するときに腺形態を保存し、妥協しないように注意することにある。げっ歯類は、背壁に沿って両側にあるいくつかの乳腺サイトを持っていますが、筋肉組織の回復を最小限にするために4 番目と5 番目の腺を収集することをお勧めします。有用な形態学的ランドマークとして役立つので、乳頭付着領域およびリンパ節も存在するはずである。腺も広げて伸ばすべきですインサイチュでの組織の自然な構造を密接に模倣するために、平らな表面（ すなわちスライドガラス、カードストック、または布）を横切って配置される。乳腺内の異常は、通常、腺がキシレンで脱脂されるか、またはカルミン染色されるまで見えない。組織学的切片作製のためにもともと準備された乳房組織とは異なり、パラフィン包埋のためにガラスから取り除かれた全体のマウントは、非常に薄くて壊れやすくなる。鉗子の印象および組織の裂傷は、細胞形態を変え、最終製品の組織病理学的評価を困難にするので避けるべきである。 マウント全体がパラフィン包埋されたら、切片化する前に、ブロックを-20℃で1時間インキュベートすることが推奨される。この工程は、リボン内の最適な代表組織切片を得る能力を改善する。 6μmでの組織切片化（ 図1A ） 9 </最適解像度に満たない高密度なセルラーアーキテクチャを生み出しました。より薄い部分（ 図1B ） 9を用いることにより、上皮組織および周囲の間質浸潤を含むすべての細胞の特徴が容易に同定された。これらの切片は以前はカルミン染色されていたが、染色は切片化後に見えず、H＆E染色を妨げなかったことにも留意すべきである。したがって、プロトコルで脱染色ステップは必要ではなかった。組織切片はH＆Eのみで染色されましたが、切片作製が完了したら、少し変更するだけで、他の組織化学的染色および免疫組織化学染色が適用されることが予想されます。しかし、それはこのプロトコールの範囲を超えており、これらの染色の最適条件を決定するためにさらなる調査が必要となる。 この手順は、我々が定期的に収集したleマウントおよび対側H＆E染色乳腺切片を同じ動物から採取した。同様の乳房のプロトコルは、10 6存在します。しかし、その手順は詳細ではなく、簡単ではなかった。それらの方法は、我々のプロトコールの開発の基礎を確立した。相補的な全体のマウントは、多数の異常な形態学的特徴（ 図2 のB及び図3 B）を明らかにしながら、正常腺の形態9、（ 図2A及び図3A）1 H＆E染色した組織切片において観察されました。マウント全体を組織学的に分析することにより、異常な特徴を分類することができます。例えば、脈管周囲炎症および卵胞胞状肥厚は、2つの別々のケースで同定されたが、これは、対側で観察されたH＆E所見（ 図 2CおよびDおよび図 3CおよびD ） 9 。 著者らの知るところでは、進行中の研究で観察されたものと同様の乳腺矛盾の報告は知られていない。しかし、これは、RT-PCRまたはウェスタンブロットなどの形態学を伴わない1回の適用または分析のために乳腺が単独で収集されることが多いので、発生の欠如ではなく実験的設計の問題による可能性がある。しかし、多くの実験では、各エンドポイントに適切な量の組織を必要とする複数のアプリケーションが組み込まれています。鼠径腺は、胸部腺のような周囲の組織を汚染することがほとんどないため（ すなわち、筋肉の汚染）、また鼠径リンパ節が高値を提供するため、全体的なマウントおよび下流の用途に好ましい選択肢であるオリエンテーションと腺全体の比較に適したランドマークです。したがって、各腺にどの腺およびどれくらいの腺を割り当てるかを決定することは、検出の精度に影響する。乳腺の使用の優先順位付けは、1）全体の4 番目と5 番目の腺からなる全体のマウント、2）ランドマークとして使用するためにリンパ節を含む対側4 番目の腺の組織学、3）下流の適用（ すなわち、 RNA、DNA、およびタンパク質）のための反対側の5 番目の腺（リンパ節を汚染しない）。剖検時に異常が認められた場合は、組織全体の収集を優先するべきである。 他のプロトコルと同様に、付随する制限があります。区画中にマウント全体を恒久的に破壊し、代替分析に使用するための組織が限られているなどの必要性がある。したがって、デスクトップ全体でマウント全体を広範囲に記録することをお勧めします将来の分析と参照のためにデジタル画像を生成することができます。また、染色が1ヶ月以内に起こらない場合、将来の分析のために組織を保存するために切断される切片の数を制限する。 H＆Eセクション法に対するこの全体の利点は、複数の分野、特に毒物学を伴う乳房研究に普遍的に適用できるように、限界を上回っている。知られている内分泌効果を持つ化学物質を使用していくつかの研究は、その適用性11、12、13を実証し 、このプロトコルの修正版が含まれています。これらの研究から得られた知見は、化学試験での偽陰性の可能性を減らすのに役立つかもしれないが、規制やリスク評価の決定に使用できる新しい情報や追加情報を提供する可能性もある。

乳房全体のマウントは、正常および化学的に誘発された異常な発達の両方を理解するために、多くのラットおよびマウスの研究で実施される有用で安価な方法である。一般に、げっ歯類発達中の様々な段階（ すなわち、青年期、思春期、中期〜後期妊娠期、および退縮段階）で収集された乳腺は、パラクリン、内分泌およびオートクリン因子によって影響される組織および細胞構造の形態変化を示す1 。老化ラットでは、腺の上皮および間質部分がますます稠密になり、全体的に形態学的パラメーターを測定することが困難になる。したがって、顕微鏡レベルでの変化を同定するために組織学的評価のために腺を採取することが一般的なプラクティスである。両方のプロセスは、化学暴露（ すなわち、環境または薬学的）を伴う研究、または遺伝子改変を伴う形態学的変化を調べる研究において特に有用であるations。 リスク評価において乳腺を使用するための技術および能力は進化し続けている。全マウント準備ルーチンと標準化されながら、切片の変更は2、3を続けます。いくつかの研究室が依然として皮膚4を介してクロスカット部を使用しながら、様々なバックグラウンド（ すなわち、学界、政府、産業界）から多くの研究グループが、好ましい方法として、乳房組織の縦/冠状切片を適応しています。後者の方法は、興味のある組織ではなく、表皮（皮膚）の過度の表現をもたらす：乳腺上皮2 。冠状部または縦断面は、正常組織5の特徴付けに有用であり、存在する表面積および構造の数の増加による異常および病変の検出を大幅に改善する。全体的にみると、乳腺1,2の比較組織病理学的評価のためUNT適した方法。マウスまたはラットを使用するかどうかにかかわらず、 第 4および第 5鼠径部の腺の回収および保存は、対側H＆Eセクション全体との比較に強く推奨されます。 H＆Eセクションとマウント全体を組み合わせて使用​​すると、環境暴露によって引き起こされる細胞と形態変化を正確に説明することができます。これは、モデルが腫瘍形成に対する低い感受性を有するか、または腫瘍が肉眼で見えない特定のげっ歯類株において特に当てはまる。状況によっては、両方の技術（ すなわち、不十分な組織量、リソース、または予期しない実験結果）を使用して、必要な組織を得ることが常に可能であるとは限らない場合もある。本発明者らの場合、乳房全体の異常が観察されたが、組織病反対側のH＆E腺における論理的所見はほとんど正常であった。反対側の腺間の圧倒的な不一致は、我々がマウント全体の異常を特定するための経済的で効率的な手順を開発するように導いた。改良された処理および包埋手順を用いて、パラフィン包埋された全マウントから高品質のH＆E染色切片を調製した。我々は、このプロトコルが化学物質曝露効果の強力な検出ツールとなり、実験室間比較を強化することを想像している。

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>mounting media for coverslipping whole mounts and H&amp;amp;E sections</td></tr><tr><td>Leica automated processor</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Automatic Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>electrostatically charged</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Automatic slide stainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>liquid adhesive; used in water bath at sectioning</td></tr><tr><td>Modified Harris Hematoxylin 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Carbonate</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative and washing slides</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Automation wash buffer, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification

正常な乳腺発達は、環境毒素および医薬品への暴露、ホルモンへの過剰な暴露、および遺伝子改変によって変更される可能性がある。乳腺マウント全体は、暴露後に起こる形態変化の進行を捕捉するための安価な方法である。しかし、後の人生では、異常がより発生しやすい場合、この1つの方法に依存するだけでは、異常の適切な診断を行うのに十分な情報を提供できない場合があります。歴史的に、化学的試験ガイドライン研究では、単一の乳腺が剖検時に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色セクションとして調製される。反対側の乳房全身収集および分析の導入は、偽陰性評価の可能性を減少させる。マウント全体の評価は、スライド上の1つまたは2つの乳腺全体の存在によって制限され、ある場合には、マウント全体で観察される異常は、H＆Eセクションで一様に表現されています。この研究の目的は、カバーされていない乳腺全体マウントをH＆E染色された切片に変換するためのプロトコールを開発し、そうしなければ欠落していたかまたは診断困難な病変を同定できるようにすることであった。ここでは、最初に全体のマウントとして準備された乳腺から、高品質でパラフィン包埋されたH＆Eセクションを生成する方法を詳述します。 H＆E切片化のために意図的に調製された組織と比較して、全体のマウントは、組織の除去および処理のためのさらなる準備を必要とする。しかしながら、この方法は、一般的なラボ試薬および追加の時間をほとんど必要としないので、安価であると考えられている。結果として、この方法は、化学的および環境的曝露がどのようにして正常な哺乳類の発達を変化させるか、ならびに遺伝子改変のために生じる変化の表示に関する貴重な情報を提供することができる。

この方法は、乳房パッドの最初の反対側のH＆Eセクションが組織学的変化を示さなかった場合に欠けていたかもしれない診断を支援するのに有効である。しかし、組織学的評価のための組織の調製の間だけでなく、最初の全マウント調製中に注意を払う場合には、結果は有用である。パラフィン包埋は保護を提供し、将来の断裂のために組織を保存するのに役立つであろう。 乳房組織の理想的な厚さを決定するために、4μmおよび6μm切片を調製した。我々は、ミクロトーム上の±1μmの誤差のマージンよりも大きい深さを試験した。厚さ6μmのセクション（ 図1A ）は、コンパクトなセルで非常に密集していました。全体として、スライドには明確な細胞の詳細が欠けていたため、適切な識別情報ication。最適な厚さは4μmであった（ 図1B ）。これらの組織は、上皮および間質領域および対応する細胞型が容易に区別される最良の結果を提供した。 この方法の容易さおよび有用性を説明するために、大規模で進行中の研究からのスライドを使用した。いくつかのケースでは、14ヶ月齢の未成熟の女性CD-1子孫からの元のH＆E切片は、同じ動物の反対側の乳房全体のマウントと比較して矛盾する知見を有することが判明した。病変は全体的には明らかであったが、それ以上の切片化および染色なしには同定できなかった。 2つの異なる動物からのサンプルを代表的な症例として選択した。両方の場合において、単一の切片を染色のために使用したが、代表的な切片が得られるまで数回切った。以前の全マウント準備がmoをクリアして以来、代表的なセクションを得るために必要なカットはほとんどありませんでしたこれは太い脂肪パッドに囲まれたパラフィン包埋のために元々準備された乳腺と比較して非常に薄い。 図2A及び図3A は、通常のように評価した腺の組織学的切片を示します。両方の腺は、強固で均質な脂肪細胞が豊富な集団によって囲まれた管構造を示す。各ダクトは、単純な立方体の上皮細胞の単一層によって裏打ちされ、主に筋上皮細胞からなる第2層の基底細胞によって維持されるが、幹細胞および前駆細胞集団も包含する。反対側の全体的なマウント（ 図2Bおよび図 3B ）は、不透明度が増加した管および間質を示した。しかし、不透明性が過形成性、炎症性または新生物性の変化の結果であるかどうかを決定することは困難であった異なる細胞の詳細を提供することができるH＆Eセクションを有する。 同じ動物から反対ホールマウントは、ここで説明する方法を実施するために使用され、 図2 のC及びDと図3 C及びDで観察することができます。 図2の C＆Dのサンプルは、乳腺部の大きな血管の周りに存在したリンパ球の数の増加に起因して、血管周囲の炎症として診断された。第2の症例では、乳腺の小葉構造は維持されたが、正常な肺胞および管の数およびサイズの増加（多葉胞状肥厚）により、多腔的に拡大した。肺胞上皮細胞はよく分化し、丸く、しばしば空胞化し、典型的にはタンパク質性流体を含む管腔の周りに1つの同心層を形成した。 Ductsは柱状細胞によって裏打ちされ、1つの同心層を形成する分化した上皮を有する肺胞細胞に類似していた。この表現型は、妊娠中期マウスおよびラットの乳腺において最も頻繁に観察される。これは、成熟した雄ラットの乳腺の舌胞状構造と混同してはならない8 。成体の雄性乳腺において、肺胞は顕著であり、ダクトはまれではないが、肺胞および管は、層状の上皮によって細長く、空胞化された立方体から短い柱状上皮細胞によって裏打ちされる。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55796/55796fig1.jpg" /> 図1 ： H＆Eセクションへのマウス乳腺完全マウントの推奨厚さ 。 A）6μmおよびB）4μm。乳腺構造の解像度は、組織病理学的評価には最適ではなかったが、より厚い（6 - ＆＃181; m）セクションであるため、4μmセクションが推奨されます。この図は、Tucker et al。 9 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55796/55796fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55796/55796fig2.jpg" /> 図2 ：血管周囲の炎症のH＆Eセクション全体へのマウント。この画像は発情期に集められたマウス乳腺です。 A）組織病理学的変化のないホルマリン固定H＆E乳腺部。 B）反対側の全マウントセクション。不透明度の高い領域（囲み領域）。 C）乳房全体のマウント（ボックス領域）からのH＆Eセクションの20倍の倍率。単核細胞のクラスターは、血管を取り囲んで、周囲の脂肪組織にまで広がった。 D）Th乳房全体のマウント（ボックス領域）からのH＆E切片の40倍の倍率は、単核球集団の大部分がリンパ球からなり、脈管周囲炎症の重症度を強調することをより詳細に示す。この図は、Tucker et al。 9 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55796/55796fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55796/55796fig3.jpg" /> 図3 ： 小葉腺肥大症のH＆Eセクション全体へのマウント 。この画像は発情期に集められたマウス乳腺です。 A）組織病理学的変化のないホルマリン固定H＆E乳腺切片。 B）管状および間質領域における不透明度が増加した対側全装着部（四角a）。 C）乳房全体のマウント（ボックス領域）からのH＆Eセクションの20倍の倍率。小葉構造は維持されていたが、正常な肺胞および管の数およびサイズの増加（多葉胞状肥厚）により、多腔的に拡大した。 D）乳房全体のマウント（ボックス領域）からのH＆E切片の40倍の拡大は、拡大した小葉が、分化した、しばしば空胞化した上皮細胞によって裏打ちされた肺胞およびダクトの増加した数を含むことを明らかにする。タンパク質性液体。この図は、Tucker et al。 9 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55796/55796fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。

病変同定のための乳腺全体マウントの分割

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

sectioning-mammary-gland-whole-mounts-for-lesion-identification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. 当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

がん研究

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

発生生物学

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

医学

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

乳腺上皮移植の手順

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

生物学

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

ラットにおける乳腺の形態と乳癌リスクの変化

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...