Name: new methods to study gustatory coding
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
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著者は何も開示することはない。

本明細書に記載の方法は、比較的単純な動物Manduca sextaからのインビボでの記録が、長期間にわたって（2時間以上）、味覚送達の前、最中および後に複数の無作為に選択されたGRNの活性を特徴付けることを可能にする。これらの方法はまた、正確な時間制御を有する複数の味覚刺激の迅速で連続的な送達を可能にし、味覚表現の基礎となる神経機構を研究するのに有用である。このプロトコルは、シナプス後の標的ニューロン（ 例えば、 SEZ）に伝達されたときにGRNを単シナプスで接続された介在ニューロンと同時にモニタリングすることによって、GRNの味物質への応答がどのように変化するかを研究するために用いられているさらに、これらの方法は、実験者のニーズに適合させることができ、複雑なパラダイムの実行が味覚コーディングの基本的な側面を研究することを可能にする。 beginnin私たちの研究では、トラブルシューティングが必要な技術的な問題の1つは、四極線で上顎神経からのスパイク信号を検出できないことでした。この解剖プロトコールは困難であり、良好な準備を得るためにはいくつかのプラクティスが必要であるため、これに対する考えられる原因は多様である。第1に、蛾の解剖の間、上顎神経は、特に神経組織を取り囲むシースの除去中に損傷することが容易である。第2に、シースが完全に除去されない場合、四極線は神経にアクセスできない可能性がある。どちらの場合も、新しい準備を開始することは、これらの問題を解決する最も簡単な方法です。第三に、四極ワイヤに問題があるかもしれない。これは、1kHzで〜270kΩになるはずのワイヤのインピーダンスを測定することによって確認できます。インピーダンス値が〜300kΩを超える場合は、ワイヤを金で電気めっきして、所望のインピーダンスにします（参考文献30を参照）。第4に、機器が誤って接続されている可能性がありますまたは誤動作。 別の考えられる問題は、スパイク信号が記録されるがニューロンは味物質に応答しないように見えることである。これは、記録されたニューロンが、送達された味覚物質のセットに対して感受性がないためであり得る。また、GRNの軸索に加えて、上顎神経もまた、機械感覚線維を運ぶことを覚えておくことが重要である。したがって、GRNの代わりに、またはGRNに加えて、機械感覚ニューロンから記録することが可能である。しかしながら、味のある送達システムは実験を通じて一定の機械的入力を提供するように設計されているため、味物質に対する応答は送達の機械的構成要素に対する応答によって混乱することはない。いくつかの他の味覚物質に反応するニューロン、または異なる味物質に異なる方法で応答するニューロンは、GRNとして明白に分類することができる。化合物の分解または蒸発による味物質濃度または組成の変動を避けるために、新たに希釈した味物質を使用することを推奨しますの溶媒を含む。また、チューブの汚れや詰まりを避けるため、システムを定期的に清掃することをお勧めします。 別の可能な技術的問題は、不利な信号対雑音比である。この問題は、しばしば、浴の接地電極の位置を再塩素化または調整することによって解決することができる。他の解決策では、装置内の各電気的接続の長さを遮蔽し最小限に抑える必要があるかもしれない。 最後に、テトロード記録を使用して得られたデータの正確な分析には注意深いスパイクソートが必要であることに注意することが重要です。我々は、完全自動化された方法は一般的に不十分であることを発見した。四極データ10,29,31,32,33を分析する前に、スパイクソートの文献に精通することをお勧めします。 私たちの解剖プロの代替トコールを使用することができます。ここでは、蛾の頭の腹側部分を切開し、上顎神経およびSEZへのアクセスを提供するが、背側を通ってこれらの構造にアクセスすることも可能である。私たちは背側の準備が深い場所のためにこれらの味覚構造から録音するのに最適ではないことを発見しましたが、この準備はマッシュルーム本体のような高次構造からの録音を可能にする利点を提供します感覚統合、連合学習、記憶処理34 。我々は、上顎神経から記録するために四極電極の使用に焦点を当ててきたが、図示のように、標準的な細胞内の鋭い電極もこの目的のために使用することができる。さらに、両方の技術を組み合わせて、複数の脳領域10からの同時記録を行うことができる。神経科学文献には、昆虫と脊椎動物の両方35,36,37,38,39 に適用される、嗅覚コーディングのような感覚処理の基本原理を明らかにするための強力なツールであることが証明された無脊椎動物モデル。私たちのメソッドが味覚コーディングについての基本的な新しい洞察につながることを願っています。

味覚システムと嗅覚システムは、環境中の化学物質の内部表現を生成し、それぞれ味覚と臭気の認識を生じさせる。これらの化学感覚は、仲間や食事の発見から捕食者や毒素の回避に至るまで、生物の生存に不可欠な多くの行動を引き出すために不可欠です。プロセスは、環境化学物質が感覚受容細胞の原形質膜に位置する受容体と相互作用するときに始まる。これらの細胞は、直接またはニューロンとの相互作用を介して、化学物質の同一性および濃度に関する情報を電気信号に変換する。これらの信号は、高次のニューロンや他の脳構造に伝達されます。これらのステップが進むにつれて、元の信号は、感覚情報を検出し、識別し、分類し、比較し記憶し、適切な行動を選択する生物の能力を促進する変化を常に受け​​る。ブラジャーの仕組みを理解する環境化学物質に関する情報を変換することで、さまざまな作業を最善に実行することが、神経科学の基本的な問題です。 味覚コーディングは、比較的単純であると考えられている。味を引き出すすべての化学分子（「味覚」）は、約5またはそれ以下の基本味質（ すなわち、甘味、苦味、酸味）塩味、うま味） 1 。この「基本的な味」の観点では、味覚システムの仕事は、これらの基本的な嗜好のどれが存在するかを判断することです。さらに、神経系における基本的な味覚表現の根底にある神経機構は不明であり、「標識された線」2,3,4,5,6または「繊維横断パターン」 7によって支配されると考えられている</sup&gt; 、 8コード。標識されたラインコードでは、各感覚細胞およびその神経フォロアーの各々は、単一の味質に反応し、一緒にその味に特化した中枢神経系のより高い処理中心への直接かつ独立した経路を形成する。対照的に、横繊維パターンコードでは、各感覚細胞は複数の味覚特性に応答して、味覚物質に関する情報が感覚ニューロンの集団全体の応答によって表される。味覚情報が基本的な嗜好であるかどうかにかかわらず、ラベルされた線を介して、または他の何らかのメカニズムによって、不明瞭であり、最近の調査の焦点である3,8,9,10,11,12。私たちの最近の研究は、味覚システムが時空間集団コードを使って基本的な味のカテゴリーではなく個々の味の表現10 。 ここでは、味覚コーディングの研究を支援する3つの新しいツールを提供します。まず、味覚の電気生理学的研究に適した比較的単純なモデル生物としてのハクモス・マンジュカ・セクスタの使用を示唆し、解剖処置を記述する。次に、個々のGRNの活動を記録するために細胞外の「四極管」を使用することを提案します。第3に、我々は動物に正確に時間を合わせた鼓動を届けるための新しい装置を提案する。これらのツールは、私たちの研究室や他の研究者が嗅覚システムを研究するために使用した技術から適応されました。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）、イナゴミツバチ （ Mist Manduca sexta）などの昆虫は、何十年もの間、ナルについての基本原則を理解するための強力な資源を提供してきた感覚コーディング（ 例えば、嗅覚13 ）を含む大脳系。哺乳動物において、味覚受容体は、複雑なセカンドメッセンジャー経路を介してニューロンと通信する特殊細胞である。昆虫ではより簡単です。味覚受容体はニューロンです。さらに、周辺の哺乳類の味覚経路は、比較的複雑であり、複数の平行な神経経路を特徴とし、重要な構成要素は、小さな骨構造15に含まれるアクセスするのが難しい。昆虫の味の経路はより単純に見える。昆虫では、GRNは、アンテナ、口、翼および脚16,17に位置する、感覚器として知られる特殊な構造に含まれている。 GRNは、副食道ゾーン（SEZ）に直接投影され、その役割は主に味覚17と考えられており、2次味覚ニューロン10 。そこから情報が身体に届いて反射神経を駆動し、より高い脳領域に統合され、記憶され、最終的に行動選択肢を駆動する16 。 味覚情報がどのように伝播され、神経系全体にわたってポイントからポイントに変換されるのかを理解するために、末梢味覚応答を特徴付けることが必要である。昆虫におけるGRNの神経活動を直接的にモニターする最も一般的に使用される方法は、先端記録技術である12,18,19,20,21,22,23である。これは、感知器の上に電極を直接配置することを含み、その多くはアクセスが比較的容易である。味物質は電極内に含まれており、活性化および延長が可能であるsensillumにおけるGRNsのニューロン応答を測定する。しかし、味物質が電極に含まれているので、味物質が送達される前または除去された後にGRN活性を測定すること、または電極20を交換することなく味物質を交換することは不可能である。別の方法である「サイドウォール」記録技術も、GRNの活動を記録するために使用されている。ここでは、味覚センサ24の基部に記録電極を挿入し、味覚センサの先端にある別のガラスキャピラリを介して味物質を供給している。両方の技術は、GRNから特定の感覚器への記録を制限する。ここでは、新しいテクニックを提案します：異なる感覚器からの無作為に選択されたGRN軸索からの記録、別々に嗅覚器に一連の味覚物質を送達すること。軸索記録は、軸索を運ぶ神経に鋭利なガラス電極または細胞外電極束（四極管）を配置することによって達成されるSEZ 10への鼻腔内のGRN。 Manducaでは、これらの軸索は純粋に求心性であることが知られている上顎神経を横断し、感覚反応の明瞭な記録を可能にする25 。軸索から記録するこの方法は、一連の味わいのあるプレゼンテーションの前、中および後に、2時間以上にわたって、GRN応答の安定した測定を可能にする。 ここでは、SEZと一緒に上顎神経を曝露するための解剖手順を説明します。これにより、SEZ 10内の複数のGRNおよびニューロンの応答を同時に記録することができます。また、スパイクソート法と組み合わせると複数のGRNを同時に解析することができるカスタムメイドの4チャネルツイストワイヤーテトロードを使用したGRNの細胞外記録の使用についても説明します。我々はさらに、テトロドで作製した記録を、鋭い細胞内で作製した記録と比較する電極。最後に、味覚刺激を提供する新しい装置について説明する。多くの研究者が嗅覚研究で匂い物質を送達するために長い間使用されてきた装置から適応されたこの新しい装置は、咀嚼研究の利点を提供します：Stürckowらが開発した従来のマルチチャンネル送達システム（参考文献26,27参照）このタイミングの電圧読み出しを提供しながら、味のある供給のタイミングを制御する。それは複数の味覚刺激10の迅速で連続的な送達を可能にする。装置は、一定の流量の清浄な水の中に鼻腔を浸し、制御された耳の鼓動を送達することができる。それぞれの鼓動は頸部を通過して洗い流されます。味は味のない食べ物の着色を少量含んでおり、正確なタイミングで味わいのあるov鼻腔があります。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and Specimen Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tube, 15 mL Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2&quot;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;MONOJET</td><td>888200144</td><td>For applying air to remove the hair from the moth.</td></tr><tr><td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&amp;nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish -100 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tip (1 - 200 &amp;micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG standard hookup wire</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td></tr><tr><td>Batik wax</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Electric waxer</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Myscroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 forceps (coarse)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>For desheathing the nervous tissue.</td></tr><tr><td>Vannas scissors (fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>For removing the cuticle.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline Perfusion System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extension set with rate flow regulator</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV administration set with Y injection site</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastant Delivery System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&quot;, ID 1/8&quot;</td><td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td></tr><tr><td>Soldering iron</td><td>Circuit Specialists</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Rotary tool-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&amp;nbsp;</td><td>Industrial Netting</td><td>XN5170</td><td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td></tr><tr><td>Pressurized 16-Channel perfusion system&amp;nbsp;</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-16H</td><td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.</td></tr><tr><td>Polypropylene tubing, ID 0.034&quot;, ID 0.050&quot;</td><td>Becton, Dickinson &amp;amp; Co</td><td>427421</td><td>Output tube from the perfusion system.</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>For controlling the output channel of the perfusion system.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>For pumping water.</td></tr><tr><td>Silicone tubing, ID 1/16&quot; OD 1/8&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td></tr><tr><td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td><td>Keyence</td><td>&amp;nbsp;FS-V31M</td><td>For monitoring tastant delivery.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Color sensor-reflective fiber unit</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>To connect the color sensor device.</td></tr><tr><td>Dental periphery Wax</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td></tr><tr><td>Two 3.7 L containers</td><td></td><td></td><td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td></tr><tr><td>Fast green FCF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 25.5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electrophysiology Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. amplifier</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Leica</td><td>micromanipulator</td><td>To precisely insert the tetrodes into the animal&#039;s brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&amp;nbsp;</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td><td>16 Channel MA-800 Amplifier System&amp;nbsp;</td><td>B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core&amp;nbsp;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastants&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

new methods to study gustatory coding

味覚は動物が環境中の化学物質を検出することを可能にし、生存に不可欠な行動を引き起こします。味覚受容器ニューロン（GRN）が味覚分子を検出すると、脳内のフォロワーニューロンに伝播する電気活動のパターンとして、味覚物質の同一性および濃度に関する情報をコード化する。これらのパターンは味物質の内部表現を構成し、動物が行動を選択して記憶を形成することを可能にする。比較的単純な動物モデルの使用は、感覚コーディングにおける基本原則を研究するための強力なツールであった。ここでは、moth Manduca sextaを用いて練習コーディングを研究する3つの新しい方法を提案する。まず、軸索からのGRNの活性を記録することを可能にする、上顎神経および食道下領域（SEZ）を暴露するための解剖処置を提示する。第2に、細胞外電極を使用して、複数のGRNの活性を記録することを記載する上顎神経に直接ワイヤを通す。第3に、我々は、高い時間精度で異なる味物質のパルスを送達および監視するための新しいシステムを提示する。これらの方法は、味物質が送達される前、中および後で、GRNからのインビボでのニューロン応答の特性決定を直接的に可能にする。複数のGRNから記録された電圧トレースの例を示し、個々のニューロンの応答を特定するためにスパイクソート手法をデータにどのように適用できるかの例を示します。最後に、本発明者らの記録方法を検証するために、GRNから得られた細胞外記録をテトロドと比較し、シャープなガラス電極で得られた細胞内記録と比較する。

GRNの活性は、味覚送達の前、間および後に細胞外四極電極を用いて記録することができる（ 図6Aおよび6C ）。 図6A （中および下のパネル）は、上顎神経に配置された4本のワイヤーのそれぞれによって記録されたフィルターされた（300-6,000Hz）電圧トレースを示し、活動電位（矢印）を反映する異なる振幅の信号が観測される。試験開始後2秒後に味物質（1 Mショ糖）の1秒パルスを送達した。刺激の開始およびオフセットを、カラーセンサ（ 図6A 、上部パネル）によってモニターした。 4つのチャネルのそれぞれにおいて観察され得る味覚誘発スパイク（ 図6A 、中央パネル）。 GRNは、いくつかの味物質に応答する場合、メカノセンサー（ここに示されていない）と識別され、区別され得る tetrode記録から単一のニューロン応答を同定し単離するために、我々は、Pouzat 31およびKleinfeldの32,33方法（これらの方法はこれらの引用文献に記載されている：10,29）に基づく一連のカスタム関数を用いてオフラインスパイクソーティングを行った。 図6Bは、 図6Aに示すデータに適用されたスパイクソーティングの例を示し、3つの孤立したユニットが見出された。 図6Cのラスタプロットは、 図6Bの 3つの単離されたユニットの応答を、6つの異なる味物質（1Mショ糖、マルトースおよびNaCl; 100mMカフェインおよび10mMベルベリンおよびロブライン）s / tastantが示されている）。 図6Cに示すように、記録されたGRNは、サイレント（GRN 1）から低または中程度（GRN 2および3）の範囲で異なるベースライン活動レベルを有する。劇的な発症後、GRNは多様な活性パターンを示し、味物質に対して異なる選択性を示す。例えば、GRN1はスクロースにのみ応答し、一方、GRN2はマルトースおよびNaClにスパイクのバーストを伴って応答し、刺激の開始時にのみスパイクを伴うロブラインに応答した。さらに、いくつかの応答は、刺激の持続時間（ 例えば 、ショ糖に対するGRN1応答）に固定され、他の応答は刺激の持続時間より長く（ 例えば 、ベルベリンに対するGRN3応答）、または興奮性および阻害性成分GRN 2はNaClおよびスクロースに応答する）。 GRNの多様な感受性および活性パターンの詳細については、参考文献10を参照のこと。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt;上顎神経からGRNを記録するための四極およびスパイクソート技術の使用を検証するために、他の動物のGRN軸索からの細胞内記録を、従来の鋭利なガラス電極（80-120MΩの抵抗）を用いて行った。我々は、細胞内記録を使用することによって得られた活性パターンが、テトロデ技術を用いて観察された応答と類似していることを見出した（ 図7 ）。パネルAの緑色ボックス内の電圧トレースは、ショ糖提示の5回の連続した試験中にGRN1から細胞内に記録され、同じ反応はパネルBのラスタプロットとして示されている（このタイプの応答は四極および図6Cに示される）。鋭い細胞内電極で記録されたGRN2は、より広い応答パターンを示す。 <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; 図6： 細胞外Tetrodesを伴う上顎神経記録からの代表的な結果。 （ A ）上顎神経の4本のワイヤの各々によって記録されたフィルタリングされた（300-6,000Hz）電圧トレースが示されている（中央パネル）。中央のパネルに赤色の陰影が付いている期間中、味覚物質の1秒パルスを印加した。刺激の開始およびオフセットは、上部パネル上の赤色電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによってモニタされ、赤色陰影領域によって中間パネルに示されている。点線の水平線は、+ 50（上）、0（中）および-50（下）μVを示す。縦の点線内の領域に対応する生の電圧トレースの拡大が示されている（下のパネル）。スパイクの例は矢印で示されています。 （ B ）パネルAに示されたデータに適用されたスパイクソーティングの一例.4つの細胞外ワイヤー（1-4）の各々に記録された波形eは、記録された信号に寄与する3つの異なるGRN（ユニット1〜3）で識別される。 3つのユニットの個々のイベント（細い線）と平均（太い黒い線）が示されています。スパイクソート法（参考文献10,29参照）を用いて、独立したユニットを確実に識別するためには、いくつかの統計的基準を考慮する必要があります。 （ C ）3つの孤立したユニットの反応を6つの異なる味物質（4つの試験/味覚物質が示されている）に示すラスタプロット。味覚送達の期間（1秒）は、赤色の陰影を付けた領域によって示される。味物質の濃度は、1M（スクロース、マルトース、NaCl）、100mM（カフェイン）および10mM（ベルベリンおよびロブライン）のいずれかであった。 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" c<html> lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; 図7 ：GRN軸索からの細胞内記録。 （ A 、緑色ボックスパネル）1Mのスクロース（Suc）で5回連続して刺激することにより誘発された、鋭いガラス細胞内電極（抵抗80〜120MΩ）を有するGRNから記録された電圧トレース。 （ B ）シャープなガラス細胞内電極を用いて記録した2つの異なる味物質（100mMの灰色のフォント色; 1Mの黒色）にパネルA（緑色のボックスパネル）で示された応答を含む2つのGRNの応答のラスタプロット上顎神経に配置された（7回の試行/味覚および3回の試行/水が示されている）。味わい深い納品時間は、両方のパネルの赤い陰影のある領域によって示される。刺激の開始およびオフセットは、各パネルの下部に赤色の電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによって監視された。es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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味覚コーディングを研究する新しい方法 |神経科学 |ビデオ

New Methods to Study Gustatory Coding

本発明者らは、味覚コーディングを研究する3つの新しい方法を提示する。単純な動物、 Manduca sexta（ Manduca ）を用いて、解剖プロトコール、複数の味覚受容体ニューロンの活動を記録するための細胞外テロドールの使用、および味物質の正確なタイミングパルスの送達および監視のためのシステムを記載する。

味覚コーディングを研究する新しい方法

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

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Psychophysical Tracking Method to Measure Taste Preferences in Children and Adults

The Monell two-series, forced-choice, paired-comparison tracking method provides a reliable measure of sweet taste preferences from childhood to adulthood. The method, which is identical for children, adolescents, and adults, is of short duration (&#60; 15 min), does not rely on sustained attention or place demands on memory (which would yield spurious age differences), and minimizes the impact of language development, making this method amenable to the cognitive limitations of pediatric populations. In this whole-mouth tasting method, subjects are asked to taste (without swallowing) pairs of solutions of different sucrose concentrations and to point to the solution they prefer. Each subsequent pair contains the participant&#39;s preceding preferred concentration and an adjacent stimulus concentration. The procedure continues until the subject chooses either a given concentration of sucrose when paired with both a higher and a lower concentration, or the highest or lowest concentration two consecutive times. Subjects are prevented from reaching response criteria on the basis of first or second position bias by the two-series design of the method, which counterbalances the order of solution presentation within each pair between the series (the weaker concentration is presented first in Series 1, second in Series 2). The geometric mean of the two sucrose concentrations chosen in Series 1 and 2 is an estimate of the participant&#39;s most preferred level of sucrose. Sucrose preference as determined with this laboratory-based measure has been shown to be associated with preference for sugars in foods and beverages and with taste receptor genotype, family history of alcoholism, and race/ethnicity, as well as depressive symptomatology among pediatric populations. The method has real-world relevance and has been applied to determine most preferred level of other tastes (e.g., salt), making it a valuable psychophysical tool.

Sweet taste has powerful hedonic appeal among people of all ages, particularly children. Described herein is a reliable and valid method that can be used to determine the level of sweetness most preferred, making it a valuable psychophysical tool for scientists.

子どもと大人で味の環境を測定するために心理物理追跡方法

The Monell two-series, forced-choice, paired-comparison tracking method provides a reliable measure of sweet taste preferences from childhood to ...

行動学

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

から電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Labellar味感覚器

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

神経科学

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

味試験: 検証して簡単なテスト

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

医学

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

昆虫の味覚ニューロン活動の強化された分析のための新しい方法

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

著者スポットライト:化学受容の進歩 – 昆虫の匂い受容体からノンコーディングRNAまで

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

味覚コーディングを研究する新しい方法

要約

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子どもと大人で味の環境を測定するために心理物理追跡方法

から電気生理学的記録

味試験: 検証して簡単なテスト

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング