Name: new methods to study gustatory coding
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione intramurale da parte di NIH-NICHD a MS Ringraziamo G. Dold e T. Talbot della NIH-NIMH Instrumentation Core Facility per assistenza nella progettazione del sistema di consegna tastante.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui descritti consentono di registrare in vivo da un animale relativamente semplice, Manduca sexta , a caratterizzare l&#39;attività di GRN multipli selezionati in modo casuale per lunghe durate (per più di 2 ore), prima, durante e dopo la consegna del sapore. Questi metodi consentono anche la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli con preciso controllo temporale, vantaggi utili per studiare meccanismi neurali alla base della rappresentazione tastante. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare come le risposte dei GRN ai tastanti vengono trasformate quando vengono trasmesse ai loro neuroni targetistici postinaptici ( ad es. Nella SEZ) monitorando GRN simultaneamente con gli interneuroni 10 monocinapticamente collegati. Inoltre, questi metodi possono essere adattati alle esigenze del sperimentatore, permettendo l&#39;esecuzione di paradigmi complessi per studiare aspetti fondamentali della codifica gustativa. Quando cominciaNei nostri studi, un problema tecnico a volte dovuto risolvere è stato l&#39;incapacità di rilevare segnali di picco dal nervo maxillare con i fili tetrode. Le cause possibili per questo sono diverse, poiché il protocollo di dissezione è impegnativo e occorre una certa pratica per ottenere una buona preparazione. Innanzitutto, durante la dissezione delle falene i nervi maxillari sono facili da danneggiare, soprattutto durante la rimozione della guaina che circonda il tessuto nervoso. In secondo luogo, se la guaina non viene rimossa completamente, i fili tetrode potrebbero non essere in grado di accedere al nervo. In entrambi i casi, avviare una nuova preparazione è spesso il modo più semplice per risolvere questi problemi. In terzo luogo, potrebbe esserci un problema con i cavi tetrode. Questo può essere verificato misurando l&#39;impedenza dei cavi che dovrebbe essere di ~ 270 kΩ a 1 kHz. Se il valore dell&#39;impedenza è superiore a ~ 300 kΩ, impilare i cavi con oro per ottenere l&#39;impedenza desiderata (vedi riferimento 30 ). Quarto, un pezzo di apparecchiatura potrebbe essere disconnessoO malfunzionamenti. Un altro possibile problema è che vengono registrati segnali spiking ma i neuroni sembrano non rispondere ai tastanti. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i neuroni registrati sono insensibili all&#39;insieme dei tastanti consegnati. Inoltre, è importante tenere a mente che, oltre agli assoni di GRN, il nervo maxillare porta anche fibre meccanosensorie. Così, è possibile registrare da neuroni meccanosensori anziché, o in aggiunta a, GRNs. Tuttavia, il sistema di consegna tastante è stato progettato per fornire un costante input meccanico durante l&#39;esperimento rendendo improbabile che le risposte a un tastante saranno confuse dalle risposte alla componente meccanica della sua consegna. I neuroni che rispondono ad alcuni ma non altri tastanti, o in modi diversi ai tastanti diversi, possono essere classificati in modo non definito come GRNs. Si consiglia di utilizzare tostanti appena diluiti per evitare variazioni di concentrazione o composizione tastante a causa del degrado o dell&#39;evaporazione compostaDel solvente. Raccomandiamo inoltre di pulire regolarmente il sistema per evitare contaminazioni e / o ostacoli. Un altro possibile problema tecnico è un rapporto segnale-rumore svantaggioso. Questo problema può essere spesso risolto con re-clorizzazione o regolazione della posizione dell&#39;elettrodo di terra del bagno. Altre soluzioni potrebbero richiedere schermature e ridurre al minimo la lunghezza di ogni connessione elettrica nell&#39;apparecchio. Infine, è importante notare che un&#39;analisi corretta dei dati ottenuti utilizzando le registrazioni di tetrode richiede un&#39;attenta selezione dei picchi. Abbiamo scoperto che i metodi completamente automatizzati sono generalmente inadeguati. Prima di analizzare i dati di tetrode 10 , 29 , 31 , 32 , 33 , si consiglia di familiarizzare con la letteratura di classificazione delle chiavi. Alternative alla nostra dissezione proPuò essere utilizzato il tocol. Qui abbiamo descritto una dissezione attraverso la parte ventrale della testa della falena, che fornisce l&#39;accesso ai nervi maxillari e SEZ, ma è anche possibile accedere a queste strutture attraverso la dissezione attraverso il lato dorsale. Abbiamo trovato che la preparazione laterale dorsale non è ottimale per fare registrazioni da queste strutture gustative grazie alla loro posizione profonda, ma questa preparazione offre il vantaggio di consentire registrazioni da strutture di ordine superiore come il corpo di funghi, un&#39;area associata a multi Integrazione -sensoriale, apprendimento associativo e elaborazione della memoria 34 . Ci siamo concentrati sull&#39;utilizzo di elettrodi tetrodi per registrare dal nervo maxillare, ma, come abbiamo illustrato, possono anche essere utilizzati standard elettrodi intracellulari affilati. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere combinate per eseguire registrazioni simultanee da più aree cerebrali 10 . La letteratura neuroscienze offre molti esempi di iModelli nertebrati che si sono dimostrati potenti strumenti per rivelare principi fondamentali di elaborazione sensoriale, come la codifica olfattiva, che si applicano sia agli insetti che ai vertebrati 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Speriamo che i nostri metodi porti a nuove conoscenze fondamentali sulla codifica gustativa.

I sistemi gustativi e olfattivi generano le rappresentazioni interne delle sostanze chimiche nell&#39;ambiente, dando luogo a percezioni di gusti e odori, rispettivamente. Questi sensi chimici sono essenziali per elicitare numerosi comportamenti critici per la sopravvivenza dell&#39;organismo, che vanno dalla ricerca di compagni e pasti per evitare predatori e tossine. Il processo inizia quando le sostanze chimiche ambientali interagiscono con i recettori situati nelle membrane plasmatiche delle cellule del recettore sensoriale; Queste cellule, direttamente o attraverso interazioni con i neuroni, trasudano informazioni in merito all&#39;identità e alla concentrazione di sostanze chimiche in segnali elettrici. Questi segnali vengono poi trasmessi ai neuroni di ordine superiore e ad altre strutture cerebrali. Mentre questi passaggi avanzano, il segnale originale subisce sempre cambiamenti che promuovono la capacità dell&#39;organismo di rilevare, discriminare, classificare, confrontare e memorizzare le informazioni sensoriali e di selezionare un&#39;azione appropriata. Capire come il reggisenoIn trasforma le informazioni sulle sostanze chimiche ambientali per eseguire al meglio svariati compiti è una questione fondamentale nella neuroscienza. La codifica gustativa è stata considerata relativamente semplice: una visione ampiamente contenuta afferma che ogni molecola chimica che genera un gusto (un &quot;tastante&quot;) naturalmente appartiene ad una delle qualità del gusto di circa cinque o di base ( cioè dolce, amaro, acido , Salato e umami) 1 . In questa visione &quot;gusto di base&quot;, il lavoro del sistema gustativo è quello di determinare quale di questi gusti di base è presente. Inoltre, i meccanismi neurali sottostanti alla rappresentazione gusto di base nel sistema nervoso non sono chiari e sono ritenuti governati da una &quot;linea etichettata&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o da un &quot;modello di fibra&quot; 7 </suP&gt; , codice 8 . In un codice di codice etichettato, ogni cellula sensoriale e ciascuno dei suoi seguaci neurali rispondono a una singola qualità di gusto, insieme formando un canale diretto e indipendente verso centri di lavorazione più alti nel sistema nervoso centrale dedicato a quel gusto. Al contrario, in un codice di pattern di fibre diverse, ogni cellula sensoriale può rispondere a molteplici qualità del gusto in modo che le informazioni sul tastante siano rappresentate dalla risposta complessiva della popolazione dei neuroni sensoriali. Sia che le informazioni gustative siano rappresentate dai gusti di base, attraverso linee etichettate, o attraverso un altro meccanismo, sia poco chiara ed è al centro della recente indagine 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Il nostro lavoro recente suggerisce che il sistema gustativo utilizza un codice di popolazione spatiotemporale da generareRappresentazioni di singoli sapori piuttosto che categorie di gusto di base 10 . Qui offriamo 3 nuovi strumenti per assistere nello studio della codifica gustativa. Innanzitutto, suggeriamo l&#39;uso della hawkmoth Manduca sexta come un organismo modello relativamente semplice adatto allo studio elettrofisiologico del gusto e descrivere una procedura di dissezione. In secondo luogo, suggeriamo l&#39;utilizzo di &quot;tetrodes&quot; extracellulari per registrare l&#39;attività dei singoli GRN. E, in terzo luogo, suggeriamo un nuovo apparecchio per la consegna e il monitoraggio di impulsi prefissati di tastante all&#39;animale. Questi strumenti sono stati adattati da tecniche che il nostro laboratorio e altri hanno usato per studiare il sistema olfattivo. Gli insetti come la frutta Drosophila melanogaster , la locusta Schistocerca americana e la falena Manduca sexta hanno da decenni forti risorse per comprendere i principi fondamentali sul nerVous, compresa la codifica sensoriale ( es., Olfazione 13 ). Nei mammiferi, i recettori del gusto sono cellule specializzate che comunicano con i neuroni attraverso complessi percorsi secondari messaggeri 1 , 14 . È più semplice negli insetti: i loro recettori del gusto sono neuroni. Inoltre, i percorsi di gusto dei mammiferi nei pressi della periferia sono relativamente complessi, caratterizzati da percorsi neurali multipli e paralleli e componenti importanti sono difficili da accedere, contenuti in piccole strutture ossee 15 . I percorsi di gusto dell&#39;insetto sembrano essere più semplici. Negli insetti, le GRN sono contenute in strutture specializzate noti come sensilla, situate nell&#39;antenna, bocche, ali e gambe 16 , 17 . I GRN proiettano direttamente la zona sottosofagea (SEZ), una struttura il cui ruolo è stato ritenuto prevalentemente gustativo 17 e che contiene secondo ordineNeuroni gustatori 10 . Da lì le informazioni si spingono verso il corpo per guidare riflessi e verso aree cerebrali più alte da integrare, conservare e, in ultima analisi, guidare scelte comportamentali 16 . È necessario caratterizzare le risposte del gusto periferico per capire come le informazioni di gusto vengono propagate e trasformate da punto a punto in tutto il sistema nervoso. Il metodo più comunemente usato per monitorare direttamente l&#39;attività neurale delle GRN negli insetti è la tecnica di registrazione delle punte 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Ciò comporta l&#39;immissione di un elettrodo direttamente su un sensillum, molti dei quali sono relativamente facili da accedere. Il tastante è incluso nell&#39;elettrodo, permettendo di attivare ed estrarreMisura racellulare le risposte neuronali delle GRN nel sensillum. Ma poiché il tastante è contenuto nell&#39;elettrodo, non è possibile misurare l&#39;attività GRN prima che il tastante venga consegnato o dopo essere stato rimosso o sostituito da tastanti senza sostituire l&#39;elettrodo 20 . Un altro metodo, la tecnica di registrazione &quot;parete&quot;, è stata utilizzata anche per registrare l&#39;attività di GRN. Qui, un elettrodo di registrazione viene inserito nella base di un sensitio di gusto 24 , e i tastanti vengono consegnati attraverso un capillare di vetro separato sulla punta del sensilum. Entrambe le tecniche limitano la registrazione da GRN ad un particolare sensillum. Qui suggeriamo una nuova tecnica: registrazione da assoni GRN randomly selezionati da sensilla diversa, mentre separatamente distribuire sequenze di tastanti alla proboscide. Le registrazioni Axon vengono ottenute mettendo elettrodi di vetro o fasci di elettrodi extracellulari (tetrodes) nel nervo che trasporta gli assoni daGRNs nella proboscide della SEZ 10 . In Manduca , questi assi attraversano il nervo maxillare, che è noto per essere puramente afferente, permettendo la registrazione inequivocabile delle risposte sensoriali 25 . Questo metodo di registrazione da assoni consente, per più di due ore, una misura stabile delle risposte GRN prima, durante e dopo una serie di presentazioni tastative. Qui descriviamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari insieme alla SEZ, che può consentire di registrare simultaneamente le risposte di più GRN e neuroni nella SEZ 10 . Descriviamo anche l&#39;uso di registrazioni extracellulari di GRN usando un tetrode a filo metallico a 4 canali personalizzato che, combinato con un metodo di ordinamento a picchi, consente l&#39;analisi simultanea di più (fino a sei) GRNs. Inoltre confrontiamo le registrazioni fatte con tetrodes a registrazioni effettuate con intracellulare forteelettrodi. Infine, descriviamo una nuova apparecchiatura per fornire stimoli tastanti. Adattato da apparecchiature utilizzate da molti ricercatori per distribuire odoranti negli studi di olfatto, la nostra nuova apparecchiatura offre vantaggi per studiare la tastatura: migliorare il sistema di consegna multicanale precedente, come quelli sviluppati da Stürckow e colleghi (vedi i riferimenti 26 , 27 ). Controllare la tempistica della consegna tastant mentre fornisce una lettura di tensione di questo tempo; E consente la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli 10 . L&#39;apparecchio bagna la proboscide in un flusso costante di acqua pulita in cui possono essere consegnati impulsi controllati di tastante. Ogni impulso tastante passa sopra la proboscide e viene poi lavato via. I sapori contengono una piccola quantità di coloranti alimentari insapori, permettendo al sensore di colore di monitorare, con tempi precisi, il passaggio di tastant ovLa proboscide.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and Specimen Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tube, 15 mL Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2&quot;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;MONOJET</td><td>888200144</td><td>For applying air to remove the hair from the moth.</td></tr><tr><td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&amp;nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish -100 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tip (1 - 200 &amp;micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG standard hookup wire</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td></tr><tr><td>Batik wax</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Electric waxer</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Myscroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 forceps (coarse)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>For desheathing the nervous tissue.</td></tr><tr><td>Vannas scissors (fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>For removing the cuticle.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline Perfusion System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extension set with rate flow regulator</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV administration set with Y injection site</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastant Delivery System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&quot;, ID 1/8&quot;</td><td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td></tr><tr><td>Soldering iron</td><td>Circuit Specialists</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Rotary tool-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&amp;nbsp;</td><td>Industrial Netting</td><td>XN5170</td><td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td></tr><tr><td>Pressurized 16-Channel perfusion system&amp;nbsp;</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-16H</td><td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.</td></tr><tr><td>Polypropylene tubing, ID 0.034&quot;, ID 0.050&quot;</td><td>Becton, Dickinson &amp;amp; Co</td><td>427421</td><td>Output tube from the perfusion system.</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>For controlling the output channel of the perfusion system.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>For pumping water.</td></tr><tr><td>Silicone tubing, ID 1/16&quot; OD 1/8&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td></tr><tr><td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td><td>Keyence</td><td>&amp;nbsp;FS-V31M</td><td>For monitoring tastant delivery.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Color sensor-reflective fiber unit</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>To connect the color sensor device.</td></tr><tr><td>Dental periphery Wax</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td></tr><tr><td>Two 3.7 L containers</td><td></td><td></td><td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td></tr><tr><td>Fast green FCF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 25.5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electrophysiology Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. amplifier</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Leica</td><td>micromanipulator</td><td>To precisely insert the tetrodes into the animal&#039;s brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&amp;nbsp;</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td><td>16 Channel MA-800 Amplifier System&amp;nbsp;</td><td>B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core&amp;nbsp;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastants&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

new methods to study gustatory coding

Il senso del gusto consente agli animali di rilevare sostanze chimiche nell&#39;ambiente, dando vita a comportamenti critici per la sopravvivenza. Quando i Neuroni Gustatory Receptor (GRNs) rilevano molecole tastanti, codificano le informazioni sull&#39;identità e la concentrazione del tastante come modelli di attività elettrica che poi si propagano ai neuroni seguenti nel cervello. Questi schemi rappresentano rappresentazioni interne del tastante, che poi consentono all&#39;animale di selezionare azioni e di formare memorie. L&#39;uso di modelli animali relativamente semplici è stato un potente strumento per studiare i principi fondamentali nella codifica sensoriale. Qui proponiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa usando la falena Manduca sexta . In primo luogo, presentiamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari e la zona sottosofagea (SEZ), permettendo di registrare l&#39;attività dei GRN dai loro assoni. In secondo luogo, descriviamo l&#39;utilizzo di elettrodi extracellulari per registrare l&#39;attività di GRN multipli collocando teI fili di trode direttamente nel nervo maxillario. In terzo luogo, presentiamo un nuovo sistema di consegna e monitoraggio, con elevata precisione temporale, impulsi di tastanti diversi. Questi metodi consentono di caratterizzare le risposte neuronali in vivo direttamente da GRN prima, durante e dopo la consegna dei tastanti. Forniamo esempi di tracce di tensione registrate da più GRNs e presentano un esempio di come una tecnica di ordinamento di picchi può essere applicata ai dati per identificare le risposte dei singoli neuroni. Infine, per convalidare il nostro metodo di registrazione, confrontiamo le registrazioni extracellulari ottenute da GRN con tetrodes alle registrazioni intracellulari ottenute con elettrodi di vetro nitidi.

L&#39;attività di GRNs può essere registrata utilizzando un elettrodo tetrode extracellulare prima, durante e dopo la consegna del tastante ( Figura 6A e 6C ). La Figura 6A (pannelli centrale e inferiore) mostra tracce di tensione filtrate (300-6000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili disposti nel nervo mascellare, dove si possono osservare segnali di diverse ampiezze che riflettono i potenziali d&#39;azione (frecce). Un impulso di tastan (1 M di saccarosio) di 1 s è stato consegnato 2 volte dopo l&#39;inizio dell&#39;esperimento; L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo sono stati monitorati dal sensore di colore ( Figura 6A , pannello superiore). I tastanti hanno causato picchi che possono essere osservati in ciascuno dei quattro canali ( figura 6A , pannello centrale). I GRNs possono essere identificati e distinti dai meccanosensori (nessuno mostrato qui) quando rispondono ad alcuni tastanti e non altri Per identificare e isolare le risposte di singolo neurone dalle registrazioni di tetrode, abbiamo eseguito l&#39;ordinamento di spike off-line utilizzando un insieme di funzioni personalizzate basate sui metodi di Pouzat 31 e Kleinfeld 32 , 33 (questi metodi sono descritti in queste citazioni: 10 , 29 ). La Figura 6B mostra un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nella Figura 6A , in cui sono state trovate tre unità ben isolate. I diagrammi raster della Figura 6C descrivono le risposte delle tre unità isolate nella Figura 6B a sei diverse tipologie (1 M saccarosio, maltosio e NaCl, 100 mM caffeina e 10 mM berberina e lobeline) consegnati in sequenza (4 sperimentazioniS / tastant sono mostrati). Come mostrato nella Figura 6C , i GRN registrati hanno livelli diversi di attività di base, che vanno da silenziosi (GRNs 1) a bassi o moderati (GRN 2 e 3). Dopo l&#39;inizio tastante, i GRN mostrano diversi pattern di attività e mostrano una selettività diversa rispetto ai tastanti. Ad esempio, GRN 1 ha risposto solo al saccarosio, mentre GRN 2 ha risposto al maltosio e alla NaCl con burst di picchi e alla lobeline con spiking solo all&#39;insorgenza dello stimolo. Inoltre, alcune risposte sono bloccate alla temporizzazione dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 1 al saccarosio), mentre altre risposte superano la durata dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 3 a berberina) o contengono componenti sia eccitatoriali che inibitori ( ad esempio, Figura 7 Risposte GRN 2 a NaCl e saccarosio). Per ulteriori informazioni sulle diverse sensibilità e modelli di attività dei GRN, vedere il riferimento 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Per convalidare l&#39;uso delle tecniche di ordinamento di tetrodi e picchi per registrare GRN dal nervo maxillario, abbiamo eseguito registrazioni intracellulari da assoni GRN in altri animali utilizzando elettrodi di vetro nitidi convenzionali (resistenza 80-120 MΩ). Abbiamo riscontrato che i pattern di attività ottenuti utilizzando le registrazioni intracellulari erano simili a quelle riscontrate utilizzando la tecnica tetrode ( Figura 7 ). Le tracce di tensione nella scatola verde del pannello A sono state registrate intracellulariamente da GRN 1 durante 5 prove consecutive della presentazione di saccarosio e le stesse risposte sono mostrate come diagrammi raster nel pannello B. (Si noti che questo tipo di risposta corrisponde a quello ottenuto con tetrodes e Mostrato in Figura 6C .) GRN 2, registrata con elettrodi intracellulari affilati, mostra un modello di risposta più ampio. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figura 6: Risultati rappresentativi delle registrazioni dei nervi maxillari con tetrosi extracellulari. ( A ) Sono mostrate tracce di tensione filtrate (300-6,000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili al nervo mascellare (pannello centrale). Un impulso di tastante da 1 s è stato applicato durante il periodo indicato dall&#39;ombreggiatura rossa nel pannello centrale. L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore come indicato dalla traccia di tensione rossa sul pannello superiore e viene indicato sul pannello centrale dall&#39;area a colori rossi. Le linee orizzontali punteggiate indicano +50 (alto), 0 (medio) e -50 (basso) μV. Viene mostrato un ingrandimento delle tracce di tensione raw corrispondenti all&#39;area all&#39;interno delle linee verticali tratteggiate (pannello inferiore). Esempi di punti sono indicati dalle frecce. ( B ) Un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nel pannello A. Le forme d&#39;onda registrate in ognuno dei quattro fili extracellulari (1-4) arE identificati con tre GRN differenti (unità 1-3) che contribuiscono ai segnali registrati. Sono indicate le manifestazioni individuali (linee sottili colorate) e la media (spessore della linea nera) per le tre unità. È necessario considerare un certo numero di criteri statistici per identificare in modo affidabile le unità indipendenti usando il metodo di classificazione delle chiavi (cfr. I riferimenti 10 , 29 ). ( C ) Le trame raster rappresentanti le risposte delle tre unità isolate ad una sequenza di sei diversi tastanti (4 prove / tastant sono mostrate). Il periodo di consegna tastant (1 s) è indicato dall&#39;area a colori rossi. Le concentrazioni di tastanti erano o 1 M (saccarosio, maltosio, NaCl), 100 mM (caffeina) e 10 mM (berberina e lobeline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7 : Registrazioni Intracellulari da GRN Axons. ( A , pannello a scatola verde) Tracce di tensione registrate da un GRN con elettrodi intracellulari di vetro nitidi (resistenza di 80-120 MΩ) immessi nel nervo maxillario, causati da 5 stimoli consecutivi con 1 M sucrose (Suc). ( B ) Raster trame delle risposte di due GRN, comprese le risposte riportate nel pannello A (pannello verde), a due diversi tastanti consegnati in sequenza (100 mM colore grigio caratteri, 1M colore nero caratteri) registrati con elettrodi intracellulari di vetro nitidi Posizionati nel nervo maxillare (7 prove / tastant e 3 prove / acqua sono mostrate). Il tempo di consegna è indicato da aree a tonalità rosse in entrambi i pannelli. L&#39;inizio e l&#39;offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore, come indicato dalle tracce di tensione rossa nella parte inferiore di ciascun pannello.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa | Neuroscienze | Video

New Methods to Study Gustatory Coding

Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l&#39;uso di tetrodes extracellulari per registrare l&#39;attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti.

Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

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9.3K Views.  National Institutes of Health (NIH).  Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l'uso di tetrodes extracellulari per registrare l'attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti. 

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Tecnica per raccogliere fungiformi (Gusto) Papille da lingua umana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

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Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Neuroscienze

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

Esame gustativo: Un Test breve e convalidato

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Colorazione, visualizzazione e analisi di papille gustative fungiformi, circumvallate e palato

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue: una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica per la lingua in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Un nuovo metodo per una migliore analisi dell'attività dei neuroni del gusto degli insetti

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autore in primo piano: Progressi nella chemiorecezione: dai recettori degli odori degli insetti agli RNA non codificanti

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

Riepilogo

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Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

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