この作品は、スイス国立科学財団（助成金番号310030-166313）、「ファンデーションスイスの病気を治癒させる」、「Foundation Marcel Levaillant」、「Fondation pour la rechercheostéo-articulaire」のサポートを受けました。

健康な患者の整形外科手術中に、手術用の廃棄物としてヒトの筋肉サンプル（半腱腱筋から採取した組織）を採取した。ヒト研究に関連するすべての方法は、スイスの規制当局のガイドラインと規制に従って実施され、スイスのジュネーブ条約当局（CER番号12-259プロトコル）からの欧州委員会Cantonale d&#39;Ethique de la Recherche 。インフォームドコンセントと書面による同意は、研究に関わるすべての成人被験者から得られた。 ヒト骨格筋からの筋芽細胞の単離<ol><li>すべての手順の間、レベルII組織培養フードの下で作業し、滅菌培地および滅菌緩衝液を使用して滅菌状態を維持する。 注：この手順は、多くの人間の骨格筋に適用することができます。 </li></ol> 2.解離プロトコル<ol><li>筋肉サンプル（2〜3g）を滅菌6cmプレート。 </li><li> 5~10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で筋肉サンプルを洗浄する。洗濯を繰り返します。 </li><li>湾曲したはさみとクランプを使用して結合組織と脂肪組織を除去する。 </li><li>筋肉サンプルを計量し（ステップ2.13参照）、新しい無菌6cmプレートに移す。 </li><li> 5mLの0.05％トリプシン-EDTAを添加する。 </li><li>はさみを使用して、筋肉組織を切断して小さな断片（2mm未満）にします。 </li><li> 10mLの血清学的ピペットを用いて、細かい筋肉を磁気棒を含む200mLの解離瓶に移す。 0.05mLのトリプシン-EDTA 90mLをすべての筋肉を切った状態で解離箱に移すまでこの手順を繰り返します。緩やかに攪拌しながら、解離瓶を閉じ、37℃で60分間インキュベートする。 </li><li>加熱浴から解離瓶を取り出し、解離瓶に10mLのウシ胎児血清（FCS;最終体積10％）を添加して酵素反応を停止する。混合物をピペットでホモジナイズする。 </li><li>準備それぞれに70μmセルストレーナを備えた2本の50mLチューブです。細胞懸濁液の半分を、懸濁液が通過するまでフィルター上を上下にピペッティングすることによって、各チューブ上の細胞ストレーナーに通す。 </li><li>チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> 10 mLの増殖培地（GM; 表1 ）で細胞を再懸濁し、1つの50 mLチューブに置かれた40μmセルストレーナーに細胞を通過させます。チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> 10mLのGMで細胞を再懸濁し、200×gおよび20℃で5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> 1mLのGMで細胞を再懸濁し、Neubauerチャンバーを用いて細胞を数えます。 注：通常、筋肉1gあたり3×10 5細胞の収量を収穫する必要があります。収量は、細胞の数を筋肉バイオプールの重量で割ることによって計算されるsy（ステップ2.4）。 </li><li> GMの4 mLを含む無菌の6 cmのプレートに2×10 5個の細胞を入れ、37℃、7％CO 2でインキュベートします。必要な数のプレートを準備します。 </li><li> 3日後にGMを変更してください。 注：新しく解離した細胞は培養プレートに接着する時間が必要です。さらに、最初の筋原性細胞倍化時間は約50〜60時間である。最初の分割後、倍加時間は約20時間です。 </li><li> 5〜7日後、細胞が70〜80％コンフルエンス（約1.5×10 6細胞/ 6cmプレートあたり）に達したら、抗体染色および細胞選別を開始する（ステップ3）。 </li></ol> 3.抗体染色および細胞選別<ol><li> PBSで1回すすいだ後、付着細胞（6cmプレート中）を37℃、7％CO 2で1mLの0.05％トリプシン-EDTAと3分間インキュベートする（または5％CO 2でインキュベートする）。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLのチューブに細胞を集める。遠心分離（200×g、5分間）後、res細胞をGM1mLに移す。 </li><li> Neubauerチャンバーを使用して細胞を数えます。 </li><li>氷上で以下の手順を実行します。 注：サイトメーターで正しい蛍光補正を設定する手順は必須であり、いずれのサイトメーターでも同様でなければなりません。チューブ1および2はネガティブコントロールとして使用されます。試験管3〜7を使用して、最初の実験中にサイトメーター上の補償を設定する（ 表2 ）。各抗体およびその対応するアイソタイプに使用される最終濃度は同じでなければならない（約1μg/ 10 6細胞）。 </li><li>チューブ1〜7（1〜7）について、1本のチューブ（5mLチューブ）あたり1×10 5個の細胞を送達する（ 表2 ）。残りの細胞懸濁液をチューブ8に入れて細胞分取する。 </li><li> 1mLの冷FACS緩衝液（PBS-5％FCS）で細胞を洗浄する。チューブを閉じ、200×gおよび4℃で5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li>チューブあたり200μLのFACSバッファーを加える。 thに抗体を加える表2による。氷上で30分間インキュベートする。 </li><li>細胞を洗浄する：1mLのFACS緩衝液を各チューブに加える。チューブを密閉し、200×gおよび4℃で5分間遠心する。上清を吸引して捨てる。もう一度このステップを繰り返します。 </li><li> 500μLのFACS緩衝液に細胞を再懸濁する。チューブを閉じ、細胞の選別まで氷上に置いてください。細胞分取の間に細胞を集めるために必要な、500μLのGMをそれぞれ含む1.5mLの4本のチューブを準備する。氷上に置いておいてください。 </li><li>フローサイトメトリーでヒト筋芽細胞をソートする（ 図1 ）。 CD45陽性造血細胞を排除した後、CD56発現に基づいてCD45陰性細胞を分離する。次に、CD34、CD144、およびCD146（ヒト筋芽細胞は、CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義される）のCD56陽性集団をゲートする。純度をチェックするために、選別された細胞集団の少数部分を再分析する。 </li><li>ヒトmyoblaを含むチューブをプールする1つの15 mLチューブに入れ、5 mLのGMを加えて1回洗浄する。チューブを200 xgおよび20°Cで5分間遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> 1mLのGMに細胞を再懸濁し、4mLのGMを含むコーティングされていない6cmプレート（プレートあたり2×10 5細胞）に細胞をプレートする。 37℃、7％CO 2でインキュベートする。 </li></ol>セルのメンテナンス<ol><li>培養培地の半分を2日ごとに交換する。培養皿から2mLの古いGMを取り出し、2mLのGMを加える。 注：筋芽細胞は、培養条件に有益な増殖因子を産生する。 </li><li>前分化を避けるために細胞が70〜80％コンフルエンスに達すると細胞をトリプシン処理する。 PBSで1回すすいだ後、接着細胞（6cmプレート）を37℃、7％CO 2で0.05％トリプシン-EDTA 1mLと共に3分間インキュベートする。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLチューブに細胞を集める。遠心分離（200×g、5分間）後、レウス細胞をGM1mLに入れてください。 </li><li>細胞を計数し、4mLのGM中に1プレートあたり2×10 5個の細胞を有する6cmプレートを調製する。 </li><li>ヒト筋芽細胞を6継代まで維持するか、または10％DMSO、mL当たり1×10 6細胞を含有するGMで凍結する。漸進的な凍結箱（1℃/分）で細胞を凍結する。長期保存のために、細胞を液体窒素中に置く。 </li></ol> siRNAによるヒト筋芽細胞のトランスフェクション注：分化誘導の2日前に市販のトランスフェクション試薬を用いて筋芽細胞をトランスフェクションします。遺伝子に対する特定のsiRNAの効果は、対照siRNAの効果と常に比較されます。 siRNAは二本鎖RNAであり、氷上に保管し、手袋で操作する必要があります。 <ol><li> 6cmプレート（およそ1.5×10 6細胞）中のヒト筋芽細胞の70〜80％コンフルエントな単層を得る。 注：トランスフェクションあたり5×10 5個の細胞が必要ですGMで2日後にトランスフェクトされた筋芽細胞の単層流暢単層である。 </li><li>ガラスカバースリップ（ステップ7のカルシウムイメージングで説明）を準備する。 </li><li> GMを温め、0.05％トリプシン-EDTA、およびPBSを37℃でインキュベートする。 </li><li>無菌性を維持するためにレベルII組織培養フードで以下のすべてのステップを実行する。 </li><li> 1.5mLチューブで、500μLの還元血清培地、3μLのトランスフェクション試薬、および1μLのsiRNAを20μMで送達する。静かに混合し、室温（RT）で15〜20分間保持する。 </li><li>このインキュベーション時間中、トランスフェクションのために筋芽細胞を調製する。 PBSで1回すすいだ後、接着細胞（6cmプレート）を37℃、7％CO 2で0.05％トリプシン-EDTA 1mLと共に3分間インキュベートする。 2 mLのGMを加えて反応を停止させ、15 mLチューブに細胞を集める。遠心分離（200xg、5分間）後、細胞をGM 1mLに再懸濁する。 </li><li> Neubauerチャンバーを使用して細胞を数えます。 </li><li> 5×10 5個の細胞を再懸濁する各トランスフェクション（ すなわち、 2回のトランスフェクションについて、400μL中に再懸濁）のためのGM200μL中でインキュベートする。 </li><li>各500μLのsiRNAトランスフェクタント混合物に200μLの細胞懸濁液を添加する。ピペットを2回上下に動かし、RTで5分間インキュベートする。 </li><li>ガラスカバースリップを含む3.5cmの培養皿に700μL（細胞+ siRNAトランスフェクタント）を加える。 2mLの最終容量を得るためにGMを添加する。 </li><li> 37℃および7％CO 2で24時間後、培地を新鮮なGM 2mLで完全に交換する。さらに24時間後、トランスフェクションされた細胞のコンフルエントな単層が通常存在する。そうであれば、GMを2mLの分化培地（DM; 表1 ）で置き換えることにより筋芽細胞分化を誘導する。 </li><li>分化誘導後、または増殖している筋芽細胞の24〜48時間後にカルシウムイメージング実験を行う。 注：免疫蛍光は、通常、分化誘導の48時間後に行われます。 </li></ol> 6.イム分化マーカーの非蛍光染色注：免疫蛍光染色は、DM中で48時間後に行うが、他の分化時間で行うこともできる。ミオゲニンおよびMEF2は、（筋管への融合前の）分化した細胞においてのみ発現される核タンパク質であり、それらの染色は分化プロセスの評価を可能にする。ミオシン重鎖（MyHC）は、筋管でのみ発現され、筋管のサイズおよび融合指数（筋管における核の数/核の総数）を推定するために使用される。 <ol><li> DM中で48時間後、分化した細胞のコンフルエントな単層を室温で1mLのPBSで2回洗浄する。筋管の取り外しを避けるために注意深く行ってください。 </li><li>室温で15分間、1mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定する。 PBSで2回、各回5分間細胞を洗浄する。 </li><li> 0.25％Triton X-100を含有する1mLのPBSで細胞を45分間浸透させ、1mLのPBSで3回洗浄する。 </li><li> unsをブロックする0.2％Tween-10および2％ヤギ血清（ブロック溶液）を補充したPBS中で室温で30分間インキュベートすることによって、非特異的結合部位を除去する。 </li><li>ブロック溶液（3.5cmプレートあたり600μL）で希釈した一次抗体を調製する。 注：マウス抗ミオゲニン（1：600）、ウサギ抗MEF2（1：300）およびマウス抗MyHC抗体（MF20,1：1,000）の一次抗体を使用する。同じブロッキング溶液、マウス抗ミオシン重鎖またはマウス抗ミオゲニンをウサギ抗MEF2と混合することが可能である。 </li><li>ブロック溶液を除去し、3.5cmプレートあたり600μLの一次抗体溶液を添加し、加湿チャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> 1mLのPBSで細胞を3回洗浄する。ヤギ抗マウスAlexa 488（1：1,000）、ヤギ抗ウサギAlexa 546（1：1,000）、およびヤギ抗ウサギAlexa 546（1：1,000）のように、ブロック溶液中で調製した600μLの二次抗体を含む暗室中、室温で1時間インキュベートする。およびDAPI（1:50、15μMでのストック溶液）である。 カウチョN：DAPIは、手袋を用いて取り扱われるべき有毒な化合物です。 </li><li> 1mLのPBSで細胞を3回吸引洗浄する。 </li><li>ポリビニルアルコールを使用したマウントガラスカバーガラスには褪色防止剤が入っています。それらを4℃に保ち、細胞を画像化するまで光から保護する。 </li></ol> 7.カルシウムイメージング<ol><li>培養前に、直径25mmのカバーガラスを用意する。カバースリップを70％エタノールに48時間入れ、グリースと汚れを表面から除去し、カバースリップへの細胞接着を減少させる。 </li><li>カバースリップを水で数回すすいだ後、水に戻して滅菌（オートクレーブ）してください。 </li><li> 3.5cmの培養プレートごとにカバースリップを1つ入れ、乾燥させます。さらなる実験のためにペトリ皿を保管しておくか、すぐに使用してください。 </li><li>トランスフェクションされた筋芽細胞（5〜6×10 5細胞）をガラスカバースリップに加える。 注：実験は、差異の誘発から24〜48時間後に行われます増殖している筋芽細胞上に、または増殖する。 </li><li> Ca 2+イメージングを行うには、PBSで細胞を2回洗浄するか、または実験に使用した培地（カルシウム含有培地; 表3 ）で細胞を直接洗浄する。 2μMのFura-2 / AMと1μMのプルロニック酸を含む細胞を室温で暗所で約30分間ロードする。 注：プルロニック酸はFura-2を可溶化するのに役立ちます。 Fura-2 / AMおよびプルロニック酸は、カルシウム含有培地に溶解される。 </li><li> Fura-2 / AMおよびプルロニック酸を含まない同じ培地で細胞を2回洗浄し、暗所に10〜15分間放置してFura-2 / AMの脱エステル化を可能にする。 </li><li> Fura-2のローディング効率が低すぎる場合、より多くのFura-2（ 例えば、 4μM）を添加し、および/またはより長い時間（ 例えば、 40分間）細胞をインキュベートする。 </li><li>培養プレートからカバーガラスを取り出し、実験室に設置する。 ~1mLのカルシウム含有培地を加える（実験の容量に応じて）メンタルチェンバー）。顕微鏡ステージに設置し、記録を開始します。 注：蛍光性Ca 2+感受性プローブFura-2は340nmと380nmで交互に励起され、放出光は510nmで収集されます。 Ca 2+濃度の変動は比較的遅いので、2秒ごとに1つの比率を獲得する。 </li><li> SOCEを活性化するために、以下の古典的タプシガルギン/ Ca 2+再添加プロトコールを用いる：細胞をカルシウム含有培地中に2〜3分間放置する。培地を無カルシウム培地で1〜2分間交換する。 <ol><li> 1μMタプシガルギンを添加して、内部カルシウム貯蔵量を枯渇させる。 注：タプシガルギンは、細胞小胞体Ca 2+ ATPアーゼ（SERCA）ポンプ活性の不可逆的なブロッカーである.8〜10分後、迅速に培地をカルシウム含有培地に交換する。 Ca 2+はSOCEチャネルを介して細胞に入る。実験を終了する前に約5分間待ちます。 注意：タプシガルギンは、有毒な化合物であり、手袋で取り扱う必要があります。 </li></ol></li></ol> 8. Ca 2+測定分析注：収集ソフトウェアを使用して分析を実行します。 <ol><li>実験を開きます。細胞が存在しない領域（背景領域）に領域1を描画し、分析対象の細胞の細胞質に他の領域を描画する（領域は任意の画像上に描くことができる：340nm、380nm、または比率画像）。 [実験を実行]&gt; [参照画像]に移動します。 340と380のチャンネルの下で、 &quot;地域1&quot;を選択し、 &quot;バックグラウンドを引く&quot;をクリックします。 </li><li>バックグラウンド領域を通過する蛍光ダストスポットなど、バックグラウンド領域と干渉しないこと、および実験の間に細胞が動いていないことを確認するために、実験全体を実行する（F4：前方）。 注：選択された関心領域暗い部分は含めないでください。それ以外の場合は、バックグラウンドの一部が測定に含まれるため、比率の値はノイズが多いように見えます。 </li><li> [ログデータ]をクリックし、再度実験全体を再生します。 注：これにより、時間と比率が記録されたスプレッドシートが開きます。個々の340nmおよび380nmの波長を節約することも可能である。 </li><li> SOCEについての情報を得るには、Ca 2+再添加の振幅とCa 2+進入期の傾き（ 図3 ）の2つの重要なパラメータを実験から抽出する。 </li><li> Ca 2+上昇の最大振幅からCa 2+再添加の直前に比の値を減算することによって振幅を得る。 Ca 2+再添加後の最初の秒の線形回帰を適合させることによって最大傾きを得る。 注：タプシガルギン応答のカーブの下の領域も、extracの有益なパラメータですそれはSRに貯蔵されている遊離カルシウムの量を反映しているからである。 </li></ol>

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R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2++release.">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li><li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER.">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2+-sensitive+fluorescent+proteins.">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li></ol>

著者には競合する金銭的利益はない。

成体骨格筋由来のヒト筋芽細胞の単離および培養は、筋肉分化および筋肉再生を研究するインビトロモデルを提供する。この論文では、高収量のヒト筋芽細胞の精製を簡単かつ低コストな方法で可能にするプロトコールを提供する。さらに、この技術は、単離された筋芽細胞の割合および筋原性分化効率に関して、信頼性の高い再現性のある結果を提供する。?...

ヒト骨格筋は、筋原性前駆細胞の融合から生じる収縮性多核筋繊維の群からなる。骨格筋は、筋繊維（筋帯）の原形質膜と基底板との間に位置する骨格筋幹細胞であるSCの存在により、損傷後に再生する能力を有する。損傷を受けていない筋肉では、SCはほとんどが静止状態にある。機械的ストレスまたは損傷に応答して、SCが活性化（筋芽細胞）となって増殖し、SCプール1、2を補充する新しい筋線維または自己複製を形成するために、どちらかの分化を受けます。長年にわたり、SCおよびその子孫、筋芽細胞を骨格筋生検から単離するためのいくつかの技術が開発された。これらの細胞上で発現される細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） 3の方法論のより深い理解により、4、5、筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を単離することが可能です。 カルシウムシグナリングは、骨格筋の発達、ホメオスタシス、および再生を調節する。特に、SOCEと呼ばれる細胞内貯蔵枯渇後に活性化されるCa 2+流入は、これらのプロセスにとって非常に重要である6 。細胞刺激により、エンドソー/筋小胞体（ER / SR）におけるCa 2+レベルが減少し、それにより、ER / SR 7を補充するためにCa 2+流入を可能にする原形質膜Ca 2+チャネルが活性化される。 SOCEに関与する2つの主なタンパク質は、ER / SR Ca 2+感知間質相互作用分子1（STIM1）タンパク質および原形質膜Ca 2+チャネルOrai1である。骨格筋は、これらの2つのタンパク質ならびに同じファミリーの他のタンパク質を豊富に発現する（STIM2 aND Orai2-ORAI3）8,9及び一過性受容体電位カノニカル（TRPC）ファミリー10、11、12、13のいくつかのCa 2+チャネル-permeable。 SOCE経路を通じたCa 2+流入は、筋形成/再生14にとって非常に重要である。 STIM1またはOrai1タンパク質の変異は、筋機能に有害な影響を与え、主に筋緊張低下につながる15 。 SOCE障害を有する動物モデルはまた、強化された疲労性6、16、17と一緒に、減少した筋肉量と力を表示します。前述したように、他のSTIMタンパク質およびOraiタンパク質ならびに多くのTRPCチャネルは、骨格筋において発現され、それらのそれぞれの役割はこれまで決定されていない。ノックすることでdそれらの発現レベルを所有しているので、ヒトの骨格筋分化中のSOCEおよびそれらの役割におけるそれらの影響を調べることが可能である。 SOCE測定は、電気生理学的電流記録およびCa 2+測定の2つの異なるアプローチを用いて行うことができる。電気生理学は、関心のある電流およびそれに関連する電気生理学的特徴を測定するので、確かに直接的な方法である。しかしながら、この技術は、主に筋肉細胞のサイズが大きく、内因性SOCE電流が小さいため、筋肉細胞に適用することは非常に困難である。サイトゾルCa 2+イメージングは​​技術的に非常にアクセス可能ですが、サイトゾルで測定されたCa 2+レベルはCa 2+の流入と細胞または内部貯蔵庫からの再ポンピングの両方を反映するので、測定はより間接的です。 ヒト骨格の小片から筋芽細胞を単離することを含む方法論この論文では、酵素消化、増幅、およびFACS後の筋肉を説明します。時間の経過に伴う分化マーカーの発現に続く筋肉分化および免疫蛍光プロトコールのプロセスが記載されている18 。最後に、SOCEの測定およびCa 2+シグナル伝達および骨格筋分化における異なるイオンチャネルの役割について説明する。

<table><tbody><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethansone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Creatine</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&amp;nbsp;mL tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15&amp;nbsp;mL tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&amp;nbsp;mL tube (FACS)</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Culture medium: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Transfectant reagnt: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&amp;nbsp;</td><td>concentrate</td></tr><tr><td>Mouse anti-myogenin</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-MEF2</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti human CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 mouse IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 mouse IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC mouse IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE mouse IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>CAUTION:&amp;nbsp; toxic compound</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>CAUTION&amp;nbsp;: toxic compound&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&amp;nbsp;: MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human myoblasts, assessment of myogenic differentiation, and store-operated calcium entry measurement

衛星細胞（SC）は、筋線維の原形質膜と周囲の基底層との間に位置する筋幹細胞である。彼らは筋肉の再生に不可欠です。骨格筋において頻繁に起こる傷害の際に、SCが活性化される。それらは筋芽細胞として増殖し、筋肉病変を修復するために分化する。筋肉分化の間に起こる多くの事象の中で、サイトゾルCa 2+シグナルは非常に重要である。これらのCa 2+シグナルは、細胞内空間、特に貯蔵操作Ca 2+エントリー（SOCE）からのCa 2+流入と同様に、内部Ca 2+貯蔵からのCa 2+放出から生じる。この論文では、整形外科手術後に収集された筋肉サンプルからヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るために使用される方法論について説明する。組織を機械的および酵素的に消化し、細胞を増幅させ、次いで、細胞の特異的存在に基づいてフローサイトメトリーによって選別するfic膜マーカー。得られた後、ヒト筋芽細胞を増殖させ、培地から増殖因子を除去することによって分化することを約束する。特異的転写因子の発現レベルおよびin vitro免疫蛍光を用いて、対照条件下で、およびCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質をサイレンシングした後の筋形成分化プロセスを評価する。最後に、信頼できる再現性のあるSOCEの測定値を提供するレシオメトリックなCa 2+プローブとしてのFura-2の使用について詳しく説明します。

ヒト筋肉試料の酵素的解離の後、細胞はGMで増幅された。 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-細胞と定義されるヒト筋芽細胞は、FACS後に得られた。筋芽細胞は分析された集団の60％以上を占めていた（ 図1 ）。初代ヒト筋芽細胞を再播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、DM中で48時間培養した。転写因子MEF2および筋肉特異的タンパク質ミオシン重鎖（MyHC）の発現の?...

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Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K ビュー.  Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine. ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。 

ビデオ: Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

生物学

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

医学

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...