Name: in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging
Uploaded: 2017-01-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

注：約2 35mm皿または2ライブイメージングの料理なので、計画mattings、解剖、それに応じてコーティングする（ステップ2.6）のための1匹のマウスの利回り十分な筋芽細胞。 10匹の動物 - 筋芽細胞は、シーケンシャル遠心分離し、プレめっきを介して分離されているので、プロトコルは5のバッチで行われるべきです。 動物を対象とするすべての手順は、研究所デMedicina分子と大学ピエールエマリー・キュリーで動物倫理委員会によって承認されました新生児マウス後肢の筋肉の1解剖<ol><li>事前（ 材料表 ）内のすべてのソリューションを準備し、濾過（0.22μmのフィルター）により滅菌します。すべてのメディアが基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）を含有する製剤を除き、細胞に添加する前に37℃であることを確認してください。 </li><li> 、湾曲はさみ、ストレートはさみ、定期的な鉗子：解剖材料（1のそれぞれを滅菌しますそして、先の細いピンセット）、70％エタノールでそれらを拭き作業台。 </li><li>筋肉のコレクションのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）5mlで100ミリメートルペトリ皿を準備し、ミンチ工程まで氷上で保管してください。 </li><li>ストレートはさみでP8マウスおよび70％エタノールで皮膚を殺菌 - P6を刎ねます。 </li><li>背中の皮膚の切開部を作成し、それが除去されるまで後肢に向かってゆっくりと引いて、完全に後肢の筋肉組織を露出させます。 </li><li>筋肉を損傷することなく、脂肪組織を除去するために鉗子を使用してください。 </li><li>背側後肢の筋肉を削除するには、伸ばし手足を維持し、かかとの腱を露出するように足を曲げます。静かにスライドさせて上向きに切断することにより、腱から出発し、骨から筋肉を分離するために湾曲したハサミを使用してください。筋肉を切除し、氷冷DPBSに配置します。 </li><li>先の細いピンセットで筋肉をつまんおよび大腿骨または膝関節に損傷を与えることなく、その周りを切断することにより、大腿四頭筋を分離します。</li><li>すべての動物を解剖した後、以下のすべてのステップが実行されるべき無菌層流細胞培養フード、に進みます。 </li></ol> 2.筋芽細胞の単離<ol><li> DPBSの過剰を削除します。均一な塊を得るために、滅菌湾曲鋏で組織をミンチ。 </li><li>消化ミックスの5ミリリットルを使用して50 mLコニカル遠心管中で細分化した組織を収集し、37℃で90分間攪拌しながら、それをインキュベートします。 </li><li>解剖媒体の6ミリリットルを追加することによって、消化を停止し、残りの組織をペレットに75×gで5分間のサスペンションを遠心します。 </li><li>注意深く上清を収集します。 組織破片を収集していないようにしてください 。 5分間350×gで、それを遠心。解剖培地5mLにそれを再懸濁します。 </li><li> 40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。 &lt;解剖培地25mlを加え、細胞培養インキュベーター中で4時間、150 mmディッシュでそれをpreplate（37℃、5％CO 2/サブ&gt;）の線維芽細胞が付着することを可能にします。 </li><li>室温で1時間の冷IMDMで100：プレプレーティングが、基底膜マトリックスの500μLとコートの料理は1に希釈しました。 DPBSで1回洗浄し、直ちに（ステップ2.8）に細胞をプレーやメッキまで増殖培地で残します。 </li><li>プレプレーティングした後、上清を回収し、10分間、350×gでそれを遠心。 </li><li>増殖培地中でそれを再懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。 150,000および250,000細胞が基底膜マトリックスでコーティングしたシャーレごとにメッキされるように、音量を調整します。細胞培養インキュベーター中で細胞を保管してください。 </li></ol> 3.筋線維の分化注：3日後、細胞を、約70％の密集度（ 図1B）で筋管を融合し、形成するために開始する必要があります。 <ol><li>所望であれば、この時点では、関心対象のsiRNAまたはDNAで細胞をトランスフェクトします。細胞は、トランスフェクトされるべきではない場合は、分化培地とスキーに直接変更pが3.4に進みます。 </li><li>製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトします。 siRNAの脂質複合体（20 nMの+試薬の1μL）またはDNA-脂質複合体（1μgの+試薬の1μL）で5時間細胞をインキュベートします。必要に応じて、siRNAおよびDNA濃度を最適化します。 </li><li>分化培地で1回洗った後、新しい分化培地に切り替えます。 </li><li>次の日、基底膜マトリックス1を希釈：2を氷冷分化培地中。既存の培地を除去し、各皿に氷のように冷たい行列の200μLを追加します。 </li><li>細胞培養インキュベーター中で30分間インキュベートします。 </li><li>アグリン（100ng / mlの）と分化培地を補完し、慎重に細胞に2 mLを加え。 </li><li>慎重に、常に100 ngの/μLの最終濃度にアグリンで補う、培地の半分ごとに2日を変更します。 </li><li>細胞分化および生存率を監視します。このようなFBSおよびcなどの要因（の種類によって完全な成熟（ 図2）に到達するために10分化さd - hickenは胚芽抽出物起源）、細胞が5間がかかる場合があります。 </li></ol>ガラスボトムディッシュ4.免疫染色<ol><li>免疫染色のために、目的の任意の時点で、DPBSで細胞を1回洗浄し、10分間室温で4％PFAで固定し。 </li><li> DPBSで二回、それらを洗ってください。この時点で、細胞を4℃で保存することができます。 </li><li> RTで5分間、0.5％トリトンX-100でそれらを透過。 </li><li> PBSで2回洗って、室温で30分間ブロッキング溶液でブロックします。 </li><li>ソリューションのO / N、4°Cでブロッキング希釈した一次抗体を用いて、それらをインキュベートします。 </li><li>室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 </li><li>二次抗体と室温で1時間のためのDAPI0.2μgの/ mLでそれらをインキュベートします。 </li><li>室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 </li><li>マウンティング培地200μLを追加し、イメージングに進みます。 </li></ol>

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	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. 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著者らは、開示することは何もありません。

一次筋芽細胞の培養にこのプロトコルの使用を大幅に筋線維の発達を育む特別なニッチを生じさせます。これはまた、非常に少数で存在する他の細胞型に部分的に起因します。筋芽細胞濃度および培養純度のバランスが達成されなければなりません。良好な細胞培養はまた、培地製剤に使用される製品の品質に依存します。動物源由来すべての製品は、徹底的にテストする必要があります。我々の経験では、消化条件も監視する必要があります。 初代培養のためにいつものように、実験的な変動は、単離された繊維または不死化筋芽細胞を用いた研究に比べて高くすることができます。この変動は、培地、消化成分、マウスの年齢およびサイズ、および培養操作と結果の収集のための時間ポイントの標準化によって減少することができます。それにもかかわらず、複雑なメカニズムをリアルタイムで精査の利点筋線維の開発に必要な大幅に変動欠点を凌駕しています。 このプロトコルは、細胞分化を損なうことなく、インビトロのアプローチの利点を与えます。三和音が形成されており、収縮はカルシウムスパークに結合されるまで、筋線維が成熟します。これらの機能の出力は異なる実験条件でアクセスすることができます。また、プロトコルに作られた多くの技術的なバリエーションが存在し得ます。筋芽細胞は、筋肉の発達に関連する関心の変異を有する新生児マウスから採取することができます。細胞は、異なる分化時点で生化学分析のために溶解され得ます。カルシウムインジケーターは、そのダイナミクスを追跡するために培養物に添加することができます。光遺伝学の構築物は、特定のシグナル伝達経路を強制するか、特定のローカル応答を誘導するために使用することができます。最後に、筋線維は、それらの相互作用を研究するために、他の細胞型と共培養することができます。

骨格筋は、体重1の40％までを構成します。筋肉関連障害は、莫大な健康と経済的負担2を表します。この非常に複雑で組織化組織が、形成され維持され、再生されどのように広範かつ十分に確立された研究分野を構成しています。 6 -特定の科学的関心に応じて、最も適したアプローチは、単純な培養筋管からのin vivoモデル3 における複合体に及ぶことができます。 このプロトコルの目的は、ライブイメージングおよび免疫蛍光を通して筋形成の監視を可能にするin vitroのシステムを提供することです。従来のアプローチと比較すると、このシステムは、マウス筋原プロセスに非常に完全かつダイナミックな洞察を提供しています。細胞は、筋芽細胞の段階から横方向三和音と周辺核7を表示する成熟した、多核筋線維を追跡することができます。この成熟レベルすることができます複雑な刺激または機械的な装置を必要とせず、定期的な細胞培養装置を用いて達成することができます。 試験管内システムにおけるいくつかの成功が我々の知る限り、8,9を報告されているが、これは横方向に小胞体（SR）と対になったT管と成熟したマウスの筋線維を生成する唯一のプロトコルです。したがって、このインビトロ系ではまだ不十分10を理解されトライアド形成の分子メカニズムを研究するために使用することができます。 このシステムを用いることのさらなる利点は、このような抗体、薬物、およびRNAiツールとして検証マウスターゲットリソースの利用可能性です。比較的単純なプロトコルは面倒な手順、高度に熟練した操作、または高価で専用の機器を必要としません。成熟した筋線維は、カルシウムスパーク（未発表データ）に結合された収縮性を表示し、培養分化7の5日後に現れる開始します。 1週間では、さまざまな開発哺乳類の身体の中で最も複雑なセルの一つのアル段階は、 インビトロアッセイの様々な組合せで試験することができます。

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

骨格筋は筋繊維、最大の哺乳類の体内の細胞と少数の合胞体の1で構成されています。どのようにそれを構成する複雑かつ進化的に保存された構造が組み立てられていることは調査中のまま。その大きさと生理的機能は、多くの場合、操作およびイメージングアプリケーションを制約します。不死化細胞株の培養物が広く使用されているが、それだけで、分化の初期段階を複製することができます。 ここでは、初代マウス筋芽細胞由来の筋線維の簡単な遺伝子操作を可能にするプロトコルを記述します。分化の1週間後、筋線維は収縮、整列サルコメアと三和音、ならびに末梢核を表示します。全分化プロセスは、ライブイメージングまたは免疫蛍光法によって追跡することができます。このシステムは、既存のex vivoでのおよびin vitroプロトコルにおける利点を兼ね備えています。簡単かつ効率的なトランスフェクションの可能性だけでなく、すべての分化段階へのアクセスの容易さは、潜在的な用途を広げます。筋線維は、その後、関連する発達および細胞生物学の問題に対処するだけでなく、臨床応用のための筋肉疾患の表現型を再現するだけでなく、使用することができます。

筋線維の発達の程度は、主に単離された筋芽細胞の純度および生存率によって決定されます。接着、増殖、および融合能力は、経験的に、これらのパラメータ（ 図1 A、B）にアクセスするために使用することができます。増殖D2では、筋芽細胞が付着している必要があり、典型的な紡錘状の形状を表示する必要があります。増殖は、自発的な筋管形成翌日（ 図1B）につながる、この段階で広範囲に起こると予想されます。 細胞集密度は、微調整が必​​要になる場合があります。筋芽細胞が増殖し、融合する以上の3日間を取る場合は、それを大きくする必要があります。筋線維は、それらの密度まで成長し、比較的まっすぐ伸長する許可されていない場合は、減少させるべきです。最高の筋線維は、外側領域に向かって発見されるべきであるので、密集度は、典型的には、皿の中心部から周辺部に減少しています。 筋管はすぐに複数の中央に整列核（ 図1C）を細長くし、表示されます。 D5によって、いくつかの細胞が光条を取得し、周囲にそれらの核の移動を開始します。成熟した特性を持つ筋線維の数は、時間とともにだけでなく、セル厚（ 図1D）と増加します。 分化の程度は、さらに免疫蛍光によって観察することができます。分化D8存在横断トライアドに固定筋繊維。これは、トライアッド（ 図2）で共局在化することが期待されているT-細管（DPHR）及びSR（triadin）のイメージング成分によって確認することができます。 筋線維の機能は、ライブイメージングによって対処することができます。以降分化D3からは、細胞は、自発的なけいれんを表示します。カルシウムセンサーをトランスフェクションすることにより（ 例えば 、、GCaMP6f 11）は、収縮カルシウムピーク（ 図3）に結合されていることを観察することができます。 このシステムを使用して、我々はそのための革新的な分子療法7のための新規の対象となり得る中心核ミオパシーおよび筋緊張性ジストロフィーで破壊された新規分子経路を特定することができました。我々はまた、神経筋接合部（NMJ）12の開発を研究するために、この方法を適応しています。ラットの脊髄の外植片との共培養を通じ、我々はNMJ形成13におけるダイニンの役割を記載しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> 図1： 筋芽細胞文化の発達段階。 A）増殖D2では、筋芽細胞が付着し、増殖し始めています。 prolifではB）eration D3、60の密集度 - 80％に達し、筋芽細胞は、自然に融合し始めます。分化D3においてC）は 、中央に位置する核を含有する筋管が優勢です。以降分化D5（ 例えば、8日目）からD）、筋線維が展示条線と周辺の核を開始し、厚くし始めます。スケールバー：50μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> 図2：D8 筋線維イムノの代表的な共焦点画像。 A）ジヒドロピリジン受容体（DHPR、上部パネル）の免疫染色および（TRDN、中央のパネル）triadin。 DHPR、TRDN、およびDAPIチャンネルのオーバーレイは、トライアドの構成要素の共局在を示しています。 B）<html> A. Cに描かれた黄色の線）αアクチニン（緑）およびDAPI（青）について染色した筋線維のボリュームレンダリングの3D画像の強度プロファイル。スケールバーとグリッド幅：5μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> 図3： 自発けいれんと筋繊維内カルシウムレベルのライブイメージング。けいれんの筋線維中のカルシウムスパークのA）高速タイムラプス（20ミリ秒フレーム）顕微鏡。カルシウムはGCaMP6f（Addgeneプラスミド＃40755）の発現を介して検出されました。パネルA中のカルシウムセンサーの経時的な蛍光強度のB）定量_blank &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K ビュー.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

遺伝学

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

生物学

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

医学

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

要約

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ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブイメージングを利用しました。

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

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ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブイメージングを利用しました。