この研究は、中国国立自然科学財団（No.31472037）からの助成金によって支えられている。この記事の商号または商用製品についての言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、推薦を意味するものではありません。

注：RNA分解を制限するために、湿式オートクレーブ蒸留水（121℃で60分間）および湿式オートクレーブ材料を使用して溶液を調製します。 RNA ISHアンチセンスプローブおよびセンスプローブの調製<ol><li> 標的遺伝子増幅および精製 <ol><li>断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migratoria OR1（JQ766965 LmigOR1、GenBankの）の387 bpの二本鎖断片を生成します。 <ol><li> 50μLの2x反応混合物、4μLのセンスおよびアンチセンスプライマー（ 表1 ）、1μLのプラスミドテンプレート、および41μLのRNaseフリーH 2 Oを含む100μLの最終反応容量を使用します。以下のPCRプロトコル：94℃で5分間、続いて94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル続いて72℃で10分間インキュベートした。 </li><li>これらのステップを繰り返して、 LmigOR2 （GenBank：JQ766966）の1,303bp二本鎖フラグメントおよびLmigorco （GenBank：JN989549）の1,251bp二本鎖フラグメントを作製する 。これらの実験で使用したプライマーを表1に示す 。 </li><li> 1.2％アガロースゲル上で1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液中でPCR産物を泳動し、エチジウムブロマイド染色を用いて視覚化する。 </li></ol></li><li>これらのPCR産物をゲル抽出キットを用いて抽出する。 <ol><li>電気泳動後、ゲルからDNAバンドを切り出し、ゲルスライスを1.5mLチューブに入れる。次に、0.1 gのゲルスライスあたり100μLの結合バッファー（Buffer PN）を添加する。ボルテックスし、ゲルスライスが完全に溶解するまで50℃でインキュベートする。 </li><li>コレクションチューブにCA2吸着カラムを挿入し、500μLの平衡バッファー（Buffer BL）を添加する。これにより、シリカ膜の吸収能力およ​​び安定性が改善される。セントリ12,400×gで1分間フュージします。 </li><li>溶解したゲル混合物を吸着カラムアセンブリに移し、室温で2分間インキュベートする。次に、チューブを12,400 xgで1分間遠心します。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li> 600μLの洗浄液（エタノール添加、Buffer PW）を2回加える。 12,400×gで1分間遠心分離する。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li>回収チューブを空にし、カラムアセンブリを12,400 xgで2分間遠心分離して、残留エタノールを蒸発させます。 </li><li>慎重に、吸着カラムを清潔な1.5 mL遠心チューブに移す。ペレットを5〜10分間空気乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水の適切な容量（ 例えば、 30μL）でDNAを再溶解する。 </li><li> RTで2分間インキュベートする。 12,400×gで2分間遠心分離する。吸着カラムを捨て、DNAを4℃または-20℃で保存します。 </li></ol></li></ol></li><li> 組換えプラスミドを構築する <ol><li>個別LmigOR1、LmigOR2の1303 bp断片及びT7（上流）及びT4 DNAリガーゼを用いて挿入されたDNAに隣接するSP6（下流）RNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するTベクターへLmigORcoの1,251 bp断片の387 bp断片を連結。以下の10μLの反応液を調製する：2×ライゲーションバッファー5μL、Tベクター1μL、挿入遺伝子DNA3μL（〜100ng）およびT4 DNAリガーゼ1μLを加え、4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を、滅菌1.5mLチューブ中の50μLのコンピテントエシェリヒア・コリ DH5α細胞に別々に含む各組換えプラスミド5μLを加える。 <ol><li>静かに混合し、30分間氷中にチューブを入れ、42℃で90秒間インキュベートする。℃。それらを3分間氷の中に戻す。 </li><li>すべてのチューブにアンピシリンなしルリア-ベルターニ（LB）液体培地450μLを添加し、 大腸菌 DH5αを復元するために、37℃で1時間、150rpmで振とう機でそれらをインキュベートします。 </li><li> 50μg/ mLアンピシリン、24μg/ mLイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）、および40μg/ mL 5-ブロモ-4を含むLB固体基質プレートに接種するために、各形質転換体の100μLアリコートを取り、 - クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）である。 </li><li>これらのプレートを一定のインキュベーター内で37℃で18時間インキュベートする。青 - 白スクリーニング法を用いて標的組換えプラスミドをスクリーニングする。サンガー配列決定を用いて標的組換えプラスミドを配列決定し、3つのOR遺伝子の挿入方向を同定する。 </li></ol></li></ol></li><li> 制限エンドヌクレアーゼを選択して組換えプラスミドを線状化する <ol><li>制限エンドヌクレアーゼの使用ベクターは、ベクターの複数のクローニング部位を消化するだけでなく、挿入DNAを切断しない。この実験では、3つの遺伝子すべてが、ベクターの方向に対応する方向でTベクターに挿入される。 </li><li>アンチセンスプローブを生成するためにLmigOR1の387 bp断片、LmigOR2の1303 bp断片とLmigORcoの1,251 bpの断片を含む組換えプラスミドを線形化するためのNco I制限エンドヌクレアーゼを使用します。 Spe I制限エンドヌクレアーゼを用いてセンスプローブを作製する。 注：挿入方向がベクターの挿入方向と一致する場合、T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。そうでない場合、挿入方向がtに対応しない場合SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。 </li></ol></li><li> 線状化された組換えプラスミドの精製 <ol><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を含む10個の10μLの反応液にNcoI制限エンドヌクレアーゼを用いた3種の組換えプラスミド20μgを10μlの緩衝液、 40μlの0.5μg/μLのプラスミド、 3μLのNcoIおよび47μLのRNaseフリーH 2 Oを添加し、続いて37℃で3時間インキュベートした。 </li><li>同様に、20μgのこれらの3つの組換えプラスミドuSpe I制限エンドヌクレアーゼを歌う。 </li><li>これらの消化したプラスミドを1.1.2に記載のゲル抽出キットを用いて精製する。抽出した線状化組換えプラスミドの濃度を分光光度法で測定し、0.5μg/μLに調整する。 </li></ol></li><li> アンチセンスとセンスプローブの準備 <ol><li> T7 / SP6 RNA転写システムを使用して、アンチセンスプローブおよびセンスプローブを生成する。 SP6 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで鋳型としての線状化組換えプラスミドを用いて、これら3つのOR遺伝子のDIGおよびビオチン標識アンチセンスプローブの二本鎖RNAを転写する。 T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを生成する。 10倍のNTPミックス2μL、10X転写バッファー2μL、RNaseインヒビター1μL、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ2μL、0.5μg/μLの線状化プラスミド4μL、および2μLの線状化プラスミドを含む20μLの最終容量で反応を行い、 9μLのRNaseフリーH 2 O、続いて37℃で3時間インキュベーションすることにより実施した。 </li><li> DIGおよびビオチン標識したアンチセンスおよびセンスプローブを37℃で1μLのDNaseで30分間インキュベートする。 2.5μLの5 M LiClと75μLの無水エタノールを添加し、反応物を-70°Cで30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間、15,000×gで遠心分離する。慎重に上清を傾瀉する。沈殿剤を洗浄するために150μLの70％エタノールを加える。滅菌蒸留水（263.2mL）に95％エタノール（736.8mL）を加えて70％エタノール（1L）を調製する。 </li><li>再び4℃で15,000 xgで30分間遠心分離し、ペレットを室温で5〜10分間風乾します。 25μLのRNaseフリーH 2 Oを添加して、RNAアンチセンスおよびセンスプローブを溶解させます。 </li><li>挿入された遺伝子の長さが1kbより長い場合は、続いて重炭酸塩 - 炭酸塩緩衝液中でのインキュベーションによって〜300bpの平均長さまでプローブRNAアンチセンスおよびセンスプローブを断片化する。 50μLの最終容量で反応を実施する.cRNAプローブのontaining 25μLおよび重炭酸塩-炭酸塩緩衝液25μL（80mMのNaHCO 3を、120mMののNa 2 CO 3、pHは10.2）60℃。必要とされる加水分解時間は、以前に公表された式17によって与えられる。 </li><li> 5μLの10％酢酸を加えて反応を停止する。この実験では、 LmigOR2およびLmigORcoのアンチセンスおよびセンスプローブをそれぞれ24および23分間断片化する。 T =（L 0 -LのF）/ KXL O XL F L oは KB中の初期断片長= L f = kbでの最終断片長さ k =加水分解速度定数、約0.11 kb -1 min -1 t = minにおける加水分解時間</li><li>最後に、250μLのハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、-80℃で保存する。 </li></ol></li></ol> 2.クライオスタットセクションの準備<ol><li>プレクールフリーズミクロトーム、すなわち-24℃。 </li><li>活発で、元のままのアンテナを持っている新しい脱皮成虫のイナゴを選択してください。滅菌カミソリを使用してアンテナを2〜3mmの部分に切断します。 </li><li>凍結ミクロトームホルダーにOCT化合物を入れ、1〜2個のサンプルを化合物上に水平に置く。次にホルダーを-24℃で凍結ミクロトームに移し、化合物が凍結するまで平衡化させます。ホルダーを取り出し、少量の化合物でサンプルを覆います。ホルダーを凍結ミクロトームに-24℃で少なくとも10分間再度移す（ 図1 ）。 注：化合物に泡が入らないようにしてください。 </li><li>サンプルが入ったホルダーを凍結ミクロトームに固定し、凍結したサンプルを-24℃で厚さ12μmの切片に分ける。 </li><li>スライスをスライド（25 x 75 mm;ヌクレアーゼフリー）に1枚ずつ解凍し、10分間風乾します。 </li></ol> 3.固定部<ol><li>クライオスタットを準備した後スライドをプラスチック容器（約100 x 40 x 80 mm）に入れ、スライドを4％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）中で4℃で30分間インキュベートすることによって組織を固定する。 </li><li>スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1分間洗浄する。 </li><li>アルカリ性タンパク質を除去するために、スライドを0.2M HClに10分間移す。 </li><li>核酸の表面タンパク質を除去するために、スライドを1％Triton X-100を含む1XPBSに2分間移す。 </li><li> 1×PBSで30秒間スライドを2回洗浄する。 </li><li>最後に、4℃で10分間ホルムアミド溶液でスライドをすすいでください。 </li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> アンチセンスプローブとセンスプローブの準備 <ol><li>ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、1.5 mLのヌクレアーゼフリーチューブでRNAアンチセンスまたはセンスプローブを希釈します。この実験では、すべてのアンチセンスプローブおよびセンスプローブ（ LmigOR1、LmigOR2、およびLmigOrco ）について、 99μにプローブ1μLを添加するLハイブリダイゼーションバッファーを含む。一般に、アンチセンスプローブの1：100希釈物の使用は、このプロトコールを用いて有意な陽性シグナルおよび低いバックグラウンドを産生する。 </li><li>色素産生検出のために、DIG標識プローブを個別に希釈する。 </li><li> TSA検出のために、ハイブリダイゼーション緩衝液中で一緒にビオチン標識LmigOR1プローブとビオチン標識LmigOrcoプローブまたはDIG標識LmigOR2とDIG標識LmigOR1を希釈します。 </li><li>希釈液を65℃で10分間加熱し、少なくとも5分間氷上に置く。 </li></ol></li><li> ハイブリダイゼーション <ol><li>スライドを排出し、100μLの希釈アンチセンスおよびセンスプローブ（ステップ4.1）を組織切片に加える。次に、組織切片上にカバースリップ（24mm×50mm;ヌクレアーゼフリー）を置く。 </li><li>カバーされたスライドを湿ったボックス（〜300 x 180 x 50 mm 3 ; 図2 ）に水平に置き、t 55℃で22時間。箱の底にホルムアミド溶液または1X PBSを加えて湿らせた状態に保ちますが、スライドを液体に浸しないでください。 </li></ol></li><li> 洗濯およびブロッキング。 <ol><li>ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを注意深く取り除きます。 60℃で0.1×生理食塩水（SSC）中で30分間スライドを2回洗浄する。 注：洗浄とは、スライドホルダーにスライドを入れ、プラスチック容器に入れ、ロッカーでゆっくりかき混ぜることです（約50 rpm、 図2 ）。 </li><li>スライドを30秒間、1×トリス緩衝食塩水（TBS）ですすいでください。 </li><li>各スライド上の0.03％Triton X-100を添加したTBS中の1％ブロッキング試薬1mLを加え、30分間インキュベートする。次に、ブロッキング溶液を捨てる。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学。 <ol><li>色素産生検出のために、TBS中のブロッキング試薬を使用して、750単位（U）/ mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗生物質1.5U / mLのAP溶液に希釈する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP溶液を加える。 </li><li> TSA検出のために、750U / mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗体および抗ビオチンストレプトアビジンHRP結合抗体をAP / HRP溶液に希釈するために、TBS中のブロッキング試薬を使用する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP / HRP溶液を加える。 </li><li>スライドを湿った箱（ 図2 ）にインキュベートし、37℃で60分間インキュベートする。ホルムアルデヒド溶液または1X PBSを使用して、箱をしっとりとした状態に保ちます。 </li></ol></li></ol> 5.染色<ol><li>カバーガラスを注意深く取り外します。 0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。スライドをDAP緩衝液（色素生成検出：pH9.5; TSA検出：pH8.0）で5分間すすぐ。 </li><li> 染色（発色検出） <ol><li> 100μLのNBT（375μg/ mL）/ BCIP（188μg/ mL）基質溶液（DAPで希釈;pH 9.5）を各スライドに添加した。カバーガラス（24 x 50 mm）を注意深くスライドに置きます。 </li><li>スライドを、基質溶液を含む湿った箱に10分間インキュベートする（37℃でO / N）。 注：スライドを顕微鏡で随時見ることで開発を確認してください。 </li><li>展開が完了したら、スライドを水に移すことによって反応を停止する。 </li></ol></li><li> 染色（TSA検出） <ol><li>シリンジフィルター（0.22μm; 図2 ）からHNPP（100μg/ mL）/ Fast Red（250μg/ mL）基質を移動するためにシリンジを使用してください。 </li><li>カバースリップ（24×50mm）で覆われたスライドあたり100μLのHNPP / Fast Red基質を加える。 RTでHNPP / Fast Red基質と30分間スライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1X TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li><li> 100μLのTSA基質/被覆（24×50mm 2 ）スライド。室温で10分間、TSA基質とスライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li></ol></li><li> PBS /グリセロール（1：3）にスライドを埋め込みます。 注：これらの手順を完了した後、蛍光シグナルが急速に消光するため、スライドをできるだけ早く観察する必要があります。 </li></ol> 6.観測<ol><li> クロモジェニック検出 <ol><li>組織切片を光学顕微鏡で観察する。 10X、20X、40Xの対物レンズを選択して、発色検出の結果を観察します。 </li><li> DP-BSWソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li><li> TSA検出 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて組織切片を観察する。 DIG標識遺伝子は543nmの光下で観察され、赤色を呈し、ビオチン標識遺伝子は488nm光下で観察され、緑色を呈する。彼らが出現すると、彼らは黄色を呈する。 </li><li> 20Xと40Xの対物レンズを選択して、それぞれTSA検出の結果を観察します。 </li><li> FV1000ソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li></ol>

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Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

著者は開示すべき事項やその他の利益相反はありません。

ORCO以外のOR遺伝子の発現レベルが非常に低く、昆虫アンテナの組織学的スライスを保存することが非常に困難であるため、昆虫のアンテナでOR遺伝子を局在化するRNA ISHを行うことは困難である。さらに、TSAの検出も非常に難しいです。これらの問題に対処するには、以下の措置を講じる必要があります。アンテナは、スライド上に形態を維持する薄く柔らかい触角鞘を有する新しく成...

最も重要な化学感覚器官である昆虫のアンテナは、嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって神経支配されている多くの髪のような構造（感覚器と呼ばれる）で覆われています。昆虫ORN類の膜上に、嗅覚受容体（ORS）、7つの膜貫通領域を含むタンパク質の種類は、臭気物質依存性イオンチャネル1、2、3として機能するヘテロマーを形成する共受容体（ORCO）で表されます。異なる論理和は、化学化合物4、5、6の異なる組み合わせに応答します。 Locusts（ Locusta migratoria ）は、主に嗅覚の手掛かりに基づいて重要な行動を誘発します7 。 Locust ORは、分子嗅メカニズムを理解するための重要な要素です。特定のイナゴまたは遺伝子をaのニューロンに局在化させるRNAによる形態特異的な感覚型RNA in situハイブリダイゼーション（RNA ISH）は、ORs機能の探索の第一歩である。 RNA ISHは、標識された相補的RNAプローブを使用して、組織、細胞または全身の部位の特定のRNA配列をインサイチュで測定し、局在化させ、生理学的プロセスおよび疾患の病因への洞察を提供する。ジゴキシゲニン標識（DIG標識）およびビオチン標識RNAプローブは、RNAハイブリダイゼーションにおいて広く使用されている。ジゴキシゲニン-11-UTPまたはビオチン-16-UTPによるRNA標識は、SP6およびT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって調製することができる。 DIGおよびビオチン標識RNAプローブは以下の利点を有する：非放射性;安全;安定した;高感度;非常に特異的。 PCRおよびインビトロ転写を使用して産生が容易である。 DIGおよびビオチン標識されたRNAプローブは、色原体および蛍光で検出することができます。 DIG標識されたRNAプローブは、抗ジゴキシゲニンアルカリ高感度化学発光基質ニトロブルーテトラゾリウムクロライド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェートトルイジン塩（NBT / BCIP）、または光学顕微鏡を使用して2つの視覚化できるホスファターゼ（AP）共存顕微鏡を用いて4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ - 塩化亜鉛塩（ファストレッド）とカップリングした4-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2&#39;-フェニルアニリドリン酸塩（HNPP）ビオチン標識RNAプローブは、共焦点顕微鏡を使用してフルオレセイン - チラミドで視覚化することができる抗ビオチンストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） - コンジュゲート抗体で検出することができる。したがって、二色蛍光in situハイブリダイゼーションを実施して、DIGおよびビオチン標識RNAプローブを用いて、1つのスライス中の2つの標的遺伝子を検出することができる。 DIGおよび/またはビオチン標識プローブを用いたRNA ISHは、嗅覚関連遺伝子、例えばOR 、イオノトロピック受容体、匂い物質結合タンパク質感覚ニューロン膜タンパク質、 キイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、L.のmigratoriaと砂漠バッタSchistoceraグレガリア 8、9、10、11、12、13、14、15、16、これらに限定され昆虫のアンテナではなく、です。 （1）OR遺伝子（ ORcoを除く）が低レベルで、少数の細胞でのみ発現され、シグナル検出を非常に困難にし、（2）昆虫組織を保存するためのRNA ISHを行う際に、2つの大きな課題がある。形態学が保存され、背景雑音が低いような組織学は、困難であり得る。この論文では、昆虫におけるOR遺伝子の局在化のためのRNA ISHを説明する詳細で効果的なプロトコル発色およびTyramide Signal Amplification（TSA）検出の両方を含むアンテナが提示されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215;TSINGKETM Master Mix</td>
			<td>TSINGKE, China</td>
			<td>TSE004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free H2O</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>RT121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGULAR AGAROSE G-10</td>
			<td>BIOWEST, SPAIN</td>
			<td>91622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T Vector</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>A362A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>M180A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>CB101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>A-6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Inalco, USA</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>SBS Genetech, China</td>
			<td>GX1-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nco I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spe I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0133M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11685597910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10012718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10009257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td>
			<td>FISH0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>80070591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0777-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>0.04mol/L Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td>0.12%acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>03677</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>WISENT ING, Canada</td>
			<td>800-010-CG</td>
			<td>15g/L Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>8.5%NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900041-500G</td>
			<td>14mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900268-500G</td>
			<td>80mM Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>1M Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>1.5M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>100mM Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>100mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900020-500G</td>
			<td>50mM MgCl2&#183;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>3M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900095-500G</td>
			<td>0.3M Na-Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900894-100G</td>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>0.1M NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>80mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td>120mM Na2CO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1% Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0694-500ML</td>
			<td>0.03% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1&#215;Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D8906-50G</td>
			<td>10% dextran sulphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>invitrogen, USA</td>
			<td>AM7119</td>
			<td>20 &#181;g/ml yeast t-RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D3159-10G</td>
			<td>0.2 mg/ml herring sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate (10mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>2% fluorescein-tyramides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>Amplification Diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>Jung CM300 cryostat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>NANODROP 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus IX71microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus BX45 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

昆虫は、外因性の化学信号を感知するための洗練された嗅覚受容系を進化させてきた。これらの化学シグナルは、アンテナのケモソーム（chemosensilla）と呼ばれる髪のような構造に収容された嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって形質導入される。 ORNの膜上で、嗅覚受容器（OR）は匂いのコード化に関与していると考えられている。したがって、OR遺伝子に局在する遺伝子を同定できることは、OR遺伝子を認識するために必要であり、さらなる機能的in situ研究の基礎を提供する。昆虫のアンテナにおける特定のORのRNA発現レベルは非常に低く、組織学的に昆虫組織を保存することは困難である。したがって、RNA in situハイブリダイゼーションを使用して特定タイプの感覚器にORを局在化することは困難である。この論文では、特に昆虫の低発現OR遺伝子のための詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコールが導入されている。さらに、特定のOR 遺伝子WAOrcoをマーカーとして共発現する受容体遺伝子を用いた二重蛍光蛍光in situハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定された。

色素産生の検出では、すべての成人の触角部分における触角細胞の小さなサブセットを、DIG標識LmigOR1およびLmigOR2アンチセンスプローブで示した（ 図3 ）。 LmigOR1とLmigOR2を局在化するために連続切片上のRNA ISHは、二つの遺伝子を発現する触角細胞が推定LmigOR1とLmigOR2が実際ORN類（ 図4aの</str...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K ビュー.  China Agricultural University. この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。 

ビデオ: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

神経科学

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在

要約

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この動画の章

二重蛍光その場でハイブリダイゼーション

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

ダブル蛍光を組み合わせます

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在

要約

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二重蛍光その場でハイブリダイゼーション

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

ダブル蛍光を組み合わせます

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ