Name: localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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Questo lavoro è supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation della Cina (No.31472037). La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali in questo articolo è esclusivamente ai fini di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni.

NOTA: per limitare il degrado del RNA, preparare le soluzioni utilizzando acqua distillata autoclavata a umido (a 121 ° C per 60 min) e anche materiali autoclave a umido. 1. Preparazione di RNA ISH Antisense e Sense Probes <ol><li> Amplificazione e purificazione del gene target <ol><li> Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti. <ol><li> Utilizzare un volume di reazione di 100 μL, contenente 50 μL di miscela di reazione 2x, 4 μl di ciascuno dei sensori di senso e antisenso ( Tabella 1 ), 1 μL di plasmide template e 41 μL di H 2 O senza RNasi. Utilizzare il seguente PCR Protocollo: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, Seguita da 72 ° C per 10 min. </li><li> Ripetere questi passaggi per produrre il frammento a doppio filamento di 1,303 bp di LmigOR2 (GenBank: JQ766966) e 1,251 bp frammento a doppio filamento di LmigORco (GenBank: JN989549). I primer utilizzati in questi esperimenti sono presentati nella Tabella 1 . </li><li> Eseguire i prodotti PCR su gel agarosio dell&#39;1,2% in tampone 1x Tris-acetato-EDTA e visualizzare utilizzando la colorazione del bromuro di etidio. </li></ol></li><li> Estrarre questi prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel. <ol><li> Dopo l&#39;elettroforesi, inserire le fasce di DNA di accisa dal gel e inserire le fette di gel in un tubo da 1,5 mL. Quindi aggiungere 100 μl di buffer di legame (Buffer PN) per 0,1 g di fetta di gel. Vorticali e incubare a 50 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolta. </li><li> Inserire una colonna di adsorbimento CA2 nel tubo di raccolta e aggiungere 500 μL di buffer di bilanciamento (Buffer BL). Ciò migliora la capacità di assorbimento e la stabilità della membrana di silice. CentriSi muove a 12.400 xg per 1 min. </li><li> Trasferire la miscela di gel dissolta al gruppo di colonna di adsorbimento e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Poi, centrifuga i tubi a 12.400 xg per 1 min. Scartare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere due volte 600 μL di soluzione di lavaggio (aggiunta di etanolo, Tampone PW). Centrifugare a 12.400 xg per 1 min. Eliminare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta. </li><li> Svuotare il tubo di raccolta e recuperare nuovamente la colonna a 12.400 xg per 2 minuti per consentire l&#39;evaporazione di qualsiasi etanolo residuo. </li><li> Trasferire con cautela la colonna di adsorbimento in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Asciugare a pellet il pellet per 5-10 min e ricollegare il DNA in un volume adatto ( ad esempio, 30 μL) di acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare a RT per 2 min. Centrifugare a 12.400 xg per 2 min. Scartare la colonna di adsorbimento e memorizzare il DNA a 4 ° C o -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Costruire i plasmidi ricombinanti <ol><li> Individualmente lega il frammento di 387 bp di LmigOR1 , frammento di 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco in un vettore T che contiene promotori per polimerasi RNA a T7 (a monte) e SP6 (a valle) adiacenti al DNA inserito usando ligasi del DNA di T4. Preparare la seguente 10 μL di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di T vettore, 3 μL (~100 ng) del DNA del gene inserito e 1 μl di T4 ligasi DNA e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 5 μl di ciascun plasmide ricombinante contenente il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco separatamente in 50 μl di competenti Escherichia coli DH5α in tubi sterili da 1,5 ml. <ol><li> Mescolare delicatamente e mettere i tubi in ghiaccio per 30 minuti e poi incubarli per 90 s a 42° C. Trasferirli nuovamente in ghiaccio per 3 minuti. </li><li> Aggiungere a ciascun tubo 450 μl di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) senza ampicillina e incubarli in un agitatore a 150 giri / min per 1 h a 37 ° C per ripristinare l&#39; E. coli DH5α. </li><li> Prendere un&#39;aliquota di 100 μl di ciascun trasformante e utilizzarle per inoculare le lastre di substrato solido di LB contenenti ampicillina da 50 μg / ml, 24 μg / mL isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 40 μg / ml 5-bromo-4 -chloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal). </li><li> Incubare queste piastre in un incubatore costante a 37 ° C per 18 h. Schermate i plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando il metodo di screening blu-bianco. Sequenza dei plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando sequenziamento di Sanger e identificazione delle direzioni di inserto di tre geni OR. </li></ol></li></ol></li><li> Selezionare endonucleasi di restrizione per linearizzare i plasmidi ricombinanti <ol><li> Usare endonucleasi di restrizione tIl cappello non solo digerisce nel sito di clonazione multiplo del vettore ma anche non taglia il DNA dell&#39;inserto. In questo esperimento, tutti i 3 geni vengono inseriti nel vettore T nella direzione corrispondente a quella del vettore. </li><li> Utilizzare l&#39;endonucleasi di restrizione Nco I per linearizzare i plasmidi ricombinanti contenenti il ​​frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco per produrre le sonde antisenso. Utilizzare l&#39;endonucleasi di restrizione Sp e I per produrre le sonde di sensazione. NOTA: Se la direzione dell&#39;inserto corrisponde a quella del vettore, viene selezionato un sito di restrizione univoco dalla fine di T7 per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Un sito unico di restrizione dalla fine dello SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda di sensazione. Altrimenti, se la direzione dell&#39;inserto non corrisponde a tLa direzione del vettore, quindi un sito unico di restrizione dalla fine di SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Il sito unico di restrizione dalla fine di T7 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda di senso. </li></ol></li><li> Purificando i plasmidi ricombinanti linearizzati <ol><li> Digest 20 μg ciascuno dei tre plasmidi ricombinanti contenenti il ​​387 bp frammento di LmigOR1 , 1,303 bp frammento di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco utilizzando l&#39;endonucleasi restriction Nco I in una reazione di 100 μl che contiene 10 μL di tampone 10x, 40 μL di 0,5 μg / μl di plasmide, 3 μL di Nco I e 47 μl di H 2 O senza RNasi, seguita da un&#39;incubazione di 3 ore a 37 ° C. </li><li> Allo stesso modo, digerire 20 μg di ciascuno di questi tre plasmidi ricombinanti uCantare l&#39;endonucleasi di restrizione Spe I. </li><li> Purificare questi plasmidi digeriti usando un kit di estrazione del gel come descritto in 1.1.2. Determinare le concentrazioni di questi plasmidi ricombinanti linearizzati estratti mediante spettrofotometria e regolare a 0,5 μg / μL. </li></ol></li><li> Preparare antisenso e sonde sensoriali <ol><li> Utilizzare il sistema di trascrizione RNA T7 / SP6 per generare sonde antisenso e sensori. La polimerasi RNA SP6 è usata per trascrivere RNA a doppio filamento per le sonde antisense DIG e biotina per questi tre geni OR utilizzando plasmidi ricombinanti linearizzati come modelli in vitro . La polimerasi RNA T7 viene utilizzata per produrre sonde di senso. Eseguire la reazione in un volume finale di 20 μl, contenente 2 μL di 10 volte NTP mix, 2 μL di 10X buffer di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi, 2 μL di T7 o SP6 RNA polimerasi, 4 μL di 0,5 μg / μl di plasmidi linearizzati e 9 μL H 2 O senza RNasi, seguitiDa un incubo di 3 ore a 37 ° C. </li><li> Incubare le sonde antisense e sensori con DIG e biotina per 30 min con 1 μl DNasi a 37 ° C. Aggiungere 2,5 μL di 5 M LiCl e 75 μl di etanolo assoluto, quindi incubare le reazioni per 30 minuti a -70 ° C. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Decanta con cautela il surnatante. Aggiungere 150 μl di etanolo al 70% per lavare il precipitante. Preparare l&#39;etanolo al 70% (1 L) aggiungendo l&#39;etanolo al 95% (736.8 mL) in acqua distillata sterile (263.2 mL). </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C e asciugare in aria il pellet per 5-10 min a RT. Aggiungere 25 μL di H 2 O senza RNasi per sciogliere le sonde antisense e sensori RNA. </li><li> Se la lunghezza del gene inserito è più lunga di 1 kb, successivamente frammenti di RNA antisenso e sensori a una lunghezza media di ~ 300 bp per incubazione in soluzioni di tampone bicarbonato-carbonato. Eseguire la reazione in un volume finale di 50 μL, cCon 25 μL di sonda RNA e 25 μL di soluzione tampone bicarbonato-carbonato (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) a 60 ° C. Il tempo di idrolisi richiesto è dato da una formula pubblicata in precedenza 17 . </li><li> Aggiungere 5 μl di 10% di acido acetico per fermare la reazione. In questo esperimento, frammentare i LmigOR2 e LmigORco antisense e sonde di sensazione per 24 e 23 minuti, rispettivamente. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = lunghezza iniziale del frammento in ca. L f = lunghezza del frammento finale in ca. K = la costante di velocità per l&#39;idrolisi, circa 0,11 kb -1 min -1 T = tempo di idrolisi in min </li><li> Infine, aggiungere 250 μl di tampone di ibridazione e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle Sezioni del Cryostat <ol><li> Precool il freeziNg del microtomo a -24 ° C. </li><li> Selezionare le nuove locuste di adulazione adulta che sono attive e che hanno antenne intatte. Tagliare le antenne in pezzi da 2-3 mm utilizzando i rasoi sterili. </li><li> Mettere il composto OCT su un supporto di microtomo congelante e mettere uno o due campioni sul composto orizzontalmente. Quindi, trasferire il supporto nel microtomo a congelamento a -24 ° C per equilibrare fino a quando il composto si blocca. Estrarre il supporto e coprire i campioni con un piccolo composto. Trasferire il titolare nel microtomo di congelamento a -24 ° C per almeno 10 minuti ( Figura 1 ). NOTA: Evitare di ottenere bolle nel composto. </li><li> Fissare il supporto con i campioni nel microtomo di congelamento, quindi dividere i campioni congelati in fette di 12 μm a -24 ° C. </li><li> Fissare le fette uno ad uno su diapositive (25 x 75 mm, senza nucleasi) e asciugare all&#39;aria per 10 min. </li></ol> 3. Sezioni di fissaggio <ol><li> Dopo aver preparato il criostatoMettere le diapositive in un contenitore di plastica (~ 100 x 40 x 80 mm) e fissare i tessuti incubando le diapositive in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le diapositive in 1X saline fosfato-bufferizzato (PBS) per 1 minuto. </li><li> Per eliminare le proteine ​​alcaline, trasferire le diapositive a 0,2 M HCl per 10 minuti. </li><li> Per eliminare la proteina superficiale dell&#39;acido nucleico, trasferire le diapositive a 1XPBS con 1% di Triton X-100 per 2 min. </li><li> Lavare le diapositive due volte per 30 s in 1x PBS. </li><li> Infine, sciacquare le diapositive in soluzione formamide per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Preparare le sonde antisenso e sensore <ol><li> Utilizzare un tampone di ibridazione per diluire le sonde di antisense o sensori di RNA nei tubi da 1,5 mL senza nucleasi. In questo esperimento, per tutte le sonde antisense e sensori ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), aggiungere 1 μL di sonda a 99 μL buffer di ibridazione per diapositiva. Generalmente, l&#39;uso di diluizioni 1: 100 di sonde antisenso produce significativi segnali positivi e bassi sfondi utilizzando questo protocollo. </li><li> Per il rilevamento cromogenico, provvedere a diluire singolarmente le sonde DIG-etichettate. </li><li> Per il rilevamento TSA, diluire DIG marcato LmigOR1 con sonde LmigOrco marcati con biotina o DIG marcato LmigOR2 con biotina marcata LmigOR1 sonde insieme nel tampone di ibridazione. </li><li> Scaldare le diluizioni per 10 minuti a 65 ° C e metterle in ghiaccio per almeno 5 min. </li></ol></li><li> ibridazione <ol><li> Scolare le diapositive e aggiungere 100 μL di sonde antisense e sensori diluiti (fase 4.1) alle sezioni del tessuto. Quindi, posizionare le copertine (24 mm x 50 mm, senza nucleasi) sulle sezioni del tessuto. </li><li> Posizionare i vetri coperti orizzontalmente in una scatola umida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; figura 2 ) e incubare unaT 55 ° C per 22 ore. Aggiungere una soluzione di formamide o 1X PBS al fondo della scatola per mantenere l&#39;ambiente umido, ma non immergere le diapositive nel liquido. </li></ol></li><li> Lavaggio e blocco. <ol><li> Dopo l&#39;ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C. NOTA: Lavatrice significa mettere le diapositive in un supporto di scorrimento che viene poi posizionato in un contenitore di plastica e agitato leggermente su un bilanciere (~ 50 rpm; Figura 2 ). </li><li> Sciacquare le diapositive in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) per 30 s. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di blocco dell&#39;1% in TBS completato con 0,03% di Triton X-100 su ciascuna diapositiva e incubare per 30 min. Quindi, scartare la soluzione di blocco. </li></ol></li><li> Immunoistochimica. <ol><li> Per il rilevamento cromogenico, utilizzare il reagente di bloccaggio in TBS per diluire 750 unità (U) / mL anti-digoxigenina AP-coniugato antiboDa due a 1,5 U / ml soluzione AP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP per scivolo coperto (24 mm x 50 mm). </li><li> Per la rilevazione di TSA, utilizzare il reagente bloccante in TBS per diluire 750 U / mL di anticorpi anti-digoxigenin AP coniugati e anti-biotina streptavidina HRP-coniugata contro la soluzione AP / HRP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP / HRP per uno scivolo coperto (24 mm x 50 mm). </li><li> Incubare le diapositive in una scatola umida ( Figura 2 ) per 60 minuti a 37 ° C. Utilizzare la soluzione formamide o 1X PBS per mantenere la scatola umida ma non soglia. </li></ol></li></ol> 5. Colorazione <ol><li> Rimuovere con attenzione i coperchietti. Lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS integrato con 0,05% di Tween-20. Sciacquare le diapositive in DAP-buffer (rilevazione cromogena: pH 9,5; rilevazione TSA: pH 8,0) per 5 min. </li><li> Colorazione (rilevazione cromogena) <ol><li> Aggiungere 100 μL di soluzione NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) di substrato (diluito in DAP;PH 9,5) a ogni diapositiva. Posizionare con attenzione i coperchi (24 x 50 mm) sulle diapositive. </li><li> Incubare le diapositive in una scatola umida con soluzione di substrato per 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Controllare lo sviluppo guardando le diapositive di tanto in tanto sotto il microscopio. </li><li> Quando lo sviluppo è pronto, arrestare la reazione trasferendo le diapositive in acqua. </li></ol></li><li> Colorazione (rilevazione TSA) <ol><li> Utilizzare una siringa per spostare il substrato HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) dal filtro della siringa (0,22 μm; Figura 2 ). </li><li> Aggiungere 100 μL di substrato HNPP / Fast Red per diapositiva ricoperta da una copertura (24 x 50 mm). Incubare le diapositive per 30 min con substrato HNPP / Fast Red a RT. </li><li> Rimuovere con cura i vetrini e lavare le diapositive tre volte per 5 minuti in 1X TBS integrato con 0,05% di Tween-20. </li><li> Utilizzare 100 μl di substrato TSA / coperto (24 x 50 mm 2 ) scorrevole. Incubare le diapositive con substrato TSA per 10 minuti a RT. </li><li> Rimuovere le copertine con cura e lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS con 0,05% di Tween-20. </li></ol></li><li> Incorporare le diapositive in PBS / glicerolo (1: 3). NOTA: Dopo aver terminato queste procedure, le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché il segnale fluorescente si spegnerà rapidamente. </li></ol> 6. Osservazione <ol><li> Rilevamento cromogeno <ol><li> Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio ottico. Scegli le lenti obiettivo 10X, 20X e 40X per osservare i risultati del rilevamento cromogeno. </li><li> Utilizzare il software DP-BSW per analizzare i risultati e acquisire le immagini. </li></ol></li><li> Rilevamento TSA <ol><li> Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio confocale. I geni con etichetta DIG devono essere osservati sotto la luce di 543 nm, presentando un colore rosso e i geni biotinici devono essereOsservata sotto la luce di 488 nm, presentante un colore verde. Quando emergono, presentano il colore giallo. </li><li> Scegli le lenti obiettivo 20X e 40X per osservare rispettivamente i risultati del rilevamento TSA. </li><li> Utilizzare il software FV1000 per analizzare i risultati e acquisire le immagini. </li></ol></li></ol>

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C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da divulgare né altri conflitti di interesse.

È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfo...

Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell&#39;orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico 1 , 2 , 3 . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici 4 , 5 , 6 . Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti 7 . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR. RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L&#39;etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l&#39;ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina. RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine ​​della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% acetic acid</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bacteriological Grade</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris buffered saline</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% dextran sulphate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL yeast t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL herring sperm DNA</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td></td><td></td><td>Detection Buffer</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% fluorescein-tyramides</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Jung CM300 cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus BX45 confocal microscope</td><td></td></tr></tbody></table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l&#39;istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l&#39;ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.

Con rilevazione cromogenica, un piccolo sottoinsieme delle cellule antenne in ogni sezione antenne adulta è stato indicato con le sonde antisense LmigOR1 e LmigOR2 ( Figura 3 ) con DIG. RNA ISH su sezioni consecutive per localizzare LmigOR1 e LmigOR2 ha mostrato che le cellule antennali che esprimono i due geni si trovavano nei cluster ORN che esprimevano LmigORco , indicando che il putativo LmigOR1 e <e...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell&#39;Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K Views.  China Agricultural University.  Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina. 

Video: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Neuroscienze

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Biologia dello sviluppo

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

Utilizzando Insetto Electroantennogram sensori sul robot autonomi per le ricerche olfattive

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

Drone bioidro ibrido per il rilevamento degli odori basato sull'elettroantenografia che utilizza le antenne Silkmoth per la localizzazione della fonte di odore

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

Ingegneria

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Utilizzando Sensillum singolo controllo per rilevare olfattiva Neuron Risposte di cimici a semiochimici

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Sensillum singole registrazioni per Locust Palp sensilli Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

<meta charset="utf8"></head><body>Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell'antenna di Locust da RNA

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l'attività neurale nel Locust (