Diese Arbeit wird durch einen Stipendium der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.31472037) unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und bedeutet keine Empfehlung.

HINWEIS: Zur Begrenzung des RNA-Abbaus werden Lösungen mit nass-autoklaviertem destilliertem Wasser (bei 121 ° C für 60 min) und auch Nass-Autoklaven-Materialien hergestellt. 1. Herstellung von RNA ISH Antisense und Sense Sonden <ol><li> Ziel-Gen-Amplifikation und -Reinigung <ol><li> Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren. <ol><li> Verwenden Sie ein 100 μl Endreaktionsvolumen, das 50 μl 2x Reaktionsmischung enthält, jeweils 4 μl Sense- und Antisense-Primer ( Tabelle 1 ), 1 μl Plasmid-Matrize und 41 μl RNase-freies H 2 O. Verwenden Sie die folgende PCR Protokoll: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, Gefolgt von 72 ° C für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte, um das 1,303 bp doppelsträngige Fragment von LmigOR2 (GenBank: JQ766966) und 1,251 bp doppelsträngiges Fragment von LmigORco (GenBank: JN989549) zu produzieren. Die in diesen Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt . </li><li> Führen Sie PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegele in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer und visualisieren Sie mit Ethidiumbromid-Färbung. </li></ol></li><li> Extrahieren Sie diese PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktions-Kit. <ol><li> Nach der Elektrophorese verbannen Sie die DNA-Banden aus dem Gel und legen die Gelscheiben in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann werden 100 μl Bindungspuffer (Puffer PN) pro 0,1 g Gelscheibe zugegeben. Vortex und inkubieren bei 50 ° C, bis die Gelscheibe vollständig aufgelöst ist. </li><li> Setzen Sie eine CA2-Adsorptionskolonne in das Sammelröhrchen ein und fügen Sie 500 μl Restpuffer (Puffer BL) hinzu. Dies verbessert die Absorptionsfähigkeit und Stabilität der Silicamembran. CentriFuge bei 12.400 xg für 1 min. </li><li> Das gelierte Gelgemisch wird in die Adsorptionskolonnenanordnung überführt und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Dann werden die Zentrifugenröhrchen bei 12.400 xg für 1 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Füge 600 μl Waschlösung (Ethanol zugesetzt, Puffer PW) zweimal hinzu. Zentrifuge bei 12.400 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Das Sammelröhrchen entleeren und die Säulenanordnung bei 12.400 xg für 2 min zentrifugieren, um ein Verdampfen von restlichem Ethanol zu ermöglichen. </li><li> Die Adsorptionskolonne sorgfältig auf ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Das Pellet für 5-10 min trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen ( z. B. 30 &amp; mgr; l) nukleasefreies Wasser auflösen. </li><li> Inkubieren bei RT für 2 min. Zentrifuge bei 12.400 xg für 2 min. Die Adsorptionskolonne entsorgen und die DNA bei 4 ° C oder -20 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol></li><li> Konstruieren Sie die rekombinanten Plasmide <ol><li> Individuell das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco in einen T-Vektor ligieren , der Promotoren für T7 (Upstream) und SP6 (stromabwärts) RNA-Polymerasen neben der insertierten DNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase enthält. Bereiten Sie die folgende 10 &amp; mgr; l-Reaktion vor: 5 &amp; mgr; l 2x Ligationspuffer, 1 &amp; mgr; l T-Vektor, 3 &amp; mgr; l (~ 100 ng) der DNA des insertierten Gens und 1 &amp; mgr; l T4-DNA-Ligase und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Füge 5 μl jedes rekombinanten Plasmids hinzu, das das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco getrennt in 50 μl kompetente Escherichia coli DH5α Zellen in sterilen 1,5 mL Röhrchen enthält. <ol><li> Mischen Sie sanft und legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in Eis und dann inkubieren sie für 90 s bei 42° C Übertragen Sie sie für 3 min in Eis zurück. </li><li> Füge 450 &amp; mgr; l Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium ohne Ampicillin zu jedem Röhrchen hinzu und inkubiere sie in einem Schüttler bei 150 U / min für 1 h bei 37 ° C, um das E. coli DH5 &amp; agr; wiederherzustellen. </li><li> Nehmen Sie ein 100 &amp; mgr; l Aliquot jeder Transformante und verwenden Sie sie, um LB-feste Substratplatten, die 50 &amp; mgr; g / ml Ampicillin, 24 &amp; mgr; g / ml Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 &amp; mgr; g / ml 5-Brom-4 enthalten, zu inokulieren -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal). </li><li> Diese Platten in einem konstanten Inkubator bei 37 ° C für 18 h inkubieren. Screening der Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung der blau-weißen Screening-Methode. Sequenzieren Sie die Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung und identifizieren die Insertionsrichtungen der drei ODER-Gene. </li></ol></li></ol></li><li> Wählen Sie Restriktionsendonukleasen, um rekombinante Plasmide zu linearisieren <ol><li> Verwenden Sie Restriktionsendonukleasen tHabe nicht nur in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors verdauen, sondern auch die Insert-DNA nicht schneiden. In diesem Experiment werden alle 3 Gene in den T-Vektor in der Richtung eingefügt, die der des Vektors entspricht. </li><li> Verwenden Sie die NcoI- Restriktionsendonuklease, um die rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, zu linearisieren , um die Antisense-Sonden zu erzeugen. Verwenden Sie Sp e I Restriktionsendonuklease, um die Sense-Sonden zu erzeugen. HINWEIS: Wenn die Insertionsrichtung dem des Vektors entspricht, wird eine eindeutige Restriktionsstelle vom Ende von T7 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. Ansonsten, wenn die Einsteckrichtung nicht mit t übereinstimmtDie Richtung des Vektors, dann wird eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Die einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von T7 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. </li></ol></li><li> Reinigen der linearisierten rekombinanten Plasmide <ol><li> 20 μg jedes der drei rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, unter Verwendung der NcoI- Restriktionsendonuklease in einer 100 &amp; mgr; l-Reaktion, die 10 &amp; mgr; l 10 × Puffer, 40 &amp; mgr; l enthält, 0,5 μg / μl Plasmid, 3 μl Nco I und 47 μl RNase-freies H 2 O, gefolgt von einer 3- stündigen Inkubation bei 37 ° C. </li><li> In ähnlicher Weise werden 20 &amp; mgr; g von jedem dieser drei rekombinanten Plasmide uSinge die Spe I-Restriktionsendonuklease. </li><li> Diese verdauten Plasmide werden unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits, wie in 1.1.2 beschrieben, gereinigt. Bestimmen Sie die Konzentrationen dieser extrahierten linearisierten rekombinanten Plasmide durch Spektrophotometrie und stellen Sie sie auf 0,5 μg / μL ein. </li></ol></li><li> Antisense und Sense Sonden vorbereiten <ol><li> Verwenden Sie das T7 / SP6-RNA-Transkriptionssystem, um Antisense- und Sense-Sonden zu erzeugen. SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um doppelsträngige RNA für DIG- und Biotin-markierte Antisense-Sonden für diese drei ODER-Gene unter Verwendung linearisierter rekombinanter Plasmide als Matrizen in vitro zu transkribieren. Die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung von Messsonden verwendet. Die Reaktion in einem 20 &amp; mgr; l Endvolumen, enthaltend 2 &amp; mgr; l 10 × NTP-Mischung, 2 &amp; mgr; l 10X Transkriptionspuffer, 1 &amp; mgr; l RNase-Inhibitor, 2 &amp; mgr; l T7 oder SP6-RNA-Polymerase, 4 &amp; mgr; l 0,5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l linearisiertes Plasmid und 9 &amp; mgr; l RNase-freies H 2 O, gefolgt vonDurch eine 3-stündige Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Inkubieren Sie die DIG- und Biotin-markierten Antisense- und Sense-Sonden für 30 min mit 1 μl DNase bei 37 ° C. Zugabe von 2,5 μl 5 M LiCl und 75 μl absolutem Ethanol, dann inkubieren die Reaktionen für 30 min bei -70 ° C. </li><li> Zentrifugieren bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig dekantieren. Füge 150 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das Fällungsmittel zu waschen. Das 70% ige Ethanol (1 l) wird durch Zugabe von 95% Ethanol (736,8 ml) zu sterilem destilliertem Wasser (263,2 ml) hergestellt. </li><li> Bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C erneut zentrifugieren und das Pellet für 5-10 min bei RT lufttrocknen. Füge 25 μl RNase-freies H 2 O hinzu, um die RNA-Antisense- und Sense-Sonden aufzulösen. </li><li> Wenn die Länge des eingefügten Gens länger als 1 kb ist, dann Fragment RNA antisense und Sense-Sonden auf eine durchschnittliche Länge von ~ 300 bp durch Inkubation in einer Bicarbonat-Carbonat-Puffer-Lösungen. Die Reaktion in einem 50 μl Endvolumen durchführen, cWobei 25 &amp; mgr; l der RNA-Sonde und 25 &amp; mgr; l der Bicarbonat-Carbonat-Pufferlösung (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) bei 60 ° C erhalten wurden. Die erforderliche Hydrolysezeit wird durch eine zuvor veröffentlichte Formel 17 gegeben . </li><li> Füge 5 μl 10% ige Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen. In diesem Experiment, Fragment der LmigOR2 und LmigORco Antisense und Sense Sonden für 24 und 23 min, respectively. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = die Anfangsfragmentlängen in kb L f = die endgültigen Fragmentlängen in kb K = die Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse, etwa 0,11 kb -1 min -1 T = die Hydrolysezeit in min </li><li> Schließlich werden 250 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und bei -80 ° C aufbewahrt. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Kryostatabschnitte <ol><li> Precool die FreeziNg Mikrotom auf -24 ° C. </li><li> Wählen Sie neue, heutzutage erwachsene Heuschrecken, die aktiv sind und intakte Antennen haben. Schneiden Sie die Antennen in 2-3 mm Stücke mit sterilen Rasiermesser. </li><li> Setzen Sie OCT-Verbindung auf einen gefrierenden Mikrotom-Halter und legen Sie ein oder zwei Proben auf die Verbindung horizontal. Dann den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C überführen, um zu äquilibrieren, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit einer kleinen Verbindung. Übertragen Sie den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C für mindestens 10 min ( Abbildung 1 ). HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen in der Verbindung zu bekommen. </li><li> Fixieren Sie den Halter mit den Proben in das Gefriermikrotom, und schneiden Sie dann die gefrorenen Proben in 12 μm dicke Scheiben bei -24 ° C. </li><li> Tauen Sie die Scheiben eins nach dem anderen auf die Rutschen (25 x 75 mm, nukleasefrei) und die Luft trocknen für 10 min. </li></ol> 3. Befestigung Sektionen <ol><li> Nach der Vorbereitung Kryostat(~ 100 x 40 x 80 mm) und fixieren die Gewebe durch Inkubieren der Objektträger in 4% Paraformaldehydlösung (PFA) für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Objektträger in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min. </li><li> Um die alkalischen Proteine ​​zu eliminieren, werden die Objektträger für 10 min auf 0,2 M HCl übertragen. </li><li> Um das Oberflächenprotein von Nukleinsäure zu eliminieren, transferieren Sie die Objektträger auf 1XPBS mit 1% Triton X-100 für 2 min. </li><li> Waschen Sie die Folien zweimal für 30 s in 1x PBS. </li><li> Schließlich spülen Sie die Objektträger in Formamidlösung für 10 min bei 4 ° C ab. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie die Antisense- und Sense-Sonden vor <ol><li> Verwenden Sie Hybridisierungspuffer, um RNA-Antisense- oder Sense-Sonden in den 1,5 mL-Nuklease-freien Röhrchen zu verdünnen. In diesem Experiment fügen Sie für alle Antisense- und Sense-Sonden ( LmigOR1, LmigOR2 und LmigOrco ) 1 μl Sonde auf 99 μ hinzuL Hybridisierungspuffer pro Folie. Im Allgemeinen erzeugt die Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von Antisense-Sonden signifikante positive Signale und niedrige Hintergründe unter Verwendung dieses Protokolls. </li><li> Für den chromogenen Nachweis die DIG-markierten Sonden einzeln verdünnen. </li><li> Für die TSA-Detektion verdünnen Sie DIG-markiertes LmigOR1 mit Biotin-markierten LmigOrco- Sonden oder DIG-markiertem LmigOR2 mit Biotin-markierten LmigOR1- Sonden zusammen im Hybridisierungspuffer. </li><li> Die Verdünnungen 10 min bei 65 ° C erhitzen und mindestens 5 min auf Eis geben. </li></ol></li><li> Hybridisierung <ol><li> Die Folien abtropfen lassen und 100 μl verdünnte Antisense- und Sense-Sonden (Schritt 4.1) zu den Gewebeschnitten hinzufügen. Dann legen Sie Deckellippen (24 mm x 50 mm, nukleasefrei) auf die Gewebeabschnitte. </li><li> Legen Sie die bedeckten Schieber horizontal in eine feuchte Schachtel (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Abbildung 2 ) und inkubieren Sie eineT 55 ° C für 22 h. Füge Formamidlösung oder 1X PBS zum Boden der Schachtel hinzu, um die Umgebung feucht zu halten, aber nicht die Schläuche in die Flüssigkeit eintauchen. </li></ol></li><li> Waschen und Sperren. <ol><li> Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen. HINWEIS: Waschen bedeutet, dass die Objektträger in einen Schiebehalter gelegt werden, der dann in einen Plastikbehälter gelegt wird und sanft auf einer Wippe aufgerührt wird (~ 50 U / min, Abbildung 2 ). </li><li> Spülen Sie die Folien in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 s. </li><li> Füge 1 ml 1% Blockierungsreagenz in TBS hinzu, ergänzt mit 0,03% Triton X-100 auf jedem Objektträger und inkubieren für 30 min. Verwerfen Sie dann die Sperrlösung. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 Einheiten (U) / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugiertes Antibiotikum zu verdünnenDy bis 1,5 U / ml AP-Lösung. 100 μl AP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Für die TSA-Detektion verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 U / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugierter Antikörper und Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-konjugierter Antikörper gegen die AP / HRP-Lösung zu verdünnen. 100 μl AP / HRP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten ( Abbildung 2 ) für 60 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die Formamidlösung oder 1X PBS, um die Kiste feucht zu halten, aber nicht matschig. </li></ol></li></ol> 5. Färbung <ol><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig. Waschen Sie die Dias dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. Spülen Sie die Folien im DAP-Puffer (chromogener Nachweis: pH 9,5, TSA-Nachweis: pH 8,0) für 5 min. </li><li> Färbung (chromogener Nachweis) <ol><li> 100 &amp; mgr; l NBT (375 &amp; mgr; g / ml) / BCIP (188 &amp; mgr; g / ml) Substratlösung (verdünnt in DAP;PH 9,5) auf jede Folie. Setzen Sie die Deckgläser (24 x 50 mm) sorgfältig auf die Folien auf. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten mit Substratlösung für 10 min - O / N bei 37 ° C. HINWEIS: Überprüfen Sie die Entwicklung, indem Sie die Folien von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop betrachten. </li><li> Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser übertragen. </li></ol></li><li> Färbung (TSA-Erkennung) <ol><li> Verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / mL) Substrat aus dem Spritzenfilter (0,22 μm, Abbildung 2 ) zu bewegen. </li><li> Fügen Sie 100 μl HNPP / Fast Red Substrat pro Folie mit einem Deckglas (24 x 50 mm). Inkubieren Sie die Objektträger für 30 min mit HNPP / Fast Red Substrat bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1X TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li><li> 100 μl TSA-Substrat / überzogen (24 x 50 mm 2 ) rutschen Inkubieren Sie die Objektträger mit TSA-Substrat für 10 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li></ol></li><li> Die Folien in PBS / Glycerin (1: 3) einbetten. HINWEIS: Nach Beendigung dieser Vorgänge sollten die Folien so schnell wie möglich beobachtet werden, da das Fluoreszenzsignal schnell abschreckt. </li></ol> 6. Beobachtung <ol><li> Chromogener Nachweis <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem optischen Mikroskop beachten. Wählen Sie die 10X, 20X und 40X Objektiv, um die Ergebnisse der chromogenen Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie DP-BSW Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li><li> TSA-Erkennung <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem konfokalen Mikroskop beobachten. DIG-markierte Gene sollten unter 543 nm Licht beobachtet werden, die eine rote Farbe aufweisen und Biotin-markierte Gene sein solltenBeobachtet unter 488 nm Licht, präsentiert eine grüne Farbe. Wenn sie auftauchen, präsentieren sie eine gelbe Farbe. </li><li> Wählen Sie die 20X- und 40X-Objektivlinsen, um die Ergebnisse der TSA-Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie FV1000 Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li></ol>

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P., Lv, M., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broadly+tuned+odorant+receptor+in+neurons+of+trichoid+sensilla+in+locust,+Locusta+migratoria.">A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria.</a> Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).</li><li>Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+two+"Sensory+Neuron+Membrane+Proteins"+(SNMPs)+of+the+desert+locust,+Schistocerca+gregaria+(Orthoptera:+Acrididae).">Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).</li><li>Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren oder andere Interessenkonflikte.

Es ist schwer, RNA ISH zu lokalisieren, um ODER-Gene in Insektenantennen zu lokalisieren, da die Expressionsniveaus von ODER-Genen, außer ORco , sehr niedrig sind und die Histologie von Insektenantennen bewahrt wird, ist sehr schwierig. Darüber hinaus ist TSA-Erkennung auch sehr schwierig. Um diese Probleme zu lösen, sollten folgende Maßnahmen ergriffen werden. Die Antennen werden aus neu gemahlenen erwachsenen Heuschrecken ausgewählt, die dünne und weiche, natürliche Nagelhaut haben, die ihre Morphologi...

Insektenantennen, die die bedeutendsten chemosensorischen Organe sind, sind mit vielen haarähnlichen Strukturen - Sensilla - bedeckt, die von Olfactory Receptor Neurons (ORNs) innerviert werden. Auf der Membran von Insekten-ORNs werden Odorant-Rezeptoren (ODER), eine Art von Protein, das sieben Transmembran-Domänen enthält, mit einem Corezeptor (ORco) exprimiert, um ein Heteromer zu bilden, das als ein geruchshemmender Ionenkanal 1 , 2 , 3 fungiert . Verschiedene ODER reagieren auf verschiedene Kombinationen der chemischen Verbindungen 4 , 5 , 6 . Heuschrecken ( Locusta migratoria ) beruhen vor allem auf olfaktorischen Cues, um wichtige Verhaltensweisen auszulösen 7 . Heuschrecken-ODER sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis molekularer olfaktorischer Mechanismen. Lokalisierung eines spezifischen Heuschrecken-ODER-Gens an das Neuron von aMorphologisch spezifischer Sensillum-Typ durch RNA In situ Hybridisierung (RNA ISH) ist der erste Schritt bei der Erforschung der ODER-Funktion. RNA ISH verwendet eine markierte komplementäre RNA-Sonde zur Messung und Lokalisierung einer spezifischen RNA-Sequenz im Abschnitt von Gewebe, Zellen oder ganzen Mounts in situ und liefert Einblicke in physiologische Prozesse und Krankheitspathogenese. Digoxigenin-markierte (DIG-markierte) und Biotin-markierte RNA-Sonden wurden in der RNA-Hybridisierung weit verbreitet verwendet. Die RNA-Markierung mit Digoxigenin-11-UTP oder Biotin-16-UTP kann durch in vitro- Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerasen hergestellt werden. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden haben folgende Vorteile: nicht radioaktiv; Safe; stabil; hochsensibel; Hochspezifisch; Und leicht zu produzieren mit PCR und in vitro Transkription. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden können chromogen und fluoreszenz nachgewiesen werden. DIG-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Digoxigenin-Alkali nachgewiesen werdenNe Phosphatase (AP) -konjugierte Antikörper, die entweder mit den hochempfindlichen chemilumineszierenden Substraten Nitroblau Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidinsalz (NBT / BCIP) unter Verwendung eines optischen Mikroskops oder mit 2 sichtbar gemacht werden können -Hydroxy-3-naphtoesäure-2&#39;-phenylanilidphosphat (HNPP), gekoppelt mit 4-Chlor-2-methylbenzendiazonium-hemi-Zinkchloridsalz (Fast Red) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Biotin-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Biotin-Streptavidin-Pferd-Rettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Fluorescein-Tyramiden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops sichtbar gemacht werden können. Somit kann eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung durchgeführt werden, um zwei Zielgene in einer Scheibe unter Verwendung von DIG- und Biotin-markierten RNA-Sonden zu detektieren. RNA ISH mit DIG- und / oder Biotin-markierten Sonden wurde erfolgreich verwendet, um olfaktorisch verwandte Gene zu lokalisieren, wie OR , ionotroper Rezeptor, geruchsbindendes ProteinUnd sensorisches Neuronenmembranprotein, in Insektenantennen von, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria und die Wüstenheuschrecke Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Allerdings gibt es zwei wesentliche Herausforderungen bei der Durchführung von RNA ISH für Insekten-ODER: (1) ODER-Gene (außer ORco ) werden auf niedrigem Niveau und nur in wenigen Zellen exprimiert, was die Signaldetektion sehr schwierig macht und (2) das Insektengewebe konserviert Histologie, so dass die Morphologie erhalten bleibt und das Hintergrundgeräusch ist niedrig, kann eine Herausforderung sein. In diesem Papier ein detailliertes und effektives Protokoll beschreibt RNA ISH für die Lokalisierung von ODER-Genen in InsektAntennen präsentiert werden, einschließlich sowohl chromogene und Tyramide Signal Amplification (TSA) Erkennung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215;TSINGKETM Master Mix</td>
			<td>TSINGKE, China</td>
			<td>TSE004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free H2O</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>RT121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGULAR AGAROSE G-10</td>
			<td>BIOWEST, SPAIN</td>
			<td>91622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T Vector</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>A362A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>M180A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>CB101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>A-6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Inalco, USA</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>SBS Genetech, China</td>
			<td>GX1-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nco I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spe I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0133M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11685597910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10012718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10009257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td>
			<td>FISH0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>80070591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0777-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>0.04mol/L Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td>0.12%acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>03677</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>WISENT ING, Canada</td>
			<td>800-010-CG</td>
			<td>15g/L Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>8.5%NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900041-500G</td>
			<td>14mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900268-500G</td>
			<td>80mM Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>1M Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>1.5M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>100mM Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>100mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900020-500G</td>
			<td>50mM MgCl2&#183;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>3M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900095-500G</td>
			<td>0.3M Na-Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900894-100G</td>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>0.1M NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>80mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td>120mM Na2CO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1% Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0694-500ML</td>
			<td>0.03% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1&#215;Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D8906-50G</td>
			<td>10% dextran sulphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>invitrogen, USA</td>
			<td>AM7119</td>
			<td>20 &#181;g/ml yeast t-RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D3159-10G</td>
			<td>0.2 mg/ml herring sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate (10mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>2% fluorescein-tyramides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>Amplification Diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>Jung CM300 cryostat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>NANODROP 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus IX71microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus BX45 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Insekten haben anspruchsvolle olfaktorische Empfangssysteme entwickelt, um exogene chemische Signale zu erfassen. Diese chemischen Signale werden von Olfactory Receptor Neurons (ORNs), die in haarähnlichen Strukturen, genannt Chemosensilla, der Antennen untergebracht sind, transduziert. Auf den ORNs-Membranen wird angenommen, dass Odorant-Rezeptoren (ORs) an Geruchscodierung beteiligt sind. So ist es möglich, die auf die ORNs lokalisierten Gene zu identifizieren, um OR-Gene zu erkennen und stellt eine fundamentale Grundlage für weitere funktionelle in situ- Studien dar. Die RNA-Expressionsniveaus von spezifischen ODER- S in Insektenantennen sind sehr niedrig und die Erhaltung von Insektengewebe für die Histologie ist eine Herausforderung. Somit ist es schwierig, ein ODER zu einem bestimmten Typ von Sensilla unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung zu lokalisieren. In diesem Papier wird ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll speziell für niedrig exprimierte ODER-Gene von Insekten eingeführt. Darüber hinaus ist eine spezifische OR Gen waS identifiziert durch die Durchführung von doppelfarbigen fluoreszierenden in situ- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines coexprimierenden Rezeptor-Gens, Orco , als Marker.

Bei der chromogenen Detektion wurde eine kleine Teilmenge der Antennenzellen in jedem erwachsenen Antennenabschnitt mit den DIG-markierten LmigOR1- und LmigOR2- Antisense-Sonden bezeichnet ( Abbildung 3 ). RNA ISH auf aufeinanderfolgenden Abschnitten, um LmigOR1 und LmigOR2 zu lokalisieren, zeigten, dass Antennenzellen, die die beiden Gene exprimieren , in ORN-Clustern lokalisiert wurden, die LmigORco...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K Aufrufe.  China Agricultural University.  Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden. 

Serie: Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.