Este trabalho é apoiado por uma doação da National Natural Science Foundation of China (nº31472037). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fornecer informações específicas e não implica recomendação.

NOTA: Para limitar a degradação de ARN, prepare soluções usando água destilada em autoclave em húmido (a 121 ° C por 60 min) e também materiais em autoclave em molhado. 1. Preparação de RNA ISH Sondas anti-sentido e sentido <ol><li> Objetivo amplificação e purificação de genes <ol><li> Primeiro, produza um fragmento de cadeia dupla de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) a partir do plasmídeo contendo o cDNA completo de LmigOR1 com uma Taq DNA Polymerase que adiciona adeninas a ambas as extremidades dos fragmentos. <ol><li> Usar um 100 uL de volume de reacção final, contendo 50? L de mistura de reacção 2x, 4 uL de cada sentido e anti-iniciadores (Tabela 1), 1? L de molde do plasmídeo e 41 uL de RNase H 2 O. A utilização do seguinte PCR Protocolo: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min. </li><li> Repita estes passos para produzir o fragmento de cadeia dupla de LMigOR2 (GenBank: JQ766966) de 1.303 pb e 1.000 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Os iniciadores utilizados nestas experiências são apresentados na Tabela 1 . </li><li> Execute produtos de PCR em géis de agarose a 1,2% em 1x tampão Tris-acetato-EDTA e visualize usando coloração com brometo de etidio. </li></ol></li><li> Extraia esses produtos de PCR usando um kit de extração de gel. <ol><li> Após a eletroforese, adicione as faixas de DNA do gel e coloque as fatias de gel em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, adicione 100 μL de tampão de ligação (Buffer PN) por 0,1 g de fatia de gel. Vortex e incubar a 50 ° C até a fatia de gelar completamente dissolvida. </li><li> Insira uma coluna de adsorção CA2 no tubo de coleta e adicione 500 μL de buffer de equilíbrio (Buffer BL). Isso melhora a capacidade de absorção e a estabilidade da membrana de sílica. CentriFugir em 12.400 xg por 1 min. </li><li> Transferir a mistura de gel dissolvido para o conjunto da coluna de adsorção e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.400 xg durante 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta. </li><li> Adicione 600 μL de solução de lavagem (etanol adicionado, Buffer PW) duas vezes. Centrifugar a 12.400 xg por 1 min. Descarte o fluxo e reinsira a coluna de adsorção no tubo de coleta. </li><li> Esvazie o tubo de recolha e recentrifique o conjunto da coluna em 12.400 xg durante 2 minutos para permitir a evaporação de qualquer etanol residual. </li><li> Transfira cuidadosamente a coluna de adsorção para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Secar ao ar a pastilha por 5-10 min e redissolver o DNA num volume adequado ( por exemplo, 30 μL) de água isenta de nuclease. </li><li> Incubar à TA por 2 min. Centrifugar a 12.400 xg por 2 min. Descarte a coluna de adsorção e armazene o DNA a 4 ° C ou -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Construa os plasmídeos recombinantes <ol><li> Ligar individualmente o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1,303 pb de LmigOR2 e 1,251 pb de LmigORco em um vetor T que contém promotores para as polimerases de ARN T7 (a montante) e SP6 (a jusante) adjacentes ao DNA inserido usando T4 DNA ligase. Prepare a seguinte reação de 10 μL: 5 μL de tampão de ligação 2x, 1 μL de vetor T, 3 μL (~ 100 ng) do DNA do gene inserido e 1 μL de ADN ligase T4 e incuba O / N a 4 ° C. </li><li> Adicionar 5 uL de cada plasmídeo recombinante contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 pb fragmento de LmigOR2 e 1251 pb fragmento de LmigORco separadamente em 50 uL de células de Escherichia coli DH5a competentes em tubos de 1,5 mL esteis. <ol><li> Misture suavemente e coloque os tubos em gelo durante 30 min e depois incubri-los durante 90 s a 42ºC.° C. Transfira-os de volta ao gelo por 3 min. </li><li> Adicione 450 μL de meio líquido Luria-Bertani (LB) sem ampicilina a cada tubo e incuba-os em um agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar o E. coli DH5a. </li><li> Pegue uma alíquota de 100 μL de cada transformante e use-os para inocular placas de substrato sólido LB contendo 50 μg / mL de ampicilina, 24 μg / mL de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 40 μg / mL de 5-bromo-4 -cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido (X-gal). </li><li> Incubar estas placas em uma incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Tira os plasmídeos recombinantes alvo usando o método de triagem azul-branco. Seqüencie os plasmídeos recombinantes alvo usando a seqüência de Sanger e identifique as direções de inserção dos genes OR. </li></ol></li></ol></li><li> Selecione endonucleases de restrição para linearizar plasmídeos recombinantes <ol><li> Usar endonucleases de restrição tNão apenas digerir no site de clonagem múltipla do vetor, mas também não cortar o DNA da inserção. Nesta experiência, todos os 3 genes são inseridos no vetor T na direção correspondente à do vetor. </li><li> Utilize a endonuclease de restrição Nco I para linearizar os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30mm de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco para produzir as sondas anti-sentido. Use a endonuclease de restrição Sp e I para produzir as sondas sensoriais. NOTA: Se a direção da inserção corresponde à do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a ARN polimerização de SP6 é usada para preparar a sonda anti-sentido. Um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda de detecção. Caso contrário, se a direção da inserção não corresponder a tA direção do vetor, então um local de restrição exclusivo do final de SP6 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante e a polimerase de ARN T7 é usada para preparar a sonda anti-sentido. O site de restrição exclusivo do final de T7 é selecionado para linearizar o plasmídeo recombinante, e a ARN polimerização SP6 é usada para preparar a sonda de detecção. </li></ol></li><li> Purificando os plasmídeos recombinantes linearizados <ol><li> Digerir 20 μg de cada um dos três plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de L30ig de LmigOR2 e 1.251 pb de LmigORco usando a endonuclease de restrição de Nco I em uma reação de 100 μL que contém 10 μL de tampão 10x, 40 μL de 0,5 ug de plasmídeo / L, 3 mL de Nco I e 47 uL de RNase H 2 O, seguido por uma incubação de 3 h a 37 ° C. </li><li> Da mesma forma, digerir 20 μg de cada um desses três plasmídeos recombinantes vocêCante a endonuclease de restrição Spe I. </li><li> Purifique estes plasmídeos digeridos usando um kit de extração de gel como descrito em 1.1.2. Determine as concentrações destes plasmídeos recombinantes linearizados extraídos por espectrofotometria e ajuste para 0,5 μg / μL. </li></ol></li><li> Prepare sondas anti-sentido e sensoriais <ol><li> Use o sistema de transcrição de ARN T7 / SP6 para gerar sondas anti-sentido e sensoriais. A polimerase de ARN de SP6 é usada para transcrever ARN de cadeia dupla para sondas anti-sentido marcadas com DIG e biotina para esses três genes OR usando plasmídeos recombinantes linearizados como modelos in vitro . A polimerase de ARN T7 é utilizada para produzir sondas sensoriais. Realize a reação em um volume final de 20 μL, contendo 2 μL de mistura de NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição 10X, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de ARN polimerização T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmídeo linearizado e 9 ul de ARNase isento de H 2 O, seguidoPor uma incubação de 3 h a 37 ° C. </li><li> Incubar as sondas de detecção anti-sentido marcadas com DIG e biotina durante 30 min com 1 μL de DNase a 37 ° C. Adicionar 2,5 μL de LiCl 5 M e 75 μL de etanol absoluto, depois incubar as reações durante 30 min a -70 ° C. </li><li> Centrifugar a 15,000 xg durante 30 min a 4 ° C. Decanta com cuidado o sobrenadante. Adicione 150 μL de etanol a 70% para lavar o precipitante. Prepare o etanol a 70% (1 L) adicionando 95% de etanol (736,8 mL) a água destilada estéril (263,2 mL). </li><li> Centrifugar a 15,000 xg durante 30 minutos a 4 ° C novamente e secar ao ar a pastilha por 5-10 minutos à TA. Adicione 25 μL de H 2 O isento de RNase para dissolver as sondas anti-sentido e sensoriais de RNA. </li><li> Se o comprimento do gene inserido for superior a 1 kb, subseqüentemente fragmenta sondas de sentido antisentido e de detecção de ARN até um comprimento médio de 300 pb por incubação em soluções tampão de carbonato de carbonato. Realize a reação em um volume final de 50 μL, containing 25 pL da sonda de ARN e 25 uL da solução tampão de bicarbonato-carbonato (80 mM de NaHCO3, 120 mM de Na 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. O tempo de hidrólise requerido é dado por uma fórmula 17 previamente publicada. </li><li> Adicione 5 μL de ácido acético a 10% para parar a reação. Neste experimento, fragmentar as sondas de sentido antisense e LmigOR2 LmigOR2 e LmigORco durante 24 e 23 minutos, respectivamente. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = os comprimentos de fragmentos iniciais em kb L f = o comprimento final dos fragmentos em kb K = a constante de taxa para hidrólise, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1 T = tempo de hidrólise em min </li><li> Finalmente, adicione 250 μL de tampão de hibridação e armazene a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de seções de criostato <ol><li> Precool o freeziNg microtome a -24 ° C. </li><li> Selecione novos gafanhotos adulto em muda que estejam ativos e tenham antenas intactas. Corte as antenas em pedaços de 2-3 mm usando máquinas de barbear estéreis. </li><li> Coloque o composto OCT em um suporte de micrótomo congelante e coloque uma ou duas amostras sobre o composto horizontalmente. Em seguida, transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C para equilibrar até o composto congelar. Retire o suporte e cubra as amostras com um pouco de composto. Transfira o suporte para o micrótomo de congelação a -24 ° C novamente durante pelo menos 10 minutos ( Figura 1 ). NOTA: Evite obter bolhas no composto. </li><li> Fixar o suporte com as amostras no micrótomo de congelação, depois separar as amostras congeladas em fatias de 12 μm de espessura a -24 ° C. </li><li> Descongelar as fatias uma a uma nas lâminas (25 x 75 mm, livre de nuclease) e secar ao ar por 10 min. </li></ol> 3. Seções de fixação <ol><li> Após a preparação do criostatoSeções, coloque as lâminas em um recipiente de plástico (~ 100 x 40 x 80 mm) e conserte os tecidos incubando as lâminas em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 min. </li><li> Para eliminar as proteínas alcalinas, transfira as lâminas para HC1 0,2 M por 10 min. </li><li> Para eliminar a proteína superficial do ácido nucleico, transfira as lâminas para 1XPBS com 1% de Triton X-100 durante 2 min. </li><li> Lave os slides duas vezes por 30 s em 1x PBS. </li><li> Finalmente, enxaguar as lâminas na solução de formamida durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 4. Hibridação <ol><li> Prepare as sondas anti-sentido e sensoriais <ol><li> Use o tampão de hibridação para diluir as sondas antisentido ou sensora de RNA nos tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Nesta experiência, para todas as sondas antisentido e sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), adicione 1 μL de sonda a 99 μL buffer de hibridação por slide. Geralmente, o uso de diluições 1: 100 de sondas anti-sentido produz sinais positivos significativos e baixos fundos usando este protocolo. </li><li> Para detecção cromogênica, diluir as sondas marcadas com DIG individualmente. </li><li> Para a detecção de TSA, diluir LmigOR1 marcado com DIG com sondas LmigOrco marcadas com biotina ou LmigOR2 marcado com DIG com sondas LmigOR1 marcadas com biotina em conjunto no tampão de hibridação. </li><li> Aquecer as diluições durante 10 min a 65 ° C e colocá-las em gelo durante pelo menos 5 min. </li></ol></li><li> Hibridação <ol><li> Drene as lâminas e adicione 100 μL de sondas de detecção anti-sentido diluídas (Etapa 4.1) às secções de tecido. Em seguida, coloque lamínulas (24 mm x 50 mm, livres de nuclease) nas seções de tecido. </li><li> Coloque as lâminas cobertas horizontalmente em uma caixa úmida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incubar umaT 55 ° C durante 22 h. Adicione a solução de formamida ou 1X PBS no fundo da caixa para manter o ambiente úmido, mas não submergir as lâminas no líquido. </li></ol></li><li> Lavagem e bloqueio. <ol><li> Após a hibridação, remova cuidadosamente os lamínulas. Lave as lâminas duas vezes por 30 min em citrato de sódio salino 0.1x (SSC) a 60 ° C. NOTA: A lavagem significa colocar as lâminas em um suporte de deslizamento que é então colocado em um recipiente de plástico e agitado suavemente em um balancim (~ 50 rpm, Figura 2 ). </li><li> Enxaguar as lâminas em 1x Tris-Buffered Saline (TBS) durante 30 s. </li><li> Adicionar 1 mL de reagente de bloqueio a 1% em TBS suplementado com Triton X-100 a 0,03% em cada lâmina e incubar durante 30 min. Em seguida, descarte a solução de bloqueio. </li></ol></li><li> Imuno-histoquímica. <ol><li> Para a detecção cromogênica, use reagente de bloqueio no TBS para diluir 750 unidades (U) / mL anti-digoxigenina anti-conjugado APDy a 1,5 U / mL AP solução. Adicione 100 μL de solução AP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm). </li><li> Para detecção de TSA, use reagente de bloqueio em TBS para diluir 750 U / mL de anticorpo anti-digoxigenina AP conjugado e anticorpo anti-biotina com estreptavidina conjugada com HRP para a solução AP / HRP. Adicione 100 μL de solução de AP / HRP por deslizamento coberto (24 mm x 50 mm). </li><li> Incube os slides em uma caixa úmida ( Figura 2 ) durante 60 min a 37 ° C. Use a solução de formamida ou 1X PBS para manter a caixa úmida, mas não encharcada. </li></ol></li></ol> 5. Coloração <ol><li> Remova cuidadosamente os lamínulas. Lavar as lâminas três vezes durante 5 min em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. Enxaguar os slides em tampão DAP (detecção cromogênica: pH 9,5, detecção TSA: pH 8,0) durante 5 min. </li><li> Coloração (detecção cromogênica) <ol><li> Adicionar 100 μL de solução de substrato NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluída em DAP;PH 9,5) para cada slide. Coloque cuidadosamente os lamínulos (24 x 50 mm) nos slides. </li><li> Incube as lâminas em uma caixa úmida com solução de substrato por 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Verifique o desenvolvimento, olhando os slides de vez em quando ao microscópio. </li><li> Quando o desenvolvimento estiver pronto, pare a reação transferindo as lâminas para dentro da água. </li></ol></li><li> Coloração (detecção TSA) <ol><li> Use uma seringa para mover o substrato de HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) do filtro da seringa (0,22 μm, Figura 2 ). </li><li> Adicione 100 μL de HNPP / Substrato Vermelho Rápido por slide coberto com uma lamínula (24 x 50 mm). Incube as lâminas durante 30 minutos com HNPP / Substrato Vermelho Rápido à RT. </li><li> Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes por 5 minutos em 1X TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. </li><li> Use 100 μL de substrato TSA / coberto (24 x 50 mm 2 ) deslize. Incube as lâminas com substrato de TSA durante 10 min à TA. </li><li> Remova cuidadosamente os lamínulas e lave as lâminas três vezes durante 5 minutos em 1x TBS suplementado com 0,05% de Tween-20. </li></ol></li><li> Incorporar as lâminas em PBS / glicerol (1: 3). NOTA: Depois de concluir estes procedimentos, as lâminas devem ser observadas o mais cedo possível porque o sinal fluorescente vai aplacar rapidamente. </li></ol> 6. Observação <ol><li> Detecção cromogênica <ol><li> Observe as seções de tecido usando um microscópio óptico. Escolha as lentes objetivas 10X, 20X e 40X para observar os resultados da detecção cromogênica. </li><li> Use o software DP-BSW para analisar os resultados e capturar as imagens. </li></ol></li><li> Detecção TSA <ol><li> Observe seções de tecido usando um microscópio confocal. Os genes marcados com DIG devem ser observados sob luz de 543 nm, apresentando uma cor vermelha, e os genes marcados com biotina devem serObservado sob luz de 488 nm, apresentando uma cor verde. Quando emergem, apresentam cor amarela. </li><li> Escolha as lentes objetivas 20X e 40X para observar os resultados da detecção TSA, respectivamente. </li><li> Use o software FV1000 para analisar os resultados e capturar as imagens. </li></ol></li></ol>

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C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar ou quaisquer outros conflitos de interesse.

É difícil realizar RNA ISH para localizar genes OU em antenas de insetos porque os níveis de expressão de genes OR, exceto ORco , são muito baixos e a preservação de fatias histológicas de antenas de insetos é muito difícil. Além disso, a detecção TSA também é muito complicada. Para resolver esses problemas, as seguintes medidas devem ser tomadas. As antenas são selecionadas a partir de gafas adultas de muda que possuem cutículas antenas finas e macias, que mantêm sua morfologia no slide. As a...

As antenas de insetos, que são os órgãos quimiossensores mais importantes, são cobertas com muitas estruturas parecidas com o cabelo - chamadas sensilla - que são inervadas pelos neurônios receptores olfatórios (ORNs). Na membrana de ORN de insetos, os receptores de odorantes (OR), um tipo de proteína contendo sete domínios transmembranares, são expressos com um coreceptor (ORco) para formar um heterômero que funciona como um canal iónico 1 , 2 , 3 odorante. OUs diferentes respondem a diferentes combinações de compostos químicos 4 , 5 , 6 . Os gafanhotos ( Locusta migratoria ) dependem principalmente de pistas olfativas para desencadear comportamentos importantes 7 . As ERs do Locustão são fatores-chave para a compreensão dos mecanismos olfativos moleculares. Localizando um gene OR específico para o neurônio de umO tipo de sensibilidade morfológicamente específico por ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) é o primeiro passo na exploração da função OR. RNA ISH usa uma sonda de ARN complementar marcada para medir e localizar uma sequência de ARN específica em uma seção de tecido, células ou montagens inteiras in situ , fornecendo informações sobre processos fisiológicos e patogênese da doença. As sondas de ARN marcadas com marcadores de digoxigenina (marcados com DIG) e de biotina foram amplamente utilizadas na hibridação de ARN. A marcação de ARN com digoxigenina-11-UTP ou biotina-16-UTP pode ser preparada por transcrição in vitro com polimerases de ARN de SP6 e T7. As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina possuem as seguintes vantagens: não radioativas; seguro; estável; altamente sensível; Altamente específico; E fácil de produzir usando PCR e transcrição in vitro . As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina podem ser detectadas cromogenicamente e fluorescentemente. As sondas de ARN marcadas com DIG podem ser detectadas com Alkali anti-digoxigeninaAnticorpos conjugados com fosfatase (AP) que podem ser visualizados quer com os substratos quimioluminescentes altamente sensíveis cloreto de tetrazólio nitroblue / sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizando um microscópio óptico ou com 2 -hidroxi-3-naftoico-2&#39;-fenilanilida fosfato (HNPP) acoplado com sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazónio (Fast Red) utilizando um microscópio confocal. As sondas de ARN marcadas com biotina podem ser detectadas com anticorpos conjugados anti-biotina com estreptavidina de rabo cavalo (HRP) que podem ser visualizados com fluoresceína-tiramides usando um microscópio confocal. Assim, a hibridação fluorescente in situ de duas cores pode ser realizada para detectar dois genes alvo em uma fatia usando sondas de RNA marcadas com DIG e biotina. O RNA ISH com sondas marcadas com DIG e / ou biotina foi utilizado com sucesso para localizar genes relacionados ao olfato, tais como OR , receptor ionotrópico, proteína de ligação aos odorantesE proteína da membrana neuronal sensorial, em antenas de insetos de, entre outras, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e gafanhoto do deserto, Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . No entanto, existem dois desafios substanciais ao executar RNA ISH para insetos OR: (1) OU genes (exceto ORco ) são expressos em níveis baixos e somente em algumas células, tornando a detecção de sinal muito difícil e (2) preservando o tecido de insetos para Histologia, de modo que a morfologia seja preservada e o ruído de fundo seja baixo, pode ser desafiador. Neste artigo, um protocolo detalhado e eficaz descrevendo RNA ISH para localizar genes OR em insetosAntenas são apresentadas, incluindo a detecção cromogênica e de ampliação de sinal de Tyramide (TSA).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215;TSINGKETM Master Mix</td>
			<td>TSINGKE, China</td>
			<td>TSE004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free H2O</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>RT121-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGULAR AGAROSE G-10</td>
			<td>BIOWEST, SPAIN</td>
			<td>91622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance buffer</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td>
			<td>DP209-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T Vector</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>A362A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>M180A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>TIANGEN, China</td>
			<td>CB101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>A-6140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Inalco, USA</td>
			<td>1758-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>SBS Genetech, China</td>
			<td>GX1-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nco I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spe I</td>
			<td>BioLabs, New England</td>
			<td>R0133M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11685597910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10012718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10009257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td>
			<td>FISH0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>80070591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0777-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>0.04mol/L Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td>
			<td>10000292</td>
			<td>0.12%acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-acetate-EDTA</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>03677</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>10g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM335231</td>
			<td>10g/L Peptone from casein (Tryptone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>MERCK, Germany</td>
			<td>VM361526</td>
			<td>5g/L Yeast extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB solid substrate plate</td>
			<td>WISENT ING, Canada</td>
			<td>800-010-CG</td>
			<td>15g/L Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>8.5%NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900041-500G</td>
			<td>14mM KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;phosphate buffer saline (pH7.1)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900268-500G</td>
			<td>80mM Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>1M Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris buffered saline (pH7.5)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>1.5M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900483-1KG</td>
			<td>100mM Tris-Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>100mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer (DAP) &#160;&#160;&#160;&#160;&#160; chromogenic detection pH9.5&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; TSA detection pH8.0</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900020-500G</td>
			<td>50mM MgCl2&#183;6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sinopharm, China</td>
			<td>10019392</td>
			<td>3M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;saline-sodium citrate (pH7.0)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900095-500G</td>
			<td>0.3M Na-Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900894-100G</td>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution (pH9.5)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>0.1M NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>V900182-500G</td>
			<td>80mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td>120mM Na2CO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide Solution (pH10.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1% Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td>AMRESCO, USA</td>
			<td>0694-500ML</td>
			<td>0.03% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1&#215;Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11175041910</td>
			<td>1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking Buffer in Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>MPBIO, USA</td>
			<td>FORMD002</td>
			<td>50% Deionized Formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2&#215;saline-sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D8906-50G</td>
			<td>10% dextran sulphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>invitrogen, USA</td>
			<td>AM7119</td>
			<td>20 &#181;g/ml yeast t-RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D3159-10G</td>
			<td>0.2 mg/ml herring sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate (10mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11758888001</td>
			<td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#39;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>2% fluorescein-tyramides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyramide signal amplification substrate</td>
			<td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td>Amplification Diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>Jung CM300 cryostat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td>
			<td>NANODROP 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus IX71microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>Olympus BX45 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Os insetos evoluíram sofisticados sistemas de recepção olfativa para detectar sinais químicos exógenos. Esses sinais químicos são transduzidos por neurônios receptores olfatórios (ORNs) alojados em estruturas parecidas com o cabelo, chamados de quimiosensila, das antenas. Nas membranas dos ORN, pensa-se que os receptores de odorantes (RUP) estão envolvidos na codificação de odor. Assim, ser capaz de identificar genes localizados nas ORNs é necessário reconhecer genes OR e fornece uma base fundamental para novos estudos funcionais in situ . Os níveis de expressão de RNA de OR específicos em antenas de insetos são muito baixos e a preservação do tecido de insetos para a histologia é desafiadora. Assim, é difícil localizar um OR para um tipo específico de sensilla usando hibridização in situ RNA. Neste artigo, é introduzido um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes OR de insetos pequenos. Além disso, um OR específico Gene waS identificado pela realização de experiências de hibridação in situ fluorescentes de duas cores utilizando um gene de receptor coexpressivo , Orco , como marcador.

Com a detecção cromogênica, um pequeno subconjunto das células antenais em todas as seções antenais adultas foi indicado pelas sondas antisentidades LmigOR1 e LmigOR2 marcadas com DIG ( Figura 3 ). ARN ISH em secções consecutivas para localizar LmigOR1 e LmigOR2 mostrou que as células que expressam antenares os dois genes foram localizados em aglomerados ORN expressam LmigORco, indicando que o LmigOR1...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina.

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridação

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K visualizações.  China Agricultural University.  Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina. 

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.