Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
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著者らは、デンマークのInnovationfonden Denmark（Pant Power、プロジェクト番号12-131844）、Villum Fonden（プロジェクト番号13363）のNordic Energy Research（AquaFEED、プロジェクト番号24）

1.準備<ol><li> シアノバクテリア培養 <ol><li>成長するSynechocystis sp。 1％（v / v）CO 2を補充した一定量の空気を供給しながら、液体BG11培地8中、30℃でPCC 6803。 50μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光で連続的に培養物を照明する。 </li><li>成長するSynechococcus sp。 1％（v / v）CO 2を補充した空気を一定にして、液体A +培地23 （BG11培地も使用することができる）中のPCC7002。温度は37℃でなければなりません。 150μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光を用いて連続的に培養物を照明する。 </li><li> 1cmの光路を有するキュベットを用いて730nmで培養物の光学密度（OD）を測定する。 OD値が0.8より大きい場合、適切な希釈を行い、OD測定値を得る。e細胞濃度。 注記：以下に示すプロトコールは、OD 730nm値2以上に対応する細胞密度を有する液体培養に適している。指数関数的増殖期の培養物（典型的にはOD 730nm値が1未満である）が望ましい場合、OD 730nm値が2以上になるように緩衝液または培地中で遠心分離および再懸濁により細胞密度を濃縮する。 </li></ol></li><li> バッファーと試薬 <ol><li> pH 8で50mM Tris-HCl緩衝液を調製する。 </li><li> 50mM酢酸ナトリウム緩衝液をpH5にする。 </li><li> 50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中の8U / mLアミログルコシダーゼのストック溶液を調製する。 </li><li> 50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中に2U / mLのα-アミラーゼのストック溶液を調製する。 </li><li>蒸留水を使用して、0〜100μg/ mLの範囲の濃度でメイクグルコース標準溶液を調製する。 </li><li> D-グルコースアッセイキット（GODPODフォーマット）からGOD-POD試薬を調製し、fメーカーの指示に従ってください。 </li></ol></li></ol> 2.細胞乾燥重量の測定（オプション） <ol><li> 2 mLの培養液または細胞再懸濁液（ステップ1.1参照）を2.0 mLチューブに移し、6,000 xgおよび4 o Cで5分間遠心します。上清を捨てる。 </li><li>ペレットを1 mLの水に再懸濁し、6,000 xgで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、細胞ペレットを0.5mLの水に再懸濁する。 </li><li>サスペンションを予め計量されたアルミニウムトレイに移す。一晩乾燥（約18時間）するために、トレーを105℃の乾燥オーブンに移す。 重要：トレイからの材料の移動を避けるために、鉗子でトレイを取り扱うことが重要です。同じ条件で空のあらかじめ計量されたアルミニウムトレイを乾燥させて、乾燥中のトレイからの重量損失を測定する。 </li><li>乾燥後、トレーをオーブンから取り出し、周囲温度で平衡させるそれを0.0001gの精度で計量する前に5分間保持する。 注記：この値は、細胞乾燥重量ベースでグリコーゲン含有量を標準化するために使用することができます。 </li></ol> 3.シアノバクテリア細胞の溶解<ol><li> 1mLの培養液または細胞再懸濁液（ステップ1.1を参照）を1.5mLチューブに移し、6,000×gおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を捨てる。 </li><li>ペレットを1 mLの50 mM Tris-HCl（pH 8）に再懸濁し、6,000 xgで4℃で10分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを1mLのTris-HCl緩衝液に再懸濁する。プロセスを繰り返します。 </li><li>ペレットを500μLの50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8）に徹底的に再懸濁する。 重要：ペレットを効率よく細胞溶解するために再懸濁する。再懸濁液を氷に入れておきます。 </li><li> 再懸濁した細胞を4℃で30サイクルの超音波処理を行い、各サイクルは最大振幅の20kHzの周波数で30秒間行い、それに続く90秒が続く。 注：この方法は、 Synechococcus spを効率的に溶解することができます。 PCC7002。 <ol><li>あるいは、細胞再懸濁液をスクリューキャップチューブに移し、製造業者の指示に従って、酸化ジルコニウムビーズをチューブに添加する。組織ホモジナイザーにチューブをセットし、ビーティングの2サイクルを行うことにより4℃で細胞を溶解する。各サイクルは、周波数設定5で5分で構成される。 注：この方法は、 Synechocystis sp。を効率よく溶解することができる。 PCC 6803およびSynechococcus sp。 PCC7002。 </li></ol></li><li>ライセートを含むチューブを6,000 xgおよび4℃で10分間遠心します。 注：ペレットは、主に大きな細胞破片で構成されています。十分な数の破損していないセルがある場合は、手順3.4を繰り返します。上清を氷上に保つ。 </li><li>市販のBCA Proteinアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定する。 注：この値は、グリコーゲン含有量を標準化するために使用することができますタンパク質含有量ベースで測定した。 </li></ol> 4.グリコーゲン沈殿<ol><li> 96％（v / v）エタノール900μLとステップ3.5の上清100μLを1.5mLスクリューキャップチューブに混合することにより、細胞溶解物からクロロフィルaを除去する。キャップを閉めた後、標準の実験室用加熱ブロックを使用してチューブを90℃で10分間加熱します。 </li><li>チューブを氷上で30分間インキュベートする。 </li><li>チューブを20,000×gおよび4℃で30分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。ペレットはグリコーゲンを含む。ペレットを軽く乾燥させて過剰のエタノールを除去する。 重要：ペレットの過度の乾燥は避けなければならない。さもなければ、ステップ5.1で可溶化することが困難になる。 </li><li>オプション：ステップ4.3で得られた上清の664nmでの吸光度を測定し、クロロフィルa含量を決定する。 84.6 L / g / cm 24の吸収係数を使用してください。 注：値をnormalizに使用することができますグリコーゲン含有量。 </li></ol> 5.酵素加水分解およびグリコーゲン測定<ol><li>ステップ4.3で得られたペレットを50mM酢酸ナトリウム（pH5）100μLに可溶化し、8U / mLのアミログルコシダーゼ50μLと2U / mLのα-アミラーゼ50μLを添加する。ボルテックスを用いてこれらの材料をよく混合する。 注：グリコーゲンペレットは粘性であるため、ピペッティングによる混合は推奨されません。 </li><li>混合物を60℃で加熱ブロック上で2時間インキュベートし、グリコーゲンがグルコース分子に消化されるようにする。 </li><li>サンプルを10,000 xgで5分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに移す。 </li></ol> GOD-POD試薬を用いた総グルコース含量の測定<ol><li>ステップ5.3で得られた上清中のグルコース濃度をGOD-POD試薬を用いて測定する。ステップ5.3の上清100μLを96ウェルプレートのウェルに移す。ネガティブコントロールとして、100μLの50 mM酢酸ナトリウム、pH 5を使用する。検量線を作成するには、グルコース標準溶液も測定する。 </li><li>各サンプルに150μLのGOD-POD試薬を加え、ピペッティングで迅速に混合します。 </li><li>プレートを静的に25℃で30分間インキュベートする。プレートリーダーを用いて吸光度値を510 nmで記録する。 </li><li>グルコース標準から得られた較正曲線を用いてグルコースの濃度を計算する。 注：細胞溶解液中のグリコーゲン濃度は、グルコースの濃度（μg/ mL）として表されます。 </li></ol>

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	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. 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PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. 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著者は何も開示することはない。

プロトコル内の重要なステップは、グリコーゲン沈殿および再懸濁である。エタノール沈殿後の遠心分離後、グリコーゲンは、微量遠心管の壁に緩く付着する半透明ペレットを形成する。したがって、上清を除去する際には、ペレットを除去しないように注意する必要があります。グリコーゲンペレットは粘着性があり、乾燥すると可溶化が困難になります。グリコーゲンペレットの完全な?...

シアノバクテリアは、光合成により光に固定されたCO 2から炭素の主要な炭水化物貯蔵物としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲンは、α-1,6-結合グルコシル結合によってつくられる分枝を有する線状α-1,4-結合グルカンからなるグリカンである。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成は、ホスホグルコムターゼおよびADP-グルコースピロホスホリラーゼの連続作用によるグルコース-6-リン酸のADP-グルコースへの変換から始まる。 ADP-グルコース中のグルコース部分は、1種以上のグリコーゲンシンターゼ（GlgA）によってグリコーゲンのα-1,4-グルカン主鎖の非還元末端に転移される。続いて、分枝酵素はα-1,6-結合グルコシル結合を導入し、これはさらに伸長してグリコーゲン粒子を生成する。暗所では、グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン脱分岐酵素、α-グルカノトランスフェラーゼ、およびマルトデキストリンホスホリラーゼによってリン酸化されたグルコースおよび遊離グルコースに分解される。これらのフィードintO酸化的ペントースリン酸経路、エムデン-マイヤーホフ-パルナス経路（解糖）、およびエントナー・ドゥドロフ経路1、2、3、4を含む異化経路、。 シアノバクテリアのグリコーゲン代謝は、シアノバクテリアが日光によって駆動される微生物細胞工場に発展して化学物質や燃料を生産する可能性があるため、近年注目を集めています。グリコーゲン代謝は、グリコーゲンがこれらの細菌における最大の柔軟な炭素プールであるため、生成物の収量を増加させるように改変することができる。一例はシアノバクテリウム・シネココッカス sp。マンニトールを生産するように遺伝子操作されたPCC7002;グリコーゲン合成の遺伝的破壊はマンニトール収率を3倍に増加させる5 。別の例は、グリコーゲン負荷野生動物からのバイオエタノールの生産であるSynechococcus sp。 PCC 7002 6 。野生型細胞のグリコーゲン含有量は、窒素飢餓6中の細胞の乾燥重量の60％までとすることができます。 グリコーゲンの代謝および調節に関する我々の理解も近年拡大している。グリコーゲンは、光の中に蓄積し、暗所で異化されることが知られているが、ディールサイクル中のグリコーゲン代謝の詳細な動態は、 Synechocystis sp。 PCC 6803 7 。さらに、グリコーゲンの蓄積に影響を及ぼすいくつかの遺伝子が同定されている。顕著な例は、推定ヒスチジンキナーゼPmgAおよび非コードRNA PmgR1が調節カスケードを形成し、グリコーゲンの蓄積を制御するという発見である。興味深いことに、 pmgAおよびpmgR1欠失突然変異体は、 シネコシスティス spの野生型株の2倍のグリコーゲンを蓄積する。 PCC 68038、9。他の調節エレメントは、代替シグマ因子Eおよび転写因子CyAbrB2 10、11を含め、グリコーゲンの蓄積に影響を与えることが知られています。 グリコーゲン調節および代謝に関心が高まるにつれて、グリコーゲン含量の決定を記述する詳細なプロトコルが正当化される。いくつかの方法が文献で使用されている。パルスアンペロメトリック検出器または酸とフェノールと処置後分析決意に結合された高圧陰イオン交換液体クロマトグラフィーを介して単糖類含有量の決意に続く酸加水分解が広くグリコーゲン含量9、10、12、13を近似する方法を使用しています。しかしながら、高圧アニオン交換液体クロマトグラフィーC機器は非常に高価であり、いくつかのシアノバクテリア種中に蓄積することが知られているようなスクロース14、グルコ15、及びセルロース16、17、18のような他のグルコース含有複合糖質、に由来するものからグリコーゲン由来のグルコースを区別しません。酸 - フェノール法は、標準的な実験装置を用いて行うことができる。しかし、毒性の高い試薬を使用し、異なる複合糖質由来のグルコースを区別しておらず、そのような糖脂質、リポ多糖、および外マトリックス12などの細胞材料を構成する他の単糖からグルコースを区別しません。特に、熱い酸 - フェノールアッセイは、グルコース含量の特定の決定12ではなく、総炭水化物含量の決定にしばしば用いられる。酵素的ハイα-アミログルコシダーゼによるグリコーゲンのグルコースへのグルコースの加水分解、その後の酵素結合アッセイによるグルコースの検出は、グリコーゲン由来のグルコースに対して非常に感受性が高く特異的な比色測定値を生成する。特異性は、エタノール5、8、19によって細胞溶解物からのグリコーゲンの優先析出をさらに向上させることができます。 ここでは、最も広く研究されている2つのシアノバクテリア種であるSynechocystis sp。のグリコーゲン含量の酵素ベースのアッセイの詳細なプロトコールについて説明します。 PCC 6803およびSynechococcus sp。 PCC7002を野生型株および変異株に導入した。効率的な加水分解を確実にするために、α-アミラーゼおよびα-アミログルコシダーゼのカクテルを使用する8 。エンド作用性α-アミラーゼは、種々のグルカン中のα-1,4-結合を加水分解してデキストリンとし、さらに加水分解しexo-actingα-アミログルコシダーゼ20によってグルコースを分解する。これらの酵素の相乗効果は周知であり、これらの酵素は、植物バイオマス21中のセルロースなどの他の糖質結合剤に影響を及ぼすことなく、α結合グルカン様グリコーゲンであるデンプンの選択的加水分解に日常的に使用されている。放出されたグルコースは、酸素の過酸化水素への還元およびグルコースのラクトンへの酸化を触媒するグルコースオキシダーゼおよび過酸化水素からピンク色のキノンイミン染料を生成するペルオキシダーゼからなる酵素結合アッセイに従って定量的に検出され、フェノール化合物、および4-アミノアンチピリン22 。

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Microplate Reader&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza plate reader</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Beads beater</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>pH adjutment</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard for the glucose assay</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>For determination of protein concentrations</td></tr><tr><td>Aluminum drying trays, disposable</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>For determination of cell dry weights</td></tr><tr><td>D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>For determination of glucose concentrations</td></tr><tr><td>Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO tubes</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

シアノバクテリアは、光合成の間に主要な細胞内炭素およびエネルギー貯蔵としてグリコーゲンを蓄積する。最近の研究の進展により、生合成と異化のディールサイクル、レドックス調節、非コードRNAの関与を含む、グリコーゲン代謝の複雑なメカニズムが明らかになった。同時に、産物収量を増強するために、遺伝子操作されたシアノバクテリア中のグリコーゲンから望ましい産物に炭素をリダイレクトする努力がなされている。さまざまな精度と技術的な複雑さを伴い、シアノバクテリアのグリコーゲン含量を決定するためにいくつかの方法が使用されています。ここでは、標準的なライフサイエンス研究室で行うことができるシアノバクテリアのグリコーゲン含量の信頼できる測定のための詳細なプロトコールを提供します。プロトコールは、細胞溶解物からのグリコーゲンの選択的沈殿およびグリコーゲンの酵素的解重合によってグルコース単量体を生成し、これはグルコースオキシidase-peroxidase（GOD-POD）酵素結合アッセイを用いて測定した。この方法は、 Synechocystis sp。 PCC 6803およびSynechococcus sp。代謝工学で広く使用されている2つのモデルのシアノバクテリア種、PCC 7002。さらに、該方法は、野生型と調節エレメントまたはグリコーゲン生合成遺伝子に欠損を有する変異体との間のグリコーゲン含量の差異を首尾よく示した。

10mLの野生型シネコシスティス種。 PCC 6803を、OD 730nm値が約0.8に達するまで、光合成独立栄養条件下で増殖させた。細胞を回収し、pH8の50mM Tris-HClに再懸濁した.OD 730nm値を2-3に調整した。グリコーゲン含量は、上記のプロトコルに従って分析した。 OD 730nmあたりのグリコーゲン含量は、13± 1.8μg / mL / OD 730nm （ N = 12?...

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Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.9K ビュー.  Carlsberg Research Laboratory. ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。 

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Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

生化学

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

免疫・感染学

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are influenced by its structure. Hence, a suitable extraction method that isolates representative samples of glycogen is crucial to the study of this macromolecule. Compared to other extraction methods, a method that employs a sucrose density gradient centrifugation step can minimize molecular damage. Based on this method, a recent publication describes how the density of the sucrose solution used during centrifugation was varied (30%, 50%, 72.5%) to find the most suitable concentration to extract glycogen particles of a wide variety of sizes, limiting the loss of smaller particles. A 10 min boiling step was introduced to test its ability to denature glycogen degrading enzymes, thus preserving glycogen. The lowest sucrose concentration (30%) and the addition of the boiling step were shown to extract the most representative samples of glycogen.

An optimal sucrose concentration was determined for the extraction of liver glycogen using sucrose density gradient centrifugation. The addition of a 10 min boiling step to inhibit glycogen-degrading enzymes proved beneficial.

グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

生物学

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, leading to the biased characterization of glycogen fine molecular structure. To understand the dynamic changes of glycogen structures and the versatile functions of glycogen particles in bacteria, it is essential to isolate glycogen with minimal degradation. In this study, a mild glycogen isolation method is demonstrated by using cold-water (CW) precipitation via sugar density gradient ultra-centrifugation (SDGU-CW). The traditional trichloroacetic acid (TCA) method and potassium hydroxide (KOH) method were also performed for comparison. A commonly used lab strain, Escherichia coli BL21(DE3), was used as a model organism in this study for demonstration purposes. After extracting glycogen particles using different methods, their structures were analyzed and compared through size exclusion chromatography (SEC) for particle size distribution and fluorophore-assisted capillary electrophoresis (FACE) for linear chain length distributions. The analysis confirmed that glycogen extracted via SDGU-CW had minimal degradation.

Bacterial glycogen structure is greatly impacted by extraction methods which may result in molecular degradation and/or biased sampling. It is essential to develop methods to minimize these problems. Here, four extraction methods have been compared using size distribution and chain length distribution as key criteria for minimizing extraction artifacts.

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

Source: Wilson, W. A., <a href="https://app.jove.com/v/63046">Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

Source: Wilson, W. A., Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a ...

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

要約

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シアノバクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

グリコーゲンの生化学的滴定

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

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シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)法を用いたグリコーゲンのグルカン鎖長分布の決定

グリコーゲンの生化学的滴定

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

シアノバクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量