私たちは、私たちは蛍光分光計を使用することを可能にするため、彼の助けを博士ティエリPourcherに感謝しています。研究室では、リーグ国立コントルルがん（エキップのlabellisée）によって資金を供給され、協会はLAルシェルシュコントルルがん、研究所国立デュがん（INCA）を注ぐ、通信社国立ラ·ルシェルシュ、METOXIA（EUのプログラムFP7）、センターを注ぐA. Lacassagne、センター国立デラルシェルシュ科学研究、研究所国立·デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicaleとニース大学（ <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ）。我々は重要な読書と編集補正のために博士のMクリスティブラヒミ·ホーンに感謝します。

グリコーゲンの生化学的滴定 1。細胞溶解<ol><li>直径100mmディッシュあたり0.5〜2×10 6の濃度で種細胞。 </li><li>治療：細胞をインキュベート24、1％または0.1％のO 2、94％以上に設定したバグボックス嫌気ワークステーション（Ruskinnテクノロジーバイオトレース·インターナショナルplc、ジェンド、英国）における低酸素濃度（低酸素）が48、または72時間94.9％N 2及び5％CO 2。並行して、（21％O 2、5％CO 2）を正常酸素状態で細胞をインキュベートする。 （25 mMグルコース含有培地）、実験の時間中グルコース濃度の変動を最小限に抑えるために24時間毎に培地を変更してください。 </li><li>処理後、洗浄細胞は、培養培地からのグルコースの痕跡を除去するためにPBSで2倍。冷PBSで細胞をこすり取る。 </li><li> 5分間1,000 rpmで解決策を遠心分離、上清を捨て、PBSで一回ペレットを洗浄。ペレットを、先へ進む前に、-20℃で凍結することができる。</li><li> 100μlの蒸留水でペレットを再懸濁します。グリコーゲンアッセイキット（アブカム）を備えてグリコーゲンの加水分解緩衝液100μlを追加します。酵素を不活性化するために、5分間95℃で溶解物を沸騰させる。 </li><li>不溶性の生成物を除去する10分間13,000 rpmで溶解液をボルテックスし、遠心する。上清を保管してください。 </li><li>サンプル間のタンパク質含有量にグリコーゲンレベルを正常化する、タンパク質の定量はビシンコニン酸アッセイ（BCA-Interchim社）を用いて25〜35μlの上清を用いて行うことができる。 </li></ol>溶解物のいくつかは、細胞内フリーグルコース濃度を測定するために使用することができる。 2。グリコーゲンの加水分解<ol><li>加水分解酵素ミックス1μlの上清（ステップ1）の50μLを混合します。この混合物は、グルコアミラーゼが含まれています。室温で30分間インキュベートする。 </li><li>規格グリコーゲン（2 mg / ml）での希釈することにより検量線を作成し加水分解緩衝液中で10μg/ mlの溶液に、キットにup​​plied。次に、6つの別々の0有する管、4、8、12、16、および10μg/ mlの標準液20μlを調製し、0のグリコーゲンの濃度を与えるために加水分解緩衝液で最終体積50μlに各チューブに調整0.04 、0.08、0.12、0.16、および0.2μgの個/ ml。規格で加水分解酵素ミックスの1μlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li></ol>遊離グルコース濃度の値によって与えられる細胞株のバックグラウンドのグルコース濃度は、細胞中のグリコーゲンのレベルを決定する総グルコース濃度（グリコーゲン加水+遊離グルコースからグルコース）の値から減算されなければならない。 3。蛍光の開発と読書<ol><li>各条件について、（総グルコース濃度を測定するための遊離グルコース濃度及びつのチューブ（チューブ2,3）を測定するために、各チューブウィットつのチューブ（チューブ1）を調製HA加水分解されたグリコーゲンの別のボリューム）。 </li><li>チューブ1のステップ1の終了時に抽出された上澄み液15μlを追加します。 50μlの最終体積に完了するには加水分解緩衝液の35μlを加える。得られた蛍光は、遊離グルコース濃度が得られます。 </li><li>チューブ2（ステップ2）で得られた加水分解されたグリコーゲンのXを添加する。 50μlの最終体積に調節してください。サンプル容量（Xμl）を検量線の濃度を超えていない蛍光値を得るために、細胞密度および/ ​​または細胞型に応じて調整する必要がある。 </li><li>チューブ3で加水分解グリコーゲンの2 のXを添加する。 50μlの最終体積に調節してください。 </li><li>各チューブの開発バッファーの48.7μL、開発酵素ミックスを1μlと（グリコーゲンアッセイキットに付属）OxiRedプローブの0.3μLを混合することにより、サンプルおよび標準の開発ソリューションを準備します。例えば、2つの条件のために、チューブ12のためのミックスを調製S（標準のための6、遊離グルコースおよび総グルコース蛍光について4 2）。 </li><li>各チューブに、このミックスを50μl加え、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li><li>推奨されるように535 nmで587 nmの発光波長の励起波長で蛍光を測定し、励起および発光のため3nmのスリット。 </li></ol>

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

in vitroでのグリコーゲンの生化学的滴定は、細胞のグリコーゲン含有量の正確な定量が可能になります。いくつかの他の技術（グリコーゲン抗体を用いたPAS、免疫蛍光など ）と比較すると、この滴定は、非常に、特定の高感度かつ再現性がある。それは放射能が、蛍光分光計を必要としないので、この方法が便利です。しかし、この技術は、純粋に定量的であり、細胞内のグリ...

グリコーゲンは、多くの細胞型の細胞質中に存在するグルコース残基の多分岐ポリマーである。これは、細胞におけるエネルギー貯蔵の主要な形態の一つであり、グルコース代謝に重要な役割を果たしている。ほとんどの哺乳動物細胞は、急速に代謝ストレスの間に、解糖及びATP産生を促進するためにグルコースに分解することができ、店舗グリコーゲンを産生することができる。肝細胞は、それによって、身体へのグルコースの連続的な供給を提供し、血糖値を調節するために大量のグリコーゲンを産生する。対照的に、他の細胞（筋肉、赤血球など ）中のグリコーゲンの濃度が比較的低い。しかしながら、局所的に、これらの量は、細胞が急に栄養分を奪われた環境に曝露される短期的にエネルギーを提供するのに十分である。 グリコーゲン合成およびグリコーゲン分解は、すべての組織で同じ手順（ 図1）に従う。まず、グルコースグルコース輸送体（供給過剰）によって細胞に入り、急速ホスによるグルコース-1 - リン酸（G1P）へのグルコース-6 - リン酸（G6P）から変換された。 G1P次いで、UDP-グルコースに変更され、UDP-グルコースの炭素C1はグリコゲニン、グリコーゲンのアンカータンパク質のチロシン残基に結合している。この分子は、グリコーゲンプライマーと考え、グリコーゲン合成酵素を介した α（1→4）結合によって末端グルコースのUDP-グルコースの付加によって拡張されます。 11以上のグルコース残基の直鎖を形成する際に、最終的に、分枝酵素は、近くα（1→6）​​結合を介してチェーンの別のグルコースに6グルコース残基の最小によって構成され、端末オリゴ糖を転送します。このプロセスの繰り返しはターンごとに6.5グルコースを用いてらせんを形成分岐を含む大規模なフラクタル構造を提供します。グリコーゲンは協調作用によりグルコースに逆加水分解することができるα（1→6） ​​結合させ、枝やグリコーゲン分子のグルコースの最後の残基との間で結合されたα（1→4）グリコシドを加水分解し、グリコーゲンホスホリラーゼを加水分解する酵素を枝切りする。グリコーゲン分解と呼ばれるこの反応は、（ATP消費量を反映する）AMPのレベルを増加させることによって活性化され、グルコースおよびATP 2,3によって阻害される。 電子顕微鏡により、グリコーゲン分子は、多くの細胞型、直径15〜30ナノメートルのような遊離β粒子（またはグリコーゲン単粒子）に記載されている。例えば、肝細胞などの特定の細胞型において、β粒子は、80ナノメートルから200ナノメートル4の最大直径が変化するα粒子として知られている、ロゼットを形成するために複合体に組み立てることができる</SUP&gt;。これらのβ粒子はα粒子の大きなクラスターを形成するために結合されている方法は、まだ完全に解明されていない。いくつかの証拠は、β粒子は、共有結合5、水素結合によって、またはさらに、タンパク質-タンパク質相互作用6を介して結合することができることを証明する傾向がある。セルに格納されたグリコーゲンの量は、多くのパラメータに依存する：（I）グリコーゲン合成を開始するセル内グリコゲニンの量は、（II）タンパク質のリン酸化/脱リン酸化によって調節グリコーゲンシンターゼおよびホス活性;（III）濃度このような細胞による血管系およびグルコース取り込みからのグルコースの供給などのいくつかのパラメータに依存している細胞におけるグルコースの。グリコーゲン貯蔵緊密中間代謝物を介して、エネルギー代謝を調節するホルモンによって、および栄養感知シグナル伝達経路7で合成ホルモンのアロステリック調節によって調節される。 それがあることが重要ですよりよい全身および細胞レベルでのグリコーゲン代謝の重要性を理解するために、生物学的サンプル中のグリコーゲンを定量化することが可能。ここでは、グリコーゲンのためのin vitroアッセイでは、正確で再現性のある便利な生化学について説明します。この技術は、グリコーゲンの特異的加水分解の前後で定量化グルコース蛍光に基づいている。 他の方法は、細胞中のグリコーゲンのレベルを推定するために存在するが、それらのほとんどは、定量的ではない。細胞中のグリコーゲンの定量のために説明した第1の技術の一つは、8,9グリコーゲンへの[14 C] -グルコース取り込みの測定に基づいた。放射能の使用は、取り扱いが、このプロセスをより困難にするが、それはまた必要とする（これはグリコーゲンへと外側の枝に、分子のコア中のグルコース残基の分布を区別するのグルコース取り込み速度を提供するという利点を有している追加のβ-amylolySISおよびクロマトグラフィー工程）。別の技術は、より最近開発された、2 - NBDGの取り込みに基づいている（2 - {N-[7 - ニトロベンズ-2 - オキサ-1,3 - ジアゾール-4 - イル]アミノ} -2 - デオキシグルコース）グリコーゲン10への2 -デオキシグルコースの蛍光誘導体。測定された蛍​​光強度は、生成グリコーゲンの量を反映し、蛍光プレートリーダーで測定することができる。細胞内の蛍光の分布もまた、共焦点顕微鏡法によって評価することができる。 他の非定量技術の中で、過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）は、おそらく最も一般的です。それは固定細胞、パラフィン組織切片または凍結中のグリコーゲンの検出のために使用することができる。この組織学的手法の色以外、特に多糖類、糖脂質、糖タンパク質、セルロース、紫中性ムチン。この試験の特異性は、特異的にグリコーゲンを消化するジアスターゼ、を有する固定された細胞又は組織切片の処理により増加させることができる。その後、グリコーゲンレベルは、質的に（炭水化物、グリコーゲン高分子を除い変性）加水分解されたサンプルに加水分解されていない試料（すべて炭水化物修飾高分子）を比較することによって推定することができる。グリコーゲンの生化学アッセイとは異なり、PAS染色および顕微鏡分析は、細胞のある部分に拡散又は濃縮することができる細胞中のグリコーゲンの分布に関する情報を提供する。 PAS染色は、異なる条件間グリコーゲン蓄積の差を推定するにもかかわらず、しかし、それは定量的ではない11。 モノクローナルマウス抗体は、もともと抗原がインビトロ 12 で細胞中のグリコーゲンと、精製されたグリコーゲンと反応することが示されているように、下顎の下顎頭軟骨を用いて製造。この抗体は、グリコーゲン関連の糖鎖を認識するように、PAS染色よりも具体的な方法で免疫組織化学によるグリコーゲンの検出に有用なツールです。 </p&gt; 電子顕微鏡法は、細胞およびグリコーゲン貯蔵の程度の評価におけるグリコーゲンの粒子の可視化を可能にする別の技術である。実際には、グリコーゲンβ粒子は電子密度の高い顆粒1として、電子顕微鏡で簡単に認識可能である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

グリコーゲンは、脊椎動物におけるグルコースの主なエネルギッシュなポリマーであり、全身の代謝にだけでなく、細胞の代謝に重要な役割を果たしている。グリコーゲンを検出するための多くの方法は、すでに存在しているが、わずか数は定量的である。ここでは、グルコアミラーゼによりグルコースにグリコーゲンの特異的分解に基づいているアブカムグリコーゲンアッセイキットを用いた方法について説明します。グルコースは、その後、特異的に蛍光を生成するOxiRedプローブと反応生成物に酸化される。滴定は、正確で高感度であり、細胞抽出物又は組織切片上で達成することができる。しかしながら、他の技術とは対照的に、細胞中のグリコーゲンの分布に関する情報を与えない。この技術の一例として、ここでは低酸素状態（1％O 2）に対する2つの細胞系におけるグリコーゲンの滴定、通常酸素下でインキュベートしたチャイニーズハムスター肺線維芽細胞をCCL39およびヒト結腸癌LS174（21％O 2）を表す。我々は、低酸素症がSIGあるという仮説を立てた細胞が1を生き残るためにグリコーゲンを合成して保存するための準備をNAL。

腫瘍細胞に対する腫瘍シグナルの酸素（低酸素）の低レベル生き残るように、その後の栄養枯渇を処理するためのエネルギーを蓄積する必要がある。グリコーゲンは、哺乳動物細胞中のグルコースの主なエネルギーのポリマーであるとして、我々は、低酸素状態におけるグリコーゲン貯蔵の調節を研究した。 表1、表2、および図3に示すように、細胞溶解物中のグリ?...

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Biochemical Titration of Glycogen In vitro

ここでは、in vitroでのグリコーゲンの滴定のために、正確で再現性のある便利な生化学的方法を記載する。この手法は、アブカムグリコーゲンアッセイキットを使用し、蛍光により滴定グルコースとグルコースへのグリコーゲンの連続加水分解に基づく。

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.3K ビュー.  University of Nice - Sophia Antipolis. ここでは、in vitroでのグリコーゲンの滴定のために、正確で再現性のある便利な生化学的方法を記載する。この手法は、アブカムグリコーゲンアッセイキットを使用し、蛍光により滴定グルコースとグルコースへのグリコーゲンの連続加水分解に基づく。 

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いたヒトコロナウイルスの滴定

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

生物学

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

ゼブラフィッシュの脳室注入

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

グリコーゲンの生化学的滴定

要約

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免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いたヒトコロナウイルスの滴定

ゼブラフィッシュの脳室注入

バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

グリコーゲンの生化学的滴定

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免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いたヒトコロナウイルスの滴定

ゼブラフィッシュの脳室注入

バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

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大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

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内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で