タマラ Zeric 本多光子画像の入手を助けるため。脳と行動、パーキンソン病と JPB 基礎、R01 MH108186 と R01 DA07418 でサポートされています。F31 交わり 1F31MH109293 01A1 S c

すべてのプロシージャを含む動物は、基準に従って行われたコロンビア大学医療センター機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) で設定します。ケタミンによる麻酔下頚部転位による安楽死を行った 100 mg/kg とキシラジン 10 mg/kg 腹腔内注入します。滅菌方法ですべての手術を行った (外科医はヘッド キャップ、マスク、滅菌手袋、きれいな使い捨て白衣を着ていた) 手術器具が利用ごとオートクレーブと。
1. 術前の手順
<ol><li>オートクレーブ無菌性を確保するためのすべての手術器械。</li>
	<li>イソフルラン (誘導 4%、手術のため 1.5-2%) と C57bl6 マウスを麻酔します。適切な麻酔深度を確保するため 10 分毎の後足の指をピンチします。発声や後肢の後退が見られる場合は、麻酔を増やします。</li>
	<li>乾燥を防ぐために目に獣医の目の潤滑剤を適用します。</li>
	<li>ハードジェルの除去または電気かみそりとシェービングで 3 分アプリケーションでは、頭皮に髪の毛を削除します。</li>
	<li>加熱パッドまたは校正水循環毛布 38 ° C に設定上の脳定位固定装置のフレームにマウスを置き</li>
	<li>術前鎮痛を提供する皮下ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を管理します。</li>
	<li>クロルヘキシジンや betadine と 70% エタノール綿の先端アプリケータを使用して 3 つの交互になるアプリケーションと頭皮を消毒します。</li>
	<li>局所麻酔を提供するために頭皮の下には、生理食塩水で希釈ブピバカイン 50% の 100 mL を注入します。</li>
</ol>2. 圧電頭蓋ウィンドウ手術
<ol><li>オートクレーブ滅菌の手術器具を使用して、サークルを削除 1 cm 頭皮の頭蓋骨に切り出して円形のパターンで手術用ハサミ。頭蓋骨骨膜組織、骨の上に公開することから頭皮を持ち上げます。</li>
	<li>鉗子の先端を使用して、任意の残りの骨膜の組織の明確な露出骨をこすり。これは歯科用のセメントが後該当しないことを確認することが重要です。</li>
	<li>最低の設定で振動する圧電手術ユニットを設定します。高設定が強烈な振動のための血管を破る可能性がありますに注意してください。</li>
	<li>ハンドピース滅菌の円形先端を修正します。 注: 4 mm の円形先端手術に適しています。大規模なチップのサイズは、ウィンドウ全体を同時に薄くことができるよう手術の速度に貢献します。</li>
	<li>氷冷人工脳脊髄液 (アプライド) と 10 mL のシリンジを入力し、圧電ハンドピースを持っていない手でそれを保持します。</li>
	<li>また 1 mL/分の速度で頭蓋骨の上に注射器からアプライドを滴下して頭蓋骨を灌漑、頭蓋骨を置いた蠕動性ポンプを使用して他の手の使用を解放します。 注: 冷たいアプライドと灌漑は高周波振動から摩擦による過熱を防ぐために重要です。</li>
	<li>そっと光円運動と頭蓋骨に振動外科先端を適用 (1 につき 3 円 s)、薄い頭蓋骨準備 (5 〜 10 分) を実行する所望の深さに骨の薄い。 注: ここでは、4 mm windows が行われた 20 μ m に薄くなっていた。ただし、ウィンドウのサイズは、外科の先端の大きさによって異なります。骨の厚さは、頭蓋骨に先端を適用する時間の長さに基づいて所望の深さに調整できます。</li>
	<li>優しくハンドピースの角度を調整し、頭蓋骨を均一に薄く頭蓋骨に圧力を適用するときの先端の角度を変更します。</li>
	<li>後ろに細い骨を余すことがなく完全な骨削除を実行するには、亀裂が表示されるウィンドウ領域の周りまで骨を薄きます。薄い骨の残りのフレークを鉗子で基になる硬膜を損傷することがなく削除します。</li>
	<li>冷たいアプライドで止血コラーゲン泡の 1 mm の部分を浸します。鉗子でウェットの泡を押しながら薄い頭蓋骨の上に置きます。約 30 のため薄い頭蓋骨の上に座ることができます任意のマイクロを停止する s の開発から出血します。</li>
	<li>鉗子を使用すると、骨に間伐されているウィンドウの上横 4 mm ガラス基板を配置します。</li>
	<li>小さなプラスチック製や木製綿の先端アプリケータのバックを使用して、場所にウィンドウを保持するために頭蓋骨に歯科アクリルの約 100 μ L を適用。</li>
</ol>3. ポスト外科ケア
<ol><li>手術器具からマウスを削除し、回復のため温水ケージに配置。モニターは、それまで継続的にそれは (通常の機動性、歩行、動作、評価される) 完全な意識を取り戻しました。</li>
	<li>動物のグルーミング、食糧、および水消費、警護行動 (例えば足を引きずって、背を丸めて姿勢) または侵略を増加、活性低下を含む手術後の痛みの症状のため 3 日間 1 日 2 回を評価します。それは完全に回復するまでは、動物を他の動物の会社に返されません。</li>
	<li>ブプレノルフィンを管理 (0.05-0.1 mg/kg) 3 日間手術後鎮痛 8-12 h として皮下。裂、炎症、感染の兆候に密接に術後ウィンドウの領域を監視します。動物は給餌やグルーミング行動基準に戻らない、可能な介入や安楽死について獣医に相談します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex.">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+transparent+cranial+window+based+on+skull+optical+clearing.">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging.">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li><li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+in+implantology:+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique.">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li><li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation:+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure.">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li><li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+microsurgery:+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement.">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li><li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. 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J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

開示はありません。

手術は、手術のヒントを変更することによって変更できます。ハンドピースに適用できるヒントのさまざまなサイズがあります。サイズや先端の形状を変更すると、異なるサイズの窓になります。4 mm のヒントに加えまた 3 mm のチップを試みたし、それがまたうまく発見します。氷で灌漑があっても我々 は基になる硬膜の損傷につながる骨のあまりにも多くの熱を引き起こしていると書き込み集中して振動のため (約 0.25 mm) が狭すぎるがヒントで良い結果を得ることができませんでした冷たいアプライド。我々 は、使用可能なその他のヒントの多くを試していないと見込んで他の実験室はこれらの異なるヒント用の新しいアプリケーションを見つけることができます。手術は比較的簡単ですが、我々 は、トラブルシューティングが必要な場合がありますいくつかの手順があることがわかった。最初は、振動のヒントが多くの可視性を減少し、手術の手順を薄く骨の間に骨の深さを見極めの難しさを生成アプライドで乱流を生成することです。勧めしますどのように薄い骨は、骨の側に滅菌綿棒を用いて頭蓋骨とウィンドウを乾燥するための休憩を取るにも困難である場合。面の粗さは薄い骨にダメージを与えるので、ウィンドウに直接綿棒は適用されません。深さをチェックした後に、アプライドを再適用して手術を続行します。また、硬膜への損傷がある場合先端にあまりにも多くの圧力を置く外科医により通常は分かった。ハンドピースをやさしく保持、以下の力を適用するこの問題は解決可能性があります。外科医は、骨の先端を削りは強制的に、それは薄い骨でブレークが発生し、頭蓋骨に損傷を与えます。最後に、骨が薄くなる、基になる硬膜が傷ついた表示される場合、余分な熱振動による可能性が高いです。アプライドの流れの速度を増加すると、この問題が修正されます。
フェーザの主な制限は、ハンドピースは、骨を薄くことができますが、硬膜上すべての骨を削除することはできません。ダイヤモンド コーティング先端が小さな大まかなバンプ。頭蓋骨を薄くために必要な摩擦は、硬膜をすり減らすし、すべての骨を削除するために使用された場合の出血を引き起こします。したがって、残りの薄層を削除する鉗子の使用が必要です。薄い頭蓋骨を介してイメージングが少なく炎症やミクログリアやアストロ サイトの以下の増殖を生成するかどうかの進行中の討論がある、いくつかのケースで骨の残りを持たないウィンドウは、最寄りなどイメージング3 の大きい深さを提供するために.
我々 は、マウスにおける多光子イメージングに備えて頭蓋ウィンドウを最適化しています。フェーザは、我々 の知識の光イメージングのための齧歯動物の頭蓋ウィンドウ手術する圧電技術の最初のアプリケーションです。我々 は、マウスにおける圧電手術の使用が増加速度の利点を共有し、また人間7,8,9,10で報告された副作用を減少を見つけます。圧電デバイスの使用率より速く手術 (図 2 a) と高速回転と比較した場合の出血の有害事象の少ないドリル (図 2 b)。我々 もわかった、我々 のラボでフェーザ頭蓋ウィンドウ手術に対する従来のアプローチよりも学ぶ術が容易に。速度の利点と使いやすさは、外科医の間で異なる可能性があります。薄い頭蓋骨準備通常フェーザ アプローチは通常、10 分未満を必要としながらドリルとメス2骨を薄くための 30-45 分が必要です。
フェーザを使用した windows のレイヤー 4 エンコード カルシウム インジケーター JRGECO1a 関連付けられているアデノ ウイルス発現されていた大脳皮質の錐体細胞内カルシウム過渡現象をイメージできる我々 がわかった (AAV9。Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). 我々 も見つかりましたが、ロータリー ドリルやメスを使用した薄い頭蓋骨の頭蓋ウィンドウと比較して、イメージングの領域だったロータリー ドリルを使用した薄い頭蓋骨が大きく、メスは 20 μ m 径2 の画像ウィンドウ.フェーザ、我々 はすぐに 3-4 mm の領域を薄くことができた。これは、ポート4報告画像ウィンドウに似ています。この大きなウィンドウは、歯科用ドリルやメスを使用した薄い頭蓋骨 windows に対して報告された急速なイメージングの利点を保持します。また、フェーザと準備ウィンドウをすぐにイメージできる、伝統的な骨削除ではなくウィンドウが最適な状態にすることができます前に癒すために週を必要があります windows イメージ3。
この手法は、硬膜の下で血管内の血流の変化を研究に適用できます。重要な今後の研究は、頭蓋の] ウィンドウの他の方法をフェーザの免疫反応性を比較することです。これはフェーザが既存のメソッドと比較して少ないの炎症を生成するかどうかを決定することが重要でしょう。我々 は、ここに記載されて圧電手技の頭蓋 windows を実行し、多光子イメージングで生体を正常に使用するより多くのラボになります願っています。
ハンドピースが最低の設定で振動に設定されていると、アプライドは一定の割合で灌漑されていることを確認します。冷たいアプライドを常に適用する必要がありますまたはそれはヒートアップし、硬膜に損傷を与えます。アプライド必要があります少なくとも 1 mL/分注射器を使用するか、手で開催されたまたはハンドピースで組み込みの灌漑ではなく、蠕動ポンプ使用率で適用することがわかった。ハンドピースの灌漑システムはアプライドをあまりにも強制的に排出し、視認性が大きく落ちるがあまりにも多くの乱流を生成します。

生体内イメージング多光子の齧歯動物を準備する骨手術神経科学における重要な手法となっています。除去や骨の菲薄化多光子顕微鏡と光学イメージングのマウスを準備する必要は。この手術は、基になる硬1を公開する骨の領域を完全に削除または硬2から完全に削除することがなく骨部を薄くことによって実行されます。薄い頭蓋骨アプローチ以下の炎症やミクログリア3の活性化が生じるが、イメージング、イメージング ウィンドウ サイズが小さく (200 μ m) と骨再生2 による視覚化されるウィンドウ中に限られた期間の浅い深さを提供しています.洗練された、強化ガラス窓 (ポート) の画像サイズと撮影実施期間を増やすことができますが4を実行することは困難です。
両方の現在の手術は、薄いまたは頭蓋骨から骨を削除する高速回転ドリルを使用します。薄い頭蓋骨テクニックもドリル後骨2をさらに薄くメスを使用します。ポート技術には、高速研磨砥粒4の余分なステップが必要です。高速回転ドリル、空気動力タービンまたは電気モーターにより、高速で回転するドリル ビット。ロータリー ドリル セクション骨と軟組織、硬膜の損傷・血管の基になるリスクがあります。手術の成功は、外科医のスキルに依存します。これらのウィンドウは、機械的手術方法準備、加え光学さまざまなソリューションと頭蓋骨をクリアする化学方法は先進5,6をしてきた。しかし、圧電手術は手術の機械的方法で、私たちの比較ここでは他の機械的方法に制限されます。
圧電手術デバイスせず有害な基になる軟部組織石灰化骨を分解する超音波振動を利用し、従って急速に骨の大面積を薄くためのアプローチを提供します。圧電手術用ハンドピースでタービンがセラミック ディスクのスタックによって置き換えられ、電流を適用すると、ディスクは、超音波の周波数で振動します。振動は、骨なし有害な軟部組織の種類を差別しないロータリー ドリル優位をカットするコーティングされたヒントをダイヤモンドにハンドピースによって転送されます。圧電手術もともと人間用トマソ ・ Vercellotti が開発、歯科で改善と頭蓋顔面外科7,8,9,10,11 につながっています。.
圧電手術はラットで、骨切り術を作成する使用されています、磁気共鳴イメージング (MRI) と従来の歯科用ドリル12よりも大幅に少ないダメージを生成する組織によって発見されました。著者らは、柔らかい脳組織に近い骨を除去するため圧電手術が無事締結。マウス、しかしより簡単に破損している薄い硬、その研究は、慢性の光イメージングのため windows を準備しなかった。慢性的なイメージングは、血管が損傷していないことウィンドウの下血栓を形成しないことが必要です。硬膜への損傷は、クラウド、ウィンドウを引き起こす炎症につながるし、反応性アストロ サイトの増殖およびミクログリアをアクティブにします。ここで我々 は薄い頭蓋骨と完全骨除去頭蓋 windows 慢性的な撮影に適したを作成するマウス用圧電手術を最適化してきました。高速回転ドリルで頭蓋ウィンドウ手術にこの手技を比較しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Piezosurgery Touch</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>5120062</td>
			<td>Piezosurgery GP model has the same settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>3370019</td>
			<td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for irrigation.</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-77120-42</td>
			<td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene Ultrafoam</td>
			<td>Bard-Davol</td>
			<td>1050020</td>
			<td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C&#38;B Metabond</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S380</td>
			<td>Much stronger than regular dental acrylic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube opthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>
			<td>UPENN Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

多光子顕微鏡は、広く生体内神経細胞イメージングに適応されています。繰り返されるイメージングには、頭蓋ウィンドウの注入または頭蓋骨の繰り返される間伐が必要です。頭蓋のウィンドウは通常手術高速回転ドリルで、多くの調査官はドリルが繊細な硬膜や血管を損傷するを防ぐために挑戦それを見つけます。広範なトレーニングと実践の基礎となる組織を損傷することがなく骨を削除する必要が、こうして頭蓋窓手術を困難、時間のかかる、でき、組織の損傷を作り出します。歯科口腔外科に使われた、圧電外科は軟組織を傷つけることがなく骨を削除する超音波振動を利用しています。我々 は多光子イメージングに備えてマウス頭蓋窓手術を改善するために圧電手術を適用する手法を開発しました。私たちのラボ内で比較検索メソッドは手術時間が短くて済み、ロータリー ドリルで頭蓋ウィンドウ手術よりも硬膜出血による合併症の低い平均速度を持っています。

圧電手術前、に頭蓋骨から任意の残留骨膜を削除します。頭蓋骨が不透明で滑らかな (図 1 a)、外科医は、圧電手術を始める可能性があります。ピエゾ先端の振動で骨を取り外しときは、氷で頭蓋骨を灌漑するため重要です冷たいアプライド。アプライド (図 1 b) の下部先端から 1 mm が浸水した場合に、適切な灌漑が実現されます。適切な潅漑なし骨は過熱し、脳に損傷を与えます。外科医によって選ばれた所望の深さに頭蓋骨が薄くなって後可能性がありますいくつかの残留の骨にある血管から出血します。すべての出血を急激に中止するためにウィンドウの領域にアプライドに浸したコラーゲン泡の小さな 1 mm の部分を適用します。約 30 の頭蓋骨の上に座るコラーゲンを聞かせて s (図 1 c)。コラーゲンの泡を削除すると、硬膜の血管の明確に可視化をできるように、透明ウィンドウが表示されます。硬膜は、大きなあざせずそのままになります。(図 1 d)。赤と炎症を起こしている硬膜がある場合手術中に先端に適用されるあまりにも多くの圧力から壊れた血管のためそうです。新しいウィンドウを保護し慢性的なイメージングのための準備、領域にガラス基板を配置しなければなりません。正しく適用ガラス基板はウィンドウの上に座ってゆっくりと地域への損傷は行われません。ガラス基板は、ウィンドウ全体をカバーする必要があります。頭蓋骨にガラス基板を正しく適用すると、ウィンドウが半透明ガラスの下のままになります。硬膜の血管をすべてまだ目に見える (図 1e) になります。歯科用アクリルは、頭蓋骨の表面にそれを完全に遵守するガラス基板周り適用する必要があります。ガラス基板のエッジも歯科アクリル (図 1 階) で説明する必要があります。
手術 (図 2 a) あたり約 10-12 分を取って圧電手術は通常従来の頭蓋窓よりもはるかに高速であることがわかった。また、あざや出血 (図 2 b) の目によって観測された硬膜による以下の合併症があったことが分かった。適切に準備ウィンドウは、皮質ニューロンの生体内での蛍光プローブの多光子イメージングになります。レイヤー 4 皮質ニューロンの細胞体の赤いカルシウム インジケーター JRGECO1a をイメージしました (図 3 a-3B)。フェーザを使用した窓からこれらの細胞体のカルシウム濃度を観察すること。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> 図 1: 圧電手術。(、) 頭蓋骨フェーザの適切が準備された後。滑らかできれいな表面を残し、すべての骨膜の組織が削除されました。(b) 進行中のフェーザの代表的なイメージ。下部振動外科先端が氷の水没から 1 mm 冷たいアプライド。流体は、1 mL/分の速度で頭蓋骨に適用されます。光の円運動が頭蓋骨に適用され、超音波振動で骨を薄きます。(c) 頭蓋骨を薄めた後、コラーゲン泡の 1 mm の円形の部分はアプライドが骨から任意の微小出血を停止するウィンドウの残りの部分できる寒さに浸した。すべてそのまま血管の半透明 dura (d)、正常にウィンドウが表示されます。目に見える損傷や脳の表面にあざがあります。(e) ガラス基盤は脳の表面を保護するためにウィンドウの上に配置されます。(f) 歯科アクリルは完全に窓にガラス基板を修正する頭蓋骨に適用されます。棒 1 mm すべてのイメージのスケールです。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> 図 2。フェーザまたは歯科訓練の成功率の比較はドリル手術です。(A) 手術あたりの平均時間はフェーザの歯科用ドリル手術よりも低い (p < 0.05、2 尾 t 検定) n = グループあたり 30 手術と外科医あたり 10 手術の平均します。(B) (350 X ズームを設定する目的で外科医の目によって観測された硬膜に出血や目に見える破損はないと定義) 成功の手術の割合はフェーザ歯科用ドリルの手術よりも高い (n = 30 手術、グループごとに 1 つž 検定試験)。エラー バーが表示の SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> 図 3。多光子イメージング体内頭蓋窓から薄くフェーザと。(A) カルシウム赤カルシウム インジケーター JRGECO1a で観測されたトランジェントをマウスの大脳皮質の生体の 4 層錐体細胞でイメージしました。スケールバー = 100 μ m。 (B) 同じウィンドウがレイヤー 4 運動皮質の異なる領域。Headfixed マウス 3 mm 窓フェーザと準備を。スケール バー = 30 μ m. 多光子顕微鏡で Imaged、40 × 対物、1040 nm 励起波長。

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

圧電の手術は人間の口腔、歯科の手術での改善につながっています。マウスの骨手術用圧電手術を最適化するためにプロトコルを開発しました。

ピエゾ高精度手術小片除去 (フェーザ): マウスの改良された頭蓋ウィンドウ術のテクニック

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

piezo-high-accuracy-surgical-osteal-removal-phasor-technique-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K ビュー.  Columbia University Medical Campus. 圧電の手術は人間の口腔、歯科の手術での改善につながっています。マウスの骨手術用圧電手術を最適化するためにプロトコルを開発しました。

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

神経科学

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can produce a rewarding effect that strengthens action-outcome associations and reinforces future behavior directed at obtaining these foods. Increasing evidence that the rewarding effects of energy-dense foods play a profound role in overeating and the development of obesity has heightened interest in studying the genes, molecules and neural circuitry that modulate food reward1,2. The rewarding impact of different stimuli can be studied by measuring the willingness to work to obtain them, such as in operant conditioning tasks3. Operant models of food reward measure acquired and voluntary behavioral responses that are directed at obtaining food. A commonly used measure of reward strength is an operant procedure known as the progressive ratio (PR) schedule of reinforcement.4,5 In the PR task, the subject is required to make an increasing number of operant responses for each successive reward. The pioneering study of Hodos (1961) demonstrated that the number of responses made to obtain the last reward, termed the breakpoint, serves as an index of reward strength4. While operant procedures that measure changes in response rate alone cannot separate changes in reward strength from alterations in performance capacity, the breakpoint derived from the PR schedule is a well-validated measure of the rewarding effects of food. The PR task has been used extensively to assess the rewarding impact of drugs of abuse and food in rats (e.g.,6-8), but to a lesser extent in mice9. The increased use of genetically engineered mice and diet-induced obese mouse models has heightened demands for behavioral measures of food reward in mice. In the present article we detail the materials and procedures used to train mice to respond (lever-press) for a high-fat and high-sugar food pellets on a PR schedule of reinforcement. We show that breakpoint response thresholds increase following acute food deprivation and decrease with peripheral administration of the anorectic hormone leptin and thereby validate the use of this food-operant paradigm in mice.

The present report details the protocol employed to measure the rewarding effects of high-fat food in mice using a progressive ratio operant conditioning task.

プログレッシブ比マウスの嗜好性は高脂肪·高砂糖食の応答

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

円窓膜を介してマウスインナーイヤーにウイルスにより媒介遺伝子送達のための手術方法

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous deoxyhemoglobin as an endogenous contrast agent to detect changes in blood-level-dependent oxygenation (BOLD effect). We combined fMRI with a novel robotic device (MR-compatible hand-induced robotic device [MR_CHIROD]) so that a person in the scanner can execute a controlled motor task, hand-squeezing, which is a very important hand movement to study in neurological motor disease. We employed parallel imaging (generalized auto-calibrating partially parallel acquisitions [GRAPPA]), which allowed higher spatial resolution resulting in increased sensitivity to BOLD. The combination of fMRI with the hand-induced robotic device allowed precise control and monitoring of the task that was executed while a participant was in the scanner; this may prove to be of utility in rehabilitation of hand motor function in patients recovering from neurological deficits (e.g., stroke). Here we outline the protocol for using the current prototype of the MR_CHIROD during an fMRI scan.

We performed functional MRI using a novel MRI-compatible hand-induced robotic device to evaluate its utility for monitoring hand motor function in individuals recovering from neurological deficits.

手のグリップの欠陥から回復する個人のリハビリテーションを評価する新しいMRI互換手誘導ロボット装置と連動した機能MRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) remain unclear. In order to adequately study the attributes of endolymphatic hydrops, such as the origins of low-frequency hearing loss, a reliable model is needed. The guinea pig is a&#160;good model because it hears in the low-frequency regions that are putatively affected by endolymphatic hydrops. Previous research has demonstrated that endolymphatic hydrops can be induced surgically via intradural or extradural approaches that involve drilling on the endolymphatic duct and sac. However, whether it was possible to create an endolymphatic hydrops model using an extradural approach that avoided dangerous drilling on the endolymphatic duct and sac was unknown. The objective of this study was to demonstrate a revised extradural approach to induce experimental endolymphatic hydrops at 30 days post-operatively by obliterating the endolymphatic sac and injuring the endolymphatic duct with a fine pick. The sample size consisted of seven guinea pigs. Functional measurements of hearing were made and temporal bones were subsequently harvested for histologic analysis. The approach had a success rate of 86% in achieving endolymphatic hydrops. The risk of cerebrospinal fluid leak was minimal. No perioperative deaths or injuries to the posterior semicircular canal occurred in the sample. The presented method demonstrates a safe and reliable way to induce endolymphatic hydrops at a relatively quick time point of 30 days. The clinical implications are that the presented method provides a reliable model to further explore the origins of low-frequency hearing loss that can be associated endolymphatic hydrops.

This article demonstrates an extradural approach to obliterate the guinea pig endolymphatic sac and injure the endolymphatic duct with a fine pick in order to induce experimental endolymphatic hydrops.

モルモットの内リンパ性水力を誘導する改訂された外科的アプローチ

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...