Name: piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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Tamara Zeric per aver contribuito a ottenere l'immagine multifotonica in questa carta. Supportato da cervello & comportamento, morbo di Parkinson e JPB fondazioni, MH108186 R01 e DA07418 R01. F31 fellowship 1F31MH109293-01A1 a C. S

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti secondo gli standard stabiliti dalla Columbia University Medical Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). L'eutanasia è stata eseguita tramite dislocazione cervicale in anestesia con ketamina 100 mg/kg e xilazina iniettato intraperitonealmente 10 mg/kg. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in modo sterile (chirurgo indossava tappo di testa, maschera viso, guanti sterili e camice da laboratorio monouso pulito) e strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave tra ogni uso.
1. prechirurgiche passaggi
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici per garantire la sterilità.</li>
	<li>Anestetizzare topi C57bl6 con isoflurano (4% per induzione e 1.5-2% per la chirurgia). Pizzicare la punta posteriore ogni 10 min per assicurare la corretta profondità dell'anestesia. Aumentare l'anestesia se è visto ritrazione vocalizzazione o dell'arto.</li>
	<li>Applicare il lubrificante veterinario occhio agli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sopra il cuoio capelluto con un'applicazione di 3 min di gel per capelli rimozione o dalla rasatura con un rasoio elettrico.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella cornice stereotassica su un rilievo di riscaldamento o coperta di ricircolo acqua calibrato impostata su 38° C.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per fornire l'analgesia prechirurgica.</li>
	<li>Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni alternati di clorexidina o betadine ed etanolo al 70% utilizzando un batuffolo di cotone con punta applicatore.</li>
	<li>Iniettare 100 mL di bupivacaine diluito 50% in soluzione salina sotto il cuoio capelluto per fornire l'anestesia locale.</li>
</ol>2. piezoelettrico finestra cranica chirurgia
<ol><li>Utilizzando strumenti chirurgici sterili in autoclave, rimuovere un cerchio di 1 cm del cuoio capelluto sopra il cranio di taglio con forbici chirurgiche in un modello circolare. Sollevare il cuoio capelluto fuori del cranio esponendo il tessuto periostio sopra l'osso.</li>
	<li>Utilizzare la punta del forcipe per raschiare l'osso esposto chiaro di qualsiasi tessuto restante del periostio. Questo è importante assicurare che il cemento dentale non cadrà più tardi.</li>
	<li>Impostare l'unità di chirurgia piezoelettrica a vibrare l'impostazione più bassa. Si noti che le impostazioni più alte possono rompere vasi sanguigni a causa di intense vibrazioni.</li>
	<li>Difficoltà la punta circolare sterile al manipolo. Nota: La punta circolare di 4 mm è adatta per interventi chirurgici. Il formato di punta grande contribuisce alla velocità della chirurgia come l'intera finestra può essere assottigliata simultaneamente.</li>
	<li>Riempire una siringa da 10 mL con ghiaccio freddo cerebrospinale artificiale (ACSF) e tenerlo in mano che non impugna il manipolo piezoelettrico.</li>
	<li>Irrigare il cranio di sgocciolatura ACSF da siringa il cranio ad un tasso di 1 mL/min in alternativa, utilizzare una pompa peristaltica, posizionata sopra il cranio per liberare l'uso di altra mano. Nota: Irrigazione con ACSF freddo è importante per prevenire il surriscaldamento dovuto all'attrito dalle vibrazioni ad alta frequenza.</li>
	<li>Applicare delicatamente la punta vibra chirurgica al cranio con un leggero movimento circolare (3 cerchi per 1 s) e sottile dell'osso alla profondità desiderata per eseguire una preparazione cranio sottile (5-10 min). Nota: Qui, windows 4 mm sono state fatte che sono state assottigliate a 20 µm. Tuttavia, la dimensione della finestra variano con la dimensione della punta chirurgica. Lo spessore dell'osso può essere regolata fino alla profondità desiderata in base alla lunghezza del tempo trascorso applicando la punta al cranio.</li>
	<li>Delicatamente, regolare l'angolazione del manipolo e cambiare l'angolo della punta, esercitando pressione al cranio per fluidificare il cranio uniformemente.</li>
	<li>Per eseguire una rimozione completa dell'osso senza lasciare alcun osso sottile dietro, sottile dell'osso fino a quando le crepe sono visibili intorno alla zona di finestra. Rimuovere le rimanenti scaglie di osso sottile con le pinzette senza danneggiare il sottostante dura.</li>
	<li>Immergere un pezzo di 1 mm di schiuma di collagene emostatico in ACSF freddo. Tenere la schiuma bagnata con una pinza e posizionarlo sul cranio sottile. Lasciare riposare sul cranio sottile per circa 30 s per interrompere qualsiasi micro sanguina in via di sviluppo.</li>
	<li>Utilizzare pinze per posizionare un coprioggetto in vetro 4 mm lateralmente sopra la finestra che è stata assottigliata nell'osso.</li>
	<li>Utilizzare il retro di un cotone piccolo di plastica o di legno con punta applicatore per applicare circa 100 µ l di acrilico dentale al cranio per tenere la finestra in posizione.</li>
</ol>3. post chirurgico cura
<ol><li>Rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico e metterlo in una gabbia riscaldata per il recupero. Monitor continuamente fino a quando ha riguadagnato la coscienza completa (valutato da comportamento, andatura e mobilità normale).</li>
	<li>Valutare gli animali due volte al giorno per tre giorni per manifestazioni del dolore post-operatorio, compresa l'attività in diminuzione, toelettatura, cibo e consumo di acqua, custodire il comportamento (ad es. zoppicando o una postura ricurva) o aumentata aggressività. Non restituire l'animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea come un analgesico 8 – 12 h dopo l'intervento chirurgico per 3 giorni. Monitorare l'area della finestra molto attentamente dopo la chirurgia per deiscenza, infiammazione e segni di infezione. Se l'animale non tornare alla linea di base di alimentazione e governare i comportamenti, consultare un veterinario per quanto riguarda i possibili interventi o l'eutanasia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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Non ci sono nessun informazioni integrative.

La chirurgia può essere modificata cambiando la punta chirurgica. Ci sono molti formati differenti della punta che possono essere applicati al manipolo. Modificare le dimensioni o la forma della punta si tradurrà in finestre di dimensioni diverse. Oltre la punta di 4 mm, abbiamo anche provato una punta di 3 mm e trovato che ha anche funzionato bene. Anche con irrigazione con ghiaccio freddo ACSF, non eravamo in grado di ottenere buoni risultati con le punte che erano troppo strette (circa 0,25 mm) a causa di vibrazioni concentrate causando troppo calore e bruciare l'osso conseguenti danni al sottostante dura. Non abbiamo provato la moltitudine di altri suggerimenti che sono disponibili, e ci aspettiamo che altri laboratori possono trovare nuove applicazioni per questi consigli diversi. Mentre la chirurgia è relativamente semplice, abbiamo trovato che ci sono diversi passaggi che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. Il primo è che la punta vibra produce un sacco di turbolenza in ACSF, che diminuisce la visibilità e produce difficoltà nell'accertare la profondità dell'osso dell'osso assottigliamento passo della chirurgia. È consigliabile che se è troppo difficile vedere quanto l'osso è sottile, prenditi una pausa per asciugare il cranio e la finestra applicando un tampone di cotone sterile al lato dell'osso. Non applicare il tampone di cotone direttamente alla finestra, dal momento che la superficie ruvida è dannoso per osso sottile. Dopo aver controllato la profondità, è necessario riapplicare ACSF e continuare con la chirurgia. Abbiamo anche trovato che se c'è danno al dura, è solitamente dovuto il chirurgo mettere troppa pressione sulla punta. Tenendo il manipolo più delicatamente e applicare meno forza probabilmente risolverà questo problema. Se il chirurgo è forzatamente raschiando la punta sull'osso, esso causerà una pausa nell'osso sottile e danneggiare il cranio. Infine, se dopo aver assottigliamento dell'osso, il sottostante dura contuso, è probabilmente dovuto il calore in eccesso dalle vibrazioni. Aumento del tasso di flusso ACSF risolverà questo problema.
La limitazione principale di FASORE è che il manipolo può sottile dell'osso, ma non è possibile rimuovere tutte le ossa sopra la dura madre. La punta rivestita di diamante ha piccoli urti ruvide. Lo sfregamento serviva per fluidificare il cranio sarebbe carteggiare la dura madre e causare sanguinamento se esso venisse utilizzato per rimuovere tutte le ossa. Così, per rimuovere lo strato sottile restante è necessaria l'applicazione del forcipe. Mentre ci è dibattito continuo su se la formazione immagine attraverso un cranio sottile produce meno proliferazione di microglia e astrociti reattivi e meno infiammazione, in alcuni casi una finestra con nessun osso restante è preferita, ad esempio, per fornire una maggiore profondità di imaging3 .
Abbiamo ottimizzato la preparazione di finestra cranica per multiphoton imaging in topi. FASORE è, a nostra conoscenza, la prima applicazione della tecnica piezoelettrica per chirurgia cranica roditore finestra per imaging ottico. Troviamo che l'uso della chirurgia piezoelettrica in topi condivide i vantaggi di velocità aumentata e diminuita eventi avversi segnalati anche in esseri umani7,8,9,10. L'utilizzo del dispositivo piezoelettrico è provocato da interventi chirurgici più veloce (Figura 2A) e meno eventi avversi di sanguinamento rispetto ad una rotativa ad alta velocità trapano (Figura 2B). Abbiamo anche trovato, all'interno del nostro laboratorio, che FASORE era più facile per i chirurghi di nuovi da imparare rispetto agli approcci tradizionali alla chirurgia cranica finestra. Vantaggi di velocità e facilità d'uso sono probabilmente diverse fra i chirurghi. Preparazioni di cranio sottili richiedono in genere 30-45 min per fluidificare l'osso con un trapano e bisturi2, mentre l'approccio FASORE richiede in genere meno di 10 min.
Abbiamo trovato che in windows preparata con FASORE potremmo immagine transitori di calcio nei neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia di motore che era stato transfected con virus adeno associato codifica l'indicatore di calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Inoltre abbiamo trovato che, rispetto a una finestra cranica cranio sottile preparata con un trapano rotativo e bisturi, l'imaging regione era più grande, mentre un cranio sottile preparato con un trapano rotativo e bisturi ha una finestra di imaging 20 µm di diametro2 . Con FASORE, siamo stati in grado di sottile rapidamente un'area di 3-4 mm. Questo è simile alla finestra di imaging segnalata con porte4. Questa finestra più grande conserva il vantaggio della rappresentazione rapida segnalato per windows cranio sottile preparata con un trapano odontoiatrico e bisturi. Inoltre, la finestra preparata con FASORE può essere imaged immediatamente, al contrario di rimozione dell'osso tradizionale windows che può richiedere settimane per guarire prima che la finestra può essere ottimamente ripreso3.
Questa tecnica può essere applicata per lo studio delle alterazioni del flusso sanguigno nei vasi sotto la dura madre. Un importante studio futuro è quello di confrontare il immunoreactivity di FASORE con altri metodi di finestra cranica. Questo sarebbe importante per determinare se il FASORE produce meno infiammazione rispetto a metodi esistenti. Ci auguriamo che la tecnica chirurgica piezoelettrica documentata qui permetterà altri labs eseguire windows cranica e utilizzare correttamente multifotonica imaging in vivo.
Assicurarsi che il manipolo è impostato a vibrare l'impostazione più bassa e che il ACSF è essere irrigato a una velocità costante. Il freddo di ghiaccio che ACSF deve essere applicato costantemente o si sarà riscaldare e danneggiare la dura madre. Abbiamo trovato che ACSF deve essere applicato a una velocità di almeno 1 mL/min. utilizzare una siringa tenuto in mano, o utilizzare una pompa peristaltica, piuttosto che l'irrigazione integrato nel manipolo. Il sistema di irrigazione nel manipolo espelle ACSF con troppa forza e produce troppa turbolenza, che significativamente alterare la visibilità.

Chirurgia cranica finestra per prepararsi roditori multifotonica imaging in vivo è diventata un'importante tecnica nell'ambito delle neuroscienze. La rimozione o l'assottigliamento dell'osso è necessario preparare il mouse per imaging ottico con un microscopio multifotonica. Questa chirurgia è eseguita rimuovendo completamente un'area dell'osso per esporre la sottostante dura1o fluidificando una regione dell'osso senza rimozione completa dalla dura2. L'approccio di cranio sottile può produrre meno infiammazione e attivazione della microglia3 ma fornisce una profondità minore di imaging, una dimensione di finestra di imaging più piccola (200 µm) e un periodo di tempo limitato durante il quale la finestra può essere imaged a causa di ricrescita ossea2 . L'aggiunta di una finestra di vetro lucido e rinforzato (porte) può aumentare le dimensioni imaging e il periodo di formazione immagine, ma è difficile da eseguire4.
Entrambi gli interventi attuali utilizzano un trapano rotativo ad alta velocità per sottile o rimuovere l'osso dal cranio. La tecnica di cranio sottile utilizza anche un bisturi dopo il trapano per fluidificare ulteriormente l'osso2. La tecnica di porte richiede il passaggio aggiuntivo di alta velocità di lucidatura con grana4. In un'alta velocità trapano rotativo, un'aria alimentata turbina o motore elettrico fa sì che la punta del trapano a girare ad alta velocità. Come Trapani rotativi sezione sia dell'osso che dei tessuti molli, esiste un rischio di danneggiare la dura madre e dei vasi sanguigni di fondo. Il successo della chirurgia dipende dalla abilità del chirurgo. Oltre a queste finestre preparate con metodi chirurgici meccanici, un metodo chimico di otticamente il cranio con diverse soluzioni di compensazione è stato sviluppato5,6. Tuttavia, poiché la chirurgia piezoelettrica è un metodo meccanico di chirurgia, nostri confronti qui sarà limitati ad altri metodi meccanici.
Dispositivi chirurgici piezoelettrici utilizzano vibrazioni ultrasoniche per abbattere osso mineralizzato senza danneggiare tessuti molli sottostanti e quindi offrono un approccio per sottile rapidamente una vasta area dell'osso. In un manipolo chirurgico piezoelettrico, la turbina è sostituita da una pila di dischi ceramici e quando viene applicata la corrente, i dischi vibrano a frequenze ultrasoniche. Le vibrazioni vengono trasferite attraverso il manipolo a diamante rivestiti suggerimenti per tagliare attraverso l'osso senza danneggiare tessuti molli, un vantaggio su Trapani rotativi che non discriminano tra i tipi di tessuto. La chirurgia piezoelettrica è stato originariamente sviluppata per l'uso nell'uomo di Tomaso Vercellotti e ha portato a miglioramenti nel dentale e cranio-maxilofacial chirurgia7,8,9,10,11 .
La chirurgia piezoelettrica è stata utilizzata per creare un'osteotomia in ratti Wistar e fu trovata da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e l'istologia per produrre molti meno danni rispetto a un tradizionale trapano odontoiatrico12. Gli autori hanno concluso che la chirurgia piezoelettrica era sicura per la rimozione dell'osso vicino tessuto cerebrale morbido. Mouse, tuttavia, hanno una dura più sottile che è danneggiato più facilmente, e che lo studio non si prepara windows per imaging ottico cronica. Formazione immagine cronica richiede che i vasi sanguigni non siano danneggiati e che non formano coaguli di sangue sotto la finestra. Danni al dura conducono ad infiammazione che causa la finestra verso il cloud, e attiva le microglia e la proliferazione di astrociti reattivi. Qui abbiamo ottimizzato la chirurgia piezoelettrica per topi creare sia sottile teschio e ossa completo cranica windows rimozione adatto per l'imaging cronica. Abbiamo confrontato questa tecnica chirurgica agli ambulatori cranica finestra preparato con un trapano rotante ad alta velocità.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP model has the same settings</td></tr><tr><td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td></tr><tr><td>Stereotax frame</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump for irrigation.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Much stronger than regular dental acrylic.</td></tr><tr><td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube opthalmic ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN Vector Core</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

La microscopia multifotonica è stato ampiamente adattata per l'imaging di neuroni in vivo. Formazione immagine ripetuta richiede l'impianto di una finestra cranica o ripetute assottigliamento del cranio. Chirurgia cranica finestra viene in genere eseguita con un trapano rotante ad alta velocità, e molti ricercatori trovano stimolante per impedire che il trapano danneggiare il delicato dura e vasi sanguigni. Vasto e la pratica è necessaria per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti sottostanti e quindi chirurgia cranica finestra può essere difficile, che richiede tempo e produrre danni ai tessuti. La chirurgia piezoelettrica, che viene ampiamente utilizzata per la chirurgia maxillo-facciale e dentale, utilizza le vibrazioni ad ultrasuoni per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti molli. Abbiamo sviluppato un metodo applicando la chirurgia piezoelettrica per migliorare la chirurgia cranica finestra nei topi in preparazione per l'imaging multiphoton. Confronti all'interno del nostro laboratorio di trovano che il metodo richiede meno tempo di chirurgia e ha un tasso medio più basso delle complicazioni dovuto spurgo dural rispetto alla chirurgia cranica finestra con un trapano rotativo.

Prima di procedere con la chirurgia piezoelettrica, rimuovere qualsiasi residuo periostio dal cranio. Una volta che il cranio è opaca e liscia (Figura 1a), il chirurgo può iniziare la chirurgia piezoelettrica. Durante la rimozione dell'osso con la punta piezo vibrante, è fondamentale per irrigare il cranio con il ghiaccio freddo ACSF. Corretta irrigazione è raggiunto quando il fondo 1 mm della punta è sommerso in ACSF (Figura 1b). Senza irrigazione adeguata, l'osso sarà surriscaldare e danneggiare il cervello. Dopo il cranio è stato assottigliato fino alla profondità desiderata, scelta dal chirurgo, ci potrebbe essere qualche residuo sanguinamento da vasi sanguigni situati nell'osso. Al fine di cessare rapidamente tutte le emorragie, applicare un pezzo piccolo di 1 mm di schiuma di collagene imbevuto di ACSF per l'area della finestra. Lasciate che il collagene sedersi sul cranio per circa 30 s (Figura 1C). Dopo la rimozione della schiuma di collagene, la finestra apparirà traslucida, che permette la chiara visualizzazione dei vasi sanguigni nella dura. La dura madre sarà intatta senza lividi significativi. (Figura 1D). Se la dura madre appaia rossa e infiammata, è probabile a causa di vasi sanguigni rotti da troppa pressione applicata alla punta durante l'intervento chirurgico. Per proteggere la nuova finestra e prepararlo per l'imaging cronica, vetrino coprioggetti devono essere posizionato sull'area. Correttamente applicata vetrino coprioggetti delicatamente si siedono in cima alla finestra e non causerà alcun danno alla zona. Il vetrino coprioggetti devono coprire l'intera finestra. Se il vetrino coprioggetti sono correttamente applicato al cranio, la finestra rimarrà traslucida sotto il vetro. Tutti i vasi sanguigni nella dura sarà ancora visibile (Figura 1e). Dentale acrilico deve essere applicato intorno il vetrino coprioggetti aderire definitivamente alla superficie del cranio. I bordi del coprivetrino vetro devono essere coperti anche in acrilico dentale (Figura 1f).
Abbiamo trovato che la chirurgia piezoelettrica è in genere molto più veloce rispetto a una tradizionale finestra cranica, prendendo circa 10-12 min a chirurgia (Figura 2A). Abbiamo anche scoperto che c'erano meno complicazioni dovuto dura ecchimosi e sanguinamento come osservato dall'occhio (Figura 2B). Una finestra adeguatamente preparata vi permetterà multiphoton imaging di indicatori fluorescenti in neuroni corticali in vivo. Abbiamo scelto di immagine l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a in corpi cellulari dei neuroni corticali di livello 4 (Figura 3A-3B). Abbiamo potuto osservare transitori del calcio in questi corpi delle cellule attraverso la finestra preparati utilizzando FASORE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: la chirurgia piezoelettrica. (a) il cranio dopo che è stato preparato correttamente per FASORE. Tutto il tessuto periosteal è stato rimosso, lasciando una superficie liscia e pulita. (b) un'immagine rappresentativa del FASORE in corso. Parte inferiore 1 mm di vibrante punta chirurgica è sommerso in ghiaccio freddo ACSF. Il fluido viene applicato al cranio ad un tasso di 1 mL/min. Un leggero movimento circolare viene applicato al cranio e l'osso è assottigliata tramite vibrazioni ultrasoniche. (c) dopo il cranio è stato assottigliato, un pezzo circolare di 1 mm di schiuma di collagene bagnato freddo che ACSF si lascia riposare sulla finestra per interrompere qualsiasi micro sanguina dall'osso. (d), una finestra di successo con una dura traslucido vengono visualizzati tutti i vasi sanguigni intatti. Non c'è nessun danno visibile o ecchimosi sulla superficie del cervello. (e) un vetrino coprioggetti è posizionato sopra la finestra per proteggere la superficie del cervello. (f) dentale acrilico viene applicato al cranio per risolvere definitivamente il vetrino coprioggetti sopra la finestra. Scala bar 1 mm in tutte le immagini.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Confronto del tasso di successo nella formazione per FASORE o dentali trapano chirurgia. (A) tempo medio per la chirurgia era inferiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (p < 0,05, due test t munito) n = 30 ambulatori per gruppo e media 10 interventi al chirurgo. (B) la percentuale di successo interventi chirurgici (definito come nessun danno visibile o sanguinamento al dura, come osservato dall'occhio del chirurgo attraverso l'obiettivo fissato a 350 zoom) era superiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (n = 30 ambulatori per ogni gruppo, uno test z munito). Barre di errore indicano SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Nella figura 3. Imaging in vivo attraverso una finestra cranica multifotonica diluito con FASORE. (A) calcio transitori osservati con l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a erano imaged in neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia motoria murino in vivo. Barra della scala = 100 µm. (B), la stessa finestra ma diversa regione della corteccia di motore di livello 4. Headfixed mouse con finestra di 3mm preparato con FASORE. Barra della scala = 30 µm. Imaged con un microscopio multifotonica, obiettivo 40x, 1040 nm lunghezza d'onda di eccitazione.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

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Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K Views.  Columbia University Medical Campus. Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

Video: Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Ricerca

Neuroscienze

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Biologia dello sviluppo

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

Protocollo integrato per FUN e fotometria in fibra nei topi in movimento libero

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is compatible with most of the existing modalities for monitoring brain functions in vivo. Integration with brain function recording modalities not only enables us to address orders and disorders of specific brain functions with closed-loop feedback but also provides us with mechanistic insights about FUN itself. Here, we provide a modified, simple, dependable, and robust protocol for the simultaneous application of FUN and fiber photometry GCaMP6s fluorescence recording in free-moving mice. This involves the fabrication of a well-sized single transducer and its temporary placement on the mice, along with the secure fixation of a fiber optical implant to facilitate the smooth passage of the transducer. The combination of FUN and fiber photometry provides for the optical recording of neural circuitry responses upon FUN in real-time in deep brain regions. To demonstrate the efficiency of this protocol, Thy1-GCaMP6s mice were used as an example to record the neuroactivity in the anterior thalamic nucleus during FUN while the mice are freely moving. We believe that this protocol can promote the widespread use of FUN in both the neuroscience field and the biomedical ultrasound field.

Autore in primo piano: Integrazione della fotometria a fibre e della neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati per lo studio della modulazione neurale nei topi che

The protocol includes transducer manufacturing, parameters reporting, surgical procedure, and signal recording for the entire operational workflow of concurrent focused ultrasound neuromodulation and fiber photometry recording in free-moving mice.

Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

L'approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution

Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero