Tamara Zeric per aver contribuito a ottenere l'immagine multifotonica in questa carta. Supportato da cervello & comportamento, morbo di Parkinson e JPB fondazioni, MH108186 R01 e DA07418 R01. F31 fellowship 1F31MH109293-01A1 a C. S

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti secondo gli standard stabiliti dalla Columbia University Medical Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). L'eutanasia è stata eseguita tramite dislocazione cervicale in anestesia con ketamina 100 mg/kg e xilazina iniettato intraperitonealmente 10 mg/kg. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in modo sterile (chirurgo indossava tappo di testa, maschera viso, guanti sterili e camice da laboratorio monouso pulito) e strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave tra ogni uso.
1. prechirurgiche passaggi
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici per garantire la sterilità.</li>
	<li>Anestetizzare topi C57bl6 con isoflurano (4% per induzione e 1.5-2% per la chirurgia). Pizzicare la punta posteriore ogni 10 min per assicurare la corretta profondità dell'anestesia. Aumentare l'anestesia se è visto ritrazione vocalizzazione o dell'arto.</li>
	<li>Applicare il lubrificante veterinario occhio agli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sopra il cuoio capelluto con un'applicazione di 3 min di gel per capelli rimozione o dalla rasatura con un rasoio elettrico.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella cornice stereotassica su un rilievo di riscaldamento o coperta di ricircolo acqua calibrato impostata su 38° C.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per fornire l'analgesia prechirurgica.</li>
	<li>Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni alternati di clorexidina o betadine ed etanolo al 70% utilizzando un batuffolo di cotone con punta applicatore.</li>
	<li>Iniettare 100 mL di bupivacaine diluito 50% in soluzione salina sotto il cuoio capelluto per fornire l'anestesia locale.</li>
</ol>2. piezoelettrico finestra cranica chirurgia
<ol><li>Utilizzando strumenti chirurgici sterili in autoclave, rimuovere un cerchio di 1 cm del cuoio capelluto sopra il cranio di taglio con forbici chirurgiche in un modello circolare. Sollevare il cuoio capelluto fuori del cranio esponendo il tessuto periostio sopra l'osso.</li>
	<li>Utilizzare la punta del forcipe per raschiare l'osso esposto chiaro di qualsiasi tessuto restante del periostio. Questo è importante assicurare che il cemento dentale non cadrà più tardi.</li>
	<li>Impostare l'unità di chirurgia piezoelettrica a vibrare l'impostazione più bassa. Si noti che le impostazioni più alte possono rompere vasi sanguigni a causa di intense vibrazioni.</li>
	<li>Difficoltà la punta circolare sterile al manipolo. Nota: La punta circolare di 4 mm è adatta per interventi chirurgici. Il formato di punta grande contribuisce alla velocità della chirurgia come l'intera finestra può essere assottigliata simultaneamente.</li>
	<li>Riempire una siringa da 10 mL con ghiaccio freddo cerebrospinale artificiale (ACSF) e tenerlo in mano che non impugna il manipolo piezoelettrico.</li>
	<li>Irrigare il cranio di sgocciolatura ACSF da siringa il cranio ad un tasso di 1 mL/min in alternativa, utilizzare una pompa peristaltica, posizionata sopra il cranio per liberare l'uso di altra mano. Nota: Irrigazione con ACSF freddo è importante per prevenire il surriscaldamento dovuto all'attrito dalle vibrazioni ad alta frequenza.</li>
	<li>Applicare delicatamente la punta vibra chirurgica al cranio con un leggero movimento circolare (3 cerchi per 1 s) e sottile dell'osso alla profondità desiderata per eseguire una preparazione cranio sottile (5-10 min). Nota: Qui, windows 4 mm sono state fatte che sono state assottigliate a 20 µm. Tuttavia, la dimensione della finestra variano con la dimensione della punta chirurgica. Lo spessore dell'osso può essere regolata fino alla profondità desiderata in base alla lunghezza del tempo trascorso applicando la punta al cranio.</li>
	<li>Delicatamente, regolare l'angolazione del manipolo e cambiare l'angolo della punta, esercitando pressione al cranio per fluidificare il cranio uniformemente.</li>
	<li>Per eseguire una rimozione completa dell'osso senza lasciare alcun osso sottile dietro, sottile dell'osso fino a quando le crepe sono visibili intorno alla zona di finestra. Rimuovere le rimanenti scaglie di osso sottile con le pinzette senza danneggiare il sottostante dura.</li>
	<li>Immergere un pezzo di 1 mm di schiuma di collagene emostatico in ACSF freddo. Tenere la schiuma bagnata con una pinza e posizionarlo sul cranio sottile. Lasciare riposare sul cranio sottile per circa 30 s per interrompere qualsiasi micro sanguina in via di sviluppo.</li>
	<li>Utilizzare pinze per posizionare un coprioggetto in vetro 4 mm lateralmente sopra la finestra che è stata assottigliata nell'osso.</li>
	<li>Utilizzare il retro di un cotone piccolo di plastica o di legno con punta applicatore per applicare circa 100 µ l di acrilico dentale al cranio per tenere la finestra in posizione.</li>
</ol>3. post chirurgico cura
<ol><li>Rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico e metterlo in una gabbia riscaldata per il recupero. Monitor continuamente fino a quando ha riguadagnato la coscienza completa (valutato da comportamento, andatura e mobilità normale).</li>
	<li>Valutare gli animali due volte al giorno per tre giorni per manifestazioni del dolore post-operatorio, compresa l'attività in diminuzione, toelettatura, cibo e consumo di acqua, custodire il comportamento (ad es. zoppicando o una postura ricurva) o aumentata aggressività. Non restituire l'animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea come un analgesico 8 – 12 h dopo l'intervento chirurgico per 3 giorni. Monitorare l'area della finestra molto attentamente dopo la chirurgia per deiscenza, infiammazione e segni di infezione. Se l'animale non tornare alla linea di base di alimentazione e governare i comportamenti, consultare un veterinario per quanto riguarda i possibili interventi o l'eutanasia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

Non ci sono nessun informazioni integrative.

La chirurgia può essere modificata cambiando la punta chirurgica. Ci sono molti formati differenti della punta che possono essere applicati al manipolo. Modificare le dimensioni o la forma della punta si tradurrà in finestre di dimensioni diverse. Oltre la punta di 4 mm, abbiamo anche provato una punta di 3 mm e trovato che ha anche funzionato bene. Anche con irrigazione con ghiaccio freddo ACSF, non eravamo in grado di ottenere buoni risultati con le punte che erano troppo strette (circa 0,25 mm) a causa di vibrazioni concentrate causando troppo calore e bruciare l'osso conseguenti danni al sottostante dura. Non abbiamo provato la moltitudine di altri suggerimenti che sono disponibili, e ci aspettiamo che altri laboratori possono trovare nuove applicazioni per questi consigli diversi. Mentre la chirurgia è relativamente semplice, abbiamo trovato che ci sono diversi passaggi che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. Il primo è che la punta vibra produce un sacco di turbolenza in ACSF, che diminuisce la visibilità e produce difficoltà nell'accertare la profondità dell'osso dell'osso assottigliamento passo della chirurgia. È consigliabile che se è troppo difficile vedere quanto l'osso è sottile, prenditi una pausa per asciugare il cranio e la finestra applicando un tampone di cotone sterile al lato dell'osso. Non applicare il tampone di cotone direttamente alla finestra, dal momento che la superficie ruvida è dannoso per osso sottile. Dopo aver controllato la profondità, è necessario riapplicare ACSF e continuare con la chirurgia. Abbiamo anche trovato che se c'è danno al dura, è solitamente dovuto il chirurgo mettere troppa pressione sulla punta. Tenendo il manipolo più delicatamente e applicare meno forza probabilmente risolverà questo problema. Se il chirurgo è forzatamente raschiando la punta sull'osso, esso causerà una pausa nell'osso sottile e danneggiare il cranio. Infine, se dopo aver assottigliamento dell'osso, il sottostante dura contuso, è probabilmente dovuto il calore in eccesso dalle vibrazioni. Aumento del tasso di flusso ACSF risolverà questo problema.
La limitazione principale di FASORE è che il manipolo può sottile dell'osso, ma non è possibile rimuovere tutte le ossa sopra la dura madre. La punta rivestita di diamante ha piccoli urti ruvide. Lo sfregamento serviva per fluidificare il cranio sarebbe carteggiare la dura madre e causare sanguinamento se esso venisse utilizzato per rimuovere tutte le ossa. Così, per rimuovere lo strato sottile restante è necessaria l'applicazione del forcipe. Mentre ci è dibattito continuo su se la formazione immagine attraverso un cranio sottile produce meno proliferazione di microglia e astrociti reattivi e meno infiammazione, in alcuni casi una finestra con nessun osso restante è preferita, ad esempio, per fornire una maggiore profondità di imaging3 .
Abbiamo ottimizzato la preparazione di finestra cranica per multiphoton imaging in topi. FASORE è, a nostra conoscenza, la prima applicazione della tecnica piezoelettrica per chirurgia cranica roditore finestra per imaging ottico. Troviamo che l'uso della chirurgia piezoelettrica in topi condivide i vantaggi di velocità aumentata e diminuita eventi avversi segnalati anche in esseri umani7,8,9,10. L'utilizzo del dispositivo piezoelettrico è provocato da interventi chirurgici più veloce (Figura 2A) e meno eventi avversi di sanguinamento rispetto ad una rotativa ad alta velocità trapano (Figura 2B). Abbiamo anche trovato, all'interno del nostro laboratorio, che FASORE era più facile per i chirurghi di nuovi da imparare rispetto agli approcci tradizionali alla chirurgia cranica finestra. Vantaggi di velocità e facilità d'uso sono probabilmente diverse fra i chirurghi. Preparazioni di cranio sottili richiedono in genere 30-45 min per fluidificare l'osso con un trapano e bisturi2, mentre l'approccio FASORE richiede in genere meno di 10 min.
Abbiamo trovato che in windows preparata con FASORE potremmo immagine transitori di calcio nei neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia di motore che era stato transfected con virus adeno associato codifica l'indicatore di calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Inoltre abbiamo trovato che, rispetto a una finestra cranica cranio sottile preparata con un trapano rotativo e bisturi, l'imaging regione era più grande, mentre un cranio sottile preparato con un trapano rotativo e bisturi ha una finestra di imaging 20 µm di diametro2 . Con FASORE, siamo stati in grado di sottile rapidamente un'area di 3-4 mm. Questo è simile alla finestra di imaging segnalata con porte4. Questa finestra più grande conserva il vantaggio della rappresentazione rapida segnalato per windows cranio sottile preparata con un trapano odontoiatrico e bisturi. Inoltre, la finestra preparata con FASORE può essere imaged immediatamente, al contrario di rimozione dell'osso tradizionale windows che può richiedere settimane per guarire prima che la finestra può essere ottimamente ripreso3.
Questa tecnica può essere applicata per lo studio delle alterazioni del flusso sanguigno nei vasi sotto la dura madre. Un importante studio futuro è quello di confrontare il immunoreactivity di FASORE con altri metodi di finestra cranica. Questo sarebbe importante per determinare se il FASORE produce meno infiammazione rispetto a metodi esistenti. Ci auguriamo che la tecnica chirurgica piezoelettrica documentata qui permetterà altri labs eseguire windows cranica e utilizzare correttamente multifotonica imaging in vivo.
Assicurarsi che il manipolo è impostato a vibrare l'impostazione più bassa e che il ACSF è essere irrigato a una velocità costante. Il freddo di ghiaccio che ACSF deve essere applicato costantemente o si sarà riscaldare e danneggiare la dura madre. Abbiamo trovato che ACSF deve essere applicato a una velocità di almeno 1 mL/min. utilizzare una siringa tenuto in mano, o utilizzare una pompa peristaltica, piuttosto che l'irrigazione integrato nel manipolo. Il sistema di irrigazione nel manipolo espelle ACSF con troppa forza e produce troppa turbolenza, che significativamente alterare la visibilità.

Chirurgia cranica finestra per prepararsi roditori multifotonica imaging in vivo è diventata un'importante tecnica nell'ambito delle neuroscienze. La rimozione o l'assottigliamento dell'osso è necessario preparare il mouse per imaging ottico con un microscopio multifotonica. Questa chirurgia è eseguita rimuovendo completamente un'area dell'osso per esporre la sottostante dura1o fluidificando una regione dell'osso senza rimozione completa dalla dura2. L'approccio di cranio sottile può produrre meno infiammazione e attivazione della microglia3 ma fornisce una profondità minore di imaging, una dimensione di finestra di imaging più piccola (200 µm) e un periodo di tempo limitato durante il quale la finestra può essere imaged a causa di ricrescita ossea2 . L'aggiunta di una finestra di vetro lucido e rinforzato (porte) può aumentare le dimensioni imaging e il periodo di formazione immagine, ma è difficile da eseguire4.
Entrambi gli interventi attuali utilizzano un trapano rotativo ad alta velocità per sottile o rimuovere l'osso dal cranio. La tecnica di cranio sottile utilizza anche un bisturi dopo il trapano per fluidificare ulteriormente l'osso2. La tecnica di porte richiede il passaggio aggiuntivo di alta velocità di lucidatura con grana4. In un'alta velocità trapano rotativo, un'aria alimentata turbina o motore elettrico fa sì che la punta del trapano a girare ad alta velocità. Come Trapani rotativi sezione sia dell'osso che dei tessuti molli, esiste un rischio di danneggiare la dura madre e dei vasi sanguigni di fondo. Il successo della chirurgia dipende dalla abilità del chirurgo. Oltre a queste finestre preparate con metodi chirurgici meccanici, un metodo chimico di otticamente il cranio con diverse soluzioni di compensazione è stato sviluppato5,6. Tuttavia, poiché la chirurgia piezoelettrica è un metodo meccanico di chirurgia, nostri confronti qui sarà limitati ad altri metodi meccanici.
Dispositivi chirurgici piezoelettrici utilizzano vibrazioni ultrasoniche per abbattere osso mineralizzato senza danneggiare tessuti molli sottostanti e quindi offrono un approccio per sottile rapidamente una vasta area dell'osso. In un manipolo chirurgico piezoelettrico, la turbina è sostituita da una pila di dischi ceramici e quando viene applicata la corrente, i dischi vibrano a frequenze ultrasoniche. Le vibrazioni vengono trasferite attraverso il manipolo a diamante rivestiti suggerimenti per tagliare attraverso l'osso senza danneggiare tessuti molli, un vantaggio su Trapani rotativi che non discriminano tra i tipi di tessuto. La chirurgia piezoelettrica è stato originariamente sviluppata per l'uso nell'uomo di Tomaso Vercellotti e ha portato a miglioramenti nel dentale e cranio-maxilofacial chirurgia7,8,9,10,11 .
La chirurgia piezoelettrica è stata utilizzata per creare un'osteotomia in ratti Wistar e fu trovata da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e l'istologia per produrre molti meno danni rispetto a un tradizionale trapano odontoiatrico12. Gli autori hanno concluso che la chirurgia piezoelettrica era sicura per la rimozione dell'osso vicino tessuto cerebrale morbido. Mouse, tuttavia, hanno una dura più sottile che è danneggiato più facilmente, e che lo studio non si prepara windows per imaging ottico cronica. Formazione immagine cronica richiede che i vasi sanguigni non siano danneggiati e che non formano coaguli di sangue sotto la finestra. Danni al dura conducono ad infiammazione che causa la finestra verso il cloud, e attiva le microglia e la proliferazione di astrociti reattivi. Qui abbiamo ottimizzato la chirurgia piezoelettrica per topi creare sia sottile teschio e ossa completo cranica windows rimozione adatto per l'imaging cronica. Abbiamo confrontato questa tecnica chirurgica agli ambulatori cranica finestra preparato con un trapano rotante ad alta velocità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Piezosurgery Touch</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>5120062</td>
			<td>Piezosurgery GP model has the same settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>3370019</td>
			<td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for irrigation.</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-77120-42</td>
			<td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene Ultrafoam</td>
			<td>Bard-Davol</td>
			<td>1050020</td>
			<td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C&#38;B Metabond</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S380</td>
			<td>Much stronger than regular dental acrylic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube opthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>
			<td>UPENN Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

La microscopia multifotonica è stato ampiamente adattata per l'imaging di neuroni in vivo. Formazione immagine ripetuta richiede l'impianto di una finestra cranica o ripetute assottigliamento del cranio. Chirurgia cranica finestra viene in genere eseguita con un trapano rotante ad alta velocità, e molti ricercatori trovano stimolante per impedire che il trapano danneggiare il delicato dura e vasi sanguigni. Vasto e la pratica è necessaria per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti sottostanti e quindi chirurgia cranica finestra può essere difficile, che richiede tempo e produrre danni ai tessuti. La chirurgia piezoelettrica, che viene ampiamente utilizzata per la chirurgia maxillo-facciale e dentale, utilizza le vibrazioni ad ultrasuoni per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti molli. Abbiamo sviluppato un metodo applicando la chirurgia piezoelettrica per migliorare la chirurgia cranica finestra nei topi in preparazione per l'imaging multiphoton. Confronti all'interno del nostro laboratorio di trovano che il metodo richiede meno tempo di chirurgia e ha un tasso medio più basso delle complicazioni dovuto spurgo dural rispetto alla chirurgia cranica finestra con un trapano rotativo.

Prima di procedere con la chirurgia piezoelettrica, rimuovere qualsiasi residuo periostio dal cranio. Una volta che il cranio è opaca e liscia (Figura 1a), il chirurgo può iniziare la chirurgia piezoelettrica. Durante la rimozione dell'osso con la punta piezo vibrante, è fondamentale per irrigare il cranio con il ghiaccio freddo ACSF. Corretta irrigazione è raggiunto quando il fondo 1 mm della punta è sommerso in ACSF (Figura 1b). Senza irrigazione adeguata, l'osso sarà surriscaldare e danneggiare il cervello. Dopo il cranio è stato assottigliato fino alla profondità desiderata, scelta dal chirurgo, ci potrebbe essere qualche residuo sanguinamento da vasi sanguigni situati nell'osso. Al fine di cessare rapidamente tutte le emorragie, applicare un pezzo piccolo di 1 mm di schiuma di collagene imbevuto di ACSF per l'area della finestra. Lasciate che il collagene sedersi sul cranio per circa 30 s (Figura 1C). Dopo la rimozione della schiuma di collagene, la finestra apparirà traslucida, che permette la chiara visualizzazione dei vasi sanguigni nella dura. La dura madre sarà intatta senza lividi significativi. (Figura 1D). Se la dura madre appaia rossa e infiammata, è probabile a causa di vasi sanguigni rotti da troppa pressione applicata alla punta durante l'intervento chirurgico. Per proteggere la nuova finestra e prepararlo per l'imaging cronica, vetrino coprioggetti devono essere posizionato sull'area. Correttamente applicata vetrino coprioggetti delicatamente si siedono in cima alla finestra e non causerà alcun danno alla zona. Il vetrino coprioggetti devono coprire l'intera finestra. Se il vetrino coprioggetti sono correttamente applicato al cranio, la finestra rimarrà traslucida sotto il vetro. Tutti i vasi sanguigni nella dura sarà ancora visibile (Figura 1e). Dentale acrilico deve essere applicato intorno il vetrino coprioggetti aderire definitivamente alla superficie del cranio. I bordi del coprivetrino vetro devono essere coperti anche in acrilico dentale (Figura 1f).
Abbiamo trovato che la chirurgia piezoelettrica è in genere molto più veloce rispetto a una tradizionale finestra cranica, prendendo circa 10-12 min a chirurgia (Figura 2A). Abbiamo anche scoperto che c'erano meno complicazioni dovuto dura ecchimosi e sanguinamento come osservato dall'occhio (Figura 2B). Una finestra adeguatamente preparata vi permetterà multiphoton imaging di indicatori fluorescenti in neuroni corticali in vivo. Abbiamo scelto di immagine l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a in corpi cellulari dei neuroni corticali di livello 4 (Figura 3A-3B). Abbiamo potuto osservare transitori del calcio in questi corpi delle cellule attraverso la finestra preparati utilizzando FASORE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: la chirurgia piezoelettrica. (a) il cranio dopo che è stato preparato correttamente per FASORE. Tutto il tessuto periosteal è stato rimosso, lasciando una superficie liscia e pulita. (b) un'immagine rappresentativa del FASORE in corso. Parte inferiore 1 mm di vibrante punta chirurgica è sommerso in ghiaccio freddo ACSF. Il fluido viene applicato al cranio ad un tasso di 1 mL/min. Un leggero movimento circolare viene applicato al cranio e l'osso è assottigliata tramite vibrazioni ultrasoniche. (c) dopo il cranio è stato assottigliato, un pezzo circolare di 1 mm di schiuma di collagene bagnato freddo che ACSF si lascia riposare sulla finestra per interrompere qualsiasi micro sanguina dall'osso. (d), una finestra di successo con una dura traslucido vengono visualizzati tutti i vasi sanguigni intatti. Non c'è nessun danno visibile o ecchimosi sulla superficie del cervello. (e) un vetrino coprioggetti è posizionato sopra la finestra per proteggere la superficie del cervello. (f) dentale acrilico viene applicato al cranio per risolvere definitivamente il vetrino coprioggetti sopra la finestra. Scala bar 1 mm in tutte le immagini.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Confronto del tasso di successo nella formazione per FASORE o dentali trapano chirurgia. (A) tempo medio per la chirurgia era inferiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (p < 0,05, due test t munito) n = 30 ambulatori per gruppo e media 10 interventi al chirurgo. (B) la percentuale di successo interventi chirurgici (definito come nessun danno visibile o sanguinamento al dura, come osservato dall'occhio del chirurgo attraverso l'obiettivo fissato a 350 zoom) era superiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (n = 30 ambulatori per ogni gruppo, uno test z munito). Barre di errore indicano SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Nella figura 3. Imaging in vivo attraverso una finestra cranica multifotonica diluito con FASORE. (A) calcio transitori osservati con l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a erano imaged in neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia motoria murino in vivo. Barra della scala = 100 µm. (B), la stessa finestra ma diversa regione della corteccia di motore di livello 4. Headfixed mouse con finestra di 3mm preparato con FASORE. Barra della scala = 30 µm. Imaged con un microscopio multifotonica, obiettivo 40x, 1040 nm lunghezza d'onda di eccitazione.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K Views.  Columbia University Medical Campus. Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can produce a rewarding effect that strengthens action-outcome associations and reinforces future behavior directed at obtaining these foods. Increasing evidence that the rewarding effects of energy-dense foods play a profound role in overeating and the development of obesity has heightened interest in studying the genes, molecules and neural circuitry that modulate food reward1,2. The rewarding impact of different stimuli can be studied by measuring the willingness to work to obtain them, such as in operant conditioning tasks3. Operant models of food reward measure acquired and voluntary behavioral responses that are directed at obtaining food. A commonly used measure of reward strength is an operant procedure known as the progressive ratio (PR) schedule of reinforcement.4,5 In the PR task, the subject is required to make an increasing number of operant responses for each successive reward. The pioneering study of Hodos (1961) demonstrated that the number of responses made to obtain the last reward, termed the breakpoint, serves as an index of reward strength4. While operant procedures that measure changes in response rate alone cannot separate changes in reward strength from alterations in performance capacity, the breakpoint derived from the PR schedule is a well-validated measure of the rewarding effects of food. The PR task has been used extensively to assess the rewarding impact of drugs of abuse and food in rats (e.g.,6-8), but to a lesser extent in mice9. The increased use of genetically engineered mice and diet-induced obese mouse models has heightened demands for behavioral measures of food reward in mice. In the present article we detail the materials and procedures used to train mice to respond (lever-press) for a high-fat and high-sugar food pellets on a PR schedule of reinforcement. We show that breakpoint response thresholds increase following acute food deprivation and decrease with peripheral administration of the anorectic hormone leptin and thereby validate the use of this food-operant paradigm in mice.

The present report details the protocol employed to measure the rewarding effects of high-fat food in mice using a progressive ratio operant conditioning task.

Progressive-ratio di rispondere per alimentare appetibile alto contenuto di grassi e di zuccheri nel Mice

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all&#39;orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva<em&gt; In Vivo</em&gt; Condizioni seguito distale Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale nei topi

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous deoxyhemoglobin as an endogenous contrast agent to detect changes in blood-level-dependent oxygenation (BOLD effect). We combined fMRI with a novel robotic device (MR-compatible hand-induced robotic device [MR_CHIROD]) so that a person in the scanner can execute a controlled motor task, hand-squeezing, which is a very important hand movement to study in neurological motor disease. We employed parallel imaging (generalized auto-calibrating partially parallel acquisitions [GRAPPA]), which allowed higher spatial resolution resulting in increased sensitivity to BOLD. The combination of fMRI with the hand-induced robotic device allowed precise control and monitoring of the task that was executed while a participant was in the scanner; this may prove to be of utility in rehabilitation of hand motor function in patients recovering from neurological deficits (e.g., stroke). Here we outline the protocol for using the current prototype of the MR_CHIROD during an fMRI scan.

We performed functional MRI using a novel MRI-compatible hand-induced robotic device to evaluate its utility for monitoring hand motor function in individuals recovering from neurological deficits.

Risonanza magnetica funzionale in congiunzione con un nuovo dispositivo robotico indotto dalle mani compatibile con la risonanza magnetica per valutare la riabilitazione di individui che recuperano dai deficit di grip della mano

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) remain unclear. In order to adequately study the attributes of endolymphatic hydrops, such as the origins of low-frequency hearing loss, a reliable model is needed. The guinea pig is a&#160;good model because it hears in the low-frequency regions that are putatively affected by endolymphatic hydrops. Previous research has demonstrated that endolymphatic hydrops can be induced surgically via intradural or extradural approaches that involve drilling on the endolymphatic duct and sac. However, whether it was possible to create an endolymphatic hydrops model using an extradural approach that avoided dangerous drilling on the endolymphatic duct and sac was unknown. The objective of this study was to demonstrate a revised extradural approach to induce experimental endolymphatic hydrops at 30 days post-operatively by obliterating the endolymphatic sac and injuring the endolymphatic duct with a fine pick. The sample size consisted of seven guinea pigs. Functional measurements of hearing were made and temporal bones were subsequently harvested for histologic analysis. The approach had a success rate of 86% in achieving endolymphatic hydrops. The risk of cerebrospinal fluid leak was minimal. No perioperative deaths or injuries to the posterior semicircular canal occurred in the sample. The presented method demonstrates a safe and reliable way to induce endolymphatic hydrops at a relatively quick time point of 30 days. The clinical implications are that the presented method provides a reliable model to further explore the origins of low-frequency hearing loss that can be associated endolymphatic hydrops.

This article demonstrates an extradural approach to obliterate the guinea pig endolymphatic sac and injure the endolymphatic duct with a fine pick in order to induce experimental endolymphatic hydrops.

Un approccio chirurgico rivisto per indurre idramici endolymphatic in Guinea Pig

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...