Tamara Zeric para ajudar a obter a imagem do multiphoton neste trabalho. Suportado pelo cérebro & comportamento, Parkinson e fundações JPB, R01 MH108186 e R01 DA07418. F31 comunhão 1F31MH109293-01A1 S c.

Todos os procedimentos que envolvem animais foram realizados de acordo com as normas definidas pela Columbia University Medical Center institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). A eutanásia foi realizada através de deslocamento cervical sob anestesia com cetamina 100mg/kg e xilazina 10 mg/kg, injetados intraperitonealmente. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados de forma estéril (cirurgião estava usando tampão principal, máscara, luvas estéreis e jaleco descartável limpo) e instrumentos cirúrgicos foram esterilizados entre cada uso.
1. pré-operatória passos
<ol><li>Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos para garantir a esterilidade.</li>
	<li>ANESTHETIZE camundongos C57bl6 com isoflurano (4% para a indução e 1,5-2% para a cirurgia). Aperte o dedo do pé traseiro cada 10 min para assegurar adequada profundidade da anestesia. Aumente a anestesia se vocalização ou membro posterior retração é vista.</li>
	<li>Aplique lubrificante veterinária olho para os olhos para impedir a secagem.</li>
	<li>Remova o cabelo sobre o couro cabeludo com um aplicativo de 3 min de gel de remoção de cabelo ou fazer a barba com um barbeador elétrico.</li>
	<li>Posicione o mouse no quadro estereotáxica em uma almofada de aquecimento ou cobertor de recirculação de água calibrado conjunto de 38° C.</li>
	<li>Administre a buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para fornecer analgesia pré-operatória.</li>
	<li>Desinfecte o couro cabeludo com três aplicações alternadas de clorexidina ou betadine e etanol 70% usando um aplicador de ponta de algodão.</li>
	<li>Injete 100ml de 50% de bupivacaína diluída em soro fisiológico sob o couro cabeludo para fornecer anestesia local.</li>
</ol>2. piezoelétrico janela craniana cirurgia
<ol><li>Utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis autoclavados, remova um círculo de 1 cm do couro cabeludo sobre o crânio, corte com tesoura cirúrgica em um padrão circular. Levante o couro cabeludo fora do crânio, expondo o tecido periósteo sobre o osso.</li>
	<li>Use a ponta da pinça para raspar o osso exposto claro de qualquer tecido restante do periósteo. Isto é importante para garantir que o cimento dental não cairá mais tarde.</li>
	<li>Defina a unidade de cirurgia piezoeléctrica a vibrar na configuração mais baixa. Observe que definições mais elevadas podem quebrar vasos sanguíneos devido a vibrações intensas.</li>
	<li>Corrigi a ponta circular estéril à peça de mão. Nota: A ponta circular de 4mm é bem adequada para cirurgias. O tamanho da ponta grande contribui para a velocidade da cirurgia, como a janela inteira pode ser diluída em simultâneo.</li>
	<li>Encher uma seringa de 10 mL com gelo frio artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) e segure na mão não segurando o handpiece piezoelétrico.</li>
	<li>Irrigar o crânio por gotejamento a ACSF da seringa para o crânio em uma taxa de 1 mL/min. como alternativa, usar uma bomba peristáltica, posicionada sobre o crânio para liberar o uso da outra mão. Nota: Irrigação com ACSF frio é importante para evitar o sobreaquecimento devido a fricção das vibrações de alta frequência.</li>
	<li>Aplicar suavemente a ponta vibratória cirúrgica no crânio com um leve movimento circular (3 círculos por 1 s) e fina do osso para a profundidade desejada para realizar uma preparação de crânio fina (5 a 10 min). Nota: Aqui, windows 4 mm foram feitas que foram diluídos a 20 µm. No entanto, o tamanho da janela irá variar com o tamanho da ponta cirúrgica. A espessura do osso pode ser ajustada para a profundidade desejada, com base no comprimento de tempo gastado aplicando a ponta no crânio.</li>
	<li>Delicadamente, ajustar o ângulo da peça de mão e mudar o ângulo da ponta e aplicando pressão no crânio para diluir o crânio uniformemente.</li>
	<li>Para executar uma remoção óssea completa sem deixar qualquer osso fino atrás, fina do osso até rachaduras são visíveis ao redor da área de janela. Retire os flocos restantes do osso fino com pinça sem danificar a dura-máter subjacente.</li>
	<li>Mergulhe um pedaço de 1 mm de espuma de colágeno hemostático em ACSF frio. Segure a espuma molhada com pinça e coloque-o sobre o crânio fino. Deixe-o sentar-se no crânio fino por cerca de 30 s para parar qualquer micro sangramentos de se desenvolver.</li>
	<li>Use fórceps para colocar uma lamela de vidro de 4 mm lateralmente sobre a janela que diluiu-se dentro do osso.</li>
	<li>Use as costas de um pequeno algodão plástico ou de madeira com ponta aplicadora para aplicar aproximadamente 100 µ l de acrílico dental no crânio para segurar a janela no lugar.</li>
</ol>3. pós-cirúrgico cuidados
<ol><li>Remova o mouse do aparelho cirúrgico e colocá-lo em uma gaiola aquecida para recuperação. Monitorá-lo continuamente até que recuperou a consciência cheia (avaliada pelo comportamento da marcha e mobilidade normal).</li>
	<li>Avalie os animais duas vezes por dia por três dias para manifestações de dor pós-cirúrgica, incluindo a diminuição da atividade, aparar, comida e o consumo de água, guardando o comportamento (por exemplo, mancando ou uma postura encurvada) ou aumento da agressão. Não retornam o animal para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.</li>
	<li>Administrar a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico 8 – 12 h após a cirurgia, durante 3 dias. Monitore a área da janela de perto após a cirurgia para sinais de infecção, inflamação e deiscência. Se o animal não retornar à linha de base, alimentação e comportamentos de aliciamento, consulte um veterinário sobre possíveis intervenções ou eutanásia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+in+implant+dentistry.">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li><li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

Não há nenhum divulgações.

A cirurgia pode ser modificada alterando a ponta cirúrgica. Há muitos tamanhos diferentes de ponta que pode ser aplicado à peça de mão. Alterar o tamanho ou a forma da ponta resultará em janelas de tamanhos diferentes. Além da ponta de 4mm, também tentei uma dica de 3 mm e encontrado também funcionou bem. Mesmo com a irrigação com gelo frio ACSF, não fomos capazes de obter bons resultados com dicas que foram muito estreito (cerca de 0,25 mm) devido as vibrações concentradas, causando muito calor e queima o osso, levando a danos para a dura-máter subjacente. Nós não tentamos a multidão de outras dicas que estão disponíveis, e esperamos que outros laboratórios podem encontrar novas aplicações para estas pontas diferentes. Enquanto a cirurgia é relativamente simples, achamos que há várias etapas que podem exigir a resolução de problemas. O primeiro é que a ponta vibratória produz muita turbulência na ACSF, que diminui a visibilidade e produz dificuldade em determinar a profundidade de osso durante o osso desbaste etapa da cirurgia. Recomendamos que, se é muito difícil de ver como o osso é magro, fazer uma pausa para secar o crânio e a janela aplicando um cotonete estéril para o lado do osso. Não se aplica o cotonete diretamente para a janela, desde que a superfície áspera é prejudicial para o osso fino. Depois de verificar a profundidade, reaplique ACSF e continuar com a cirurgia. Também achamos que se não há danos para a dura-máter, é geralmente devido ao cirurgião colocar muita pressão na ponta. Segurando a peça de mão mais suavemente e aplicando menos força provavelmente irão corrigir este problema. Se o cirurgião é forçosamente raspando a dica sobre o osso, vai causar uma ruptura no osso fino e danificar o crânio. Finalmente, após a diluição do osso, a dura-máter subjacente aparece ferida, se devido ao calor em excesso de vibrações. Aumentando a taxa de fluxo ACSF vai resolver este problema.
A principal limitação do FASOR é que a peça de mão pode diluir o osso, mas não é possível remover todo o osso sobre a dura-máter. A ponta de diamante revestido tem pequenas saliências ásperas. O atrito necessário para "afinar" o crânio que abrada a dura-máter e causar sangramento se fosse usado para remover todo o osso. Assim, o uso de fórceps é necessário para remover a restante camada fina. Enquanto há um debate em curso sobre se a imagem através de um crânio fina produz menos inflamação e menos proliferação da microglia e astrócitos reativos, em alguns casos uma janela com nenhum osso remanescente é o preferido, por exemplo, para fornecer uma maior profundidade de imagem3 .
Otimizamos a preparação de janela cranial para a imagem latente do multiphoton em camundongos. FASOR é, a nosso conhecimento, a primeira aplicação da técnica piezoelétrica para cirurgia de roedores janela cranial para a imagem latente ótica. Descobrimos que o uso de cirurgia piezoeléctrica em camundongos compartilha as vantagens do aumento da velocidade e diminuição de eventos adversos relatados também em seres humanos7,8,9,10. Utilização do dispositivo piezoelétrico resultou em cirurgias mais rápidas (Figura 2A) e menos eventos adversos de sangramento quando comparado com uma giratória de alta velocidade da broca (Figura 2B). Também encontramos, no nosso laboratório, que FASOR era mais fácil para novos cirurgiões aprender do que as abordagens tradicionais para cirurgia craniana janela. Vantagens da velocidade e facilidade de utilização são susceptíveis de diferem entre cirurgiões. Preparações de crânio fina exigem tipicamente 30-45 min para "afinar" o osso com uma broca e bisturi2, enquanto a abordagem de FASOR normalmente requer menos de 10 min.
Nós achamos que em windows preparados com PHASOR nós poderia imagem transientes de cálcio nos neurônios piramidais de camada 4 no córtex motor que tinha sido transfected com vírus adeno-associado, o indicador de cálcio JRGECO1a de codificação (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). nós também achamos isso, comparado a uma janela craniana crânio fino preparada com uma broca rotativa e bisturi, a região de imagem era maior, enquanto um crânio fino preparado com uma broca rotativa e bisturi tem uma janela de imagem de 20 µm de diâmetro2 . Com FASOR, fomos capazes de diminuir rapidamente uma área de 3 a 4 mm. Isso é semelhante à janela de imagem relatada com portas4. Esta janela maior retém o benefício de imagem rápida relatado para windows crânio fino preparados com uma broca de dentista e bisturi. Além disso, a janela preparada com FASOR pode imediatamente ser fotografada, em oposição a remoção de osso tradicional windows que podem exigir a semanas para cicatrizar antes que a janela pode ser óptima imagem3.
Esta técnica pode ser aplicada para estudar alterações no fluxo sanguíneo nos vasos sob a dura-máter. Um importante estudo futuro é comparar imunorreatividade de FASOR com outros métodos de janela cranial. Isto seria importante para determinar se o FASOR produz menos inflamação em comparação com os métodos existentes. Esperamos que a técnica cirúrgica piezoelétrica documentada aqui permitirá mais laboratórios para executar windows cranianas e usar com sucesso multiphoton imagem em vivo.
Certifique-se que a peça de mão situa-se a vibrar na configuração mais baixa e que a ACSF está sendo irrigado em uma taxa constante. O frio do gelo que ACSF deve ser aplicado constantemente ou irá aquecer e danificar a dura-máter. Nós achamos que ACSF deve ser aplicado a uma taxa de pelo menos 1 mL/min. quer usar uma seringa realizada na mão, ou usar uma bomba peristáltica, ao invés da irrigação embutida na peça de mão. O sistema de irrigação na peça de mão ejeta ACSF demasiada força e produz muita turbulência, que diminuem significativamente a visibilidade.

Cirurgia craniana janela para preparar roedores multiphoton imagem latente na vivo tornou-se uma técnica importante em neurociência. A remoção ou enfraquecimento dos ossos é necessário preparar o mouse para a imagem latente ótica com um microscópio do multiphoton. Esta cirurgia é realizada removendo completamente uma área de osso para expor a dura-máter subjacente1ou diluindo-se uma região do osso sem remoção completa do dura2. A abordagem de crânio fina pode produzir menos inflamação e ativação da microglia3 mas fornece uma profundidade de imagem, um tamanho menor de janela de imagem (200 µm) e um período de tempo limitado durante o qual a janela pode ser fotografada devido à regeneração óssea2 . A adição de uma janela de vidro polido e reforçado (portas) pode aumentar o tamanho de imagem e período de imagem, mas é difícil de executar4.
Ambas as cirurgias atuais usam uma broca rotativa de alta velocidade para diluir ou remover o osso do crânio. A técnica de crânio fina também usa um bisturi após a broca para diluir ainda mais o osso2. A técnica de portas exige a etapa extra de polimento com grão4de alta velocidade. Em uma alta velocidade rotativos, uma turbina de ar alimentado ou motor elétrico faz com que a broca a girar a uma velocidade alta. Como brocas rotativas seção tanto osso e tecido mole, há um risco de danificar a dura-máter e subjacentes dos vasos sanguíneos. O sucesso da cirurgia depende da habilidade do cirurgião. Além destas janelas preparadas com métodos cirúrgicos mecânicos, um método químico de opticamente limpando o crânio com diferentes soluções tem sido desenvolvidos5,6. No entanto, desde cirurgia piezoelétrica é um método mecânico de cirurgia, nossas comparações aqui será limitadas a outros métodos mecânicos.
Piezoelétricos dispositivos cirúrgicos utilizam vibrações ultra-sônicas para quebrar osso mineralizado sem danificar tecidos moles subjacentes e assim, oferecem uma abordagem para desbastar rapidamente uma grande área de osso. Em uma peça de mão cirúrgica piezoelétrica, a turbina é substituída por uma pilha de discos de cerâmica e quando a corrente é aplicada, os discos vibram em frequências ultra-sônicas. As vibrações são transferidas através da peça de mão para diamante revestidas dicas para cortar o osso sem danificar os tecidos moles, uma vantagem sobre brocas rotativas que não discriminar entre os tipos de tecido. Cirurgia piezoeléctrica foi originalmente desenvolvida para uso em humanos por Tomaso Vercellotti e conduziu a melhorias na dental e cranio-maxilofacial cirurgia7,8,9,10,11 .
Piezoelétrica cirurgia tem sido usada para criar uma osteotomia em ratos Wistar e foi encontrada por ressonância magnética (MRI) e histologia para produzir significativamente menos dano do que um tradicional broca dental12. Os autores concluíram que cirurgia piezoeléctrica era segura para remover o osso perto de tecido cerebral macio. Ratos, no entanto, tem uma dura mais fino que é mais facilmente danificado, e esse estudo não preparou windows para a imagem latente ótica crônica. Imagem de crônica requer que os vasos sanguíneos não sejam danificados e que não formam coágulos de sangue sob a janela. Danos para a dura-máter leva a inflamação que faz com que a janela para a nuvem, e ativa a microglia e a proliferação de astrócitos reativos. Aqui, otimizamos cirurgia piezoeléctrica de ratos para criar tanto fino crânio e osso completo remoção craniana windows apropriado para a imagem latente crônica. Comparamos esta técnica cirúrgica para cirurgias cranianas janela preparado com uma broca rotativa de alta velocidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Piezosurgery Touch</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>5120062</td>
			<td>Piezosurgery GP model has the same settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td>
			<td>Mectron</td>
			<td>3370019</td>
			<td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump for irrigation.</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-77120-42</td>
			<td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene Ultrafoam</td>
			<td>Bard-Davol</td>
			<td>1050020</td>
			<td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C&#38;B Metabond</td>
			<td>Parkell</td>
			<td>S380</td>
			<td>Much stronger than regular dental acrylic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube opthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>
			<td>UPENN Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

Microscopia do multiphoton foi amplamente adaptada para imagem neurônios na vivo. Imagem repetida requer a implantação de uma janela cranial ou repetidas afinamento do crânio. Cirurgia craniana janela é normalmente realizada com uma broca rotativa de alta velocidade, e muitos investigadores encontrar desafio para evitar que a broca de danificar o delicado dura-máter e os vasos sanguíneos. Prática e treinamento extensivo é necessária para remover o osso sem dano ao tecido subjacente e assim cirurgia craniana janela pode ser difícil, demorada e produzir danos nos tecidos. Cirurgia piezoeléctrica, que é amplamente utilizada para cirurgia maxilo-facial e dental, utiliza vibrações ultra-sônicas para remover o osso sem danificar os tecidos moles. Nós desenvolvemos um método de aplicação piezoelétrica cirurgia para melhorar a cirurgia craniana janela em camundongos em preparação para a imagem latente do multiphoton. Comparações dentro de nosso laboratório de acham que o método requer menos tempo de cirurgia e tem uma baixa taxa média de complicações devido a sangramento dural que a cirurgia craniana janela com uma broca rotativa.

Antes de prosseguir com a cirurgia piezoeléctrica, remova qualquer residual periósteo do crânio. Uma vez que o crânio é liso e opaco (Figura 1a), o cirurgião pode começar a cirurgia piezoeléctrica. Ao remover o osso com a ponta de piezo vibrando, é fundamental para irrigar o crânio com gelo frio ACSF. Irrigação adequada é alcançada quando a parte inferior a 1 mm da ponta é submerso em ACSF (Figura 1b). Sem irrigação adequada, o osso vai superaquecer e danificar o cérebro. Depois que o crânio diluiu-se a profundidade desejada, escolhido pelo cirurgião, pode haver algum sangramento residual de vasos sanguíneos localizados no osso. Para cessar o sangramento todos rapidamente, aplique um pedaço pequeno de 1 mm de espuma de colágeno embebida em ACSF para a área da janela. Deixe o colágeno sentar-se no crânio para aproximadamente 30 s (Figura 1C). Depois que a espuma de colágeno é removida, a janela aparecerá translúcida, permitindo a visualização clara dos vasos sanguíneos na dura-máter. A dura-máter ficará intacta sem ferimento significativo. (Figura 1D). Se a dura-máter aparece vermelho e inflamado, é provavelmente devido a vasos sanguíneos danificados de demasiada pressão aplicada à ponta durante a cirurgia. Para proteger a nova janela e prepará-lo para a imagem latente crônica, uma lamela de vidro deve ser colocada sobre a área. Uma lamela de vidro devidamente aplicada suavemente irá sentar-se no topo da janela e não causará nenhum dano para a área. A lamela de vidro deve cobrir a janela inteira. Se a lamela de vidro é corretamente aplicada no crânio, a janela permanecerá translúcida sob o vidro. Os vasos sanguíneos na dura-máter ainda será visível (Figura 1e). Dental acrílico deve ser aplicado ao redor da lamela de vidro para permanentemente aderem à superfície do crânio. As bordas da lamela de vidro também devem ser cobertas de acrílico dental (Figura 1f).
Achamos que a cirurgia piezoelétrica é tipicamente muito mais rápida do que um tradicional janela craniana, levando em torno de 10-12 min por cirurgia (Figura 2A). Também achamos que houve menos complicações devido a dura-máter hematomas e hemorragia como observado a olho nu (Figura 2B). Uma janela devidamente preparada permitirá imagens do multiphoton dos indicadores fluorescentes em neurônios corticais em vivo. Escolhemos a imagem o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a em corpos celulares dos neurônios corticais de camada 4 (Figura 3A-3B). Pudemos observar transientes de cálcio nestes corpos celulares através da janela preparado usando FASOR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: cirurgia piezoeléctrica. (um) do crânio, depois que ele foi devidamente preparado para FASOR. Foi removido todo o tecido periosteal, deixando uma superfície lisa e limpa. (b) uma imagem representativa de FASOR em andamento. Parte inferior 1 mm de vibrar o ponta cirúrgica está submersa no gelo ACSF frio. O fluido é aplicado no crânio em uma taxa de 1 mL/min. Um leve movimento circular é aplicado para o crânio e o osso é diluído através de vibrações ultra-sônicas. (c) após diluiu-se no crânio, um pedaço circular de 1 mm de espuma de colágeno embebidas em frio que ACSF é permitido descansar na janela para parar qualquer micro sangramentos do osso. (d), A janela bem sucedida com uma dura translúcido exibe todos os vasos sanguíneos intactos. Não há nenhum dano visível ou arranhão na superfície do cérebro. (e) uma lamela de vidro é colocada sobre a janela para proteger a superfície do cérebro. (f) Dental acrílico é aplicado no crânio para corrigir permanentemente a lamela de vidro sobre a janela. Escala da barra 1 mm em todas as imagens.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Comparação da taxa de sucesso em treinamento para PHASOR ou dental perfurar a cirurgia. (A) tempo médio por cirurgia foi inferior para PHASOR broca dental cirurgias (p < 0.05, teste de cauda t dois) n = 30 cirurgias por grupo e a média de 10 cirurgias por cirurgião. (B), o percentual de cirurgias (definido como nenhum dano de sangramento ou visível para a dura-máter, como observado pelo olho do cirurgião através do objectivo fixado para 350 zoom X) foi superior para PHASOR broca dental cirurgias (n = 30 cirurgias para cada grupo, um teste de cauda z). Barras de erro mostram SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Figura 3. Multiphoton imagem latente na vivo através de uma janela craniana diluída com PHASOR. (A) cálcio transientes observados com o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a foram fotografadas nos neurônios piramidais murino córtex motor vivo emcamada 4. Barra de escala = 100 µm. (B) a mesma janela mas diferente região do córtex motor de camada 4. Headfixed rato com janela de 3 mm, preparado com FASOR. Barra de escala = 30 µm. Imaged com um microscópio do multiphoton, 40 X objetivo, comprimento de onda de excitação de 1040 nm.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.

Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

piezo-high-accuracy-surgical-osteal-removal-phasor-technique-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K visualizações.  Columbia University Medical Campus. Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can produce a rewarding effect that strengthens action-outcome associations and reinforces future behavior directed at obtaining these foods. Increasing evidence that the rewarding effects of energy-dense foods play a profound role in overeating and the development of obesity has heightened interest in studying the genes, molecules and neural circuitry that modulate food reward1,2. The rewarding impact of different stimuli can be studied by measuring the willingness to work to obtain them, such as in operant conditioning tasks3. Operant models of food reward measure acquired and voluntary behavioral responses that are directed at obtaining food. A commonly used measure of reward strength is an operant procedure known as the progressive ratio (PR) schedule of reinforcement.4,5 In the PR task, the subject is required to make an increasing number of operant responses for each successive reward. The pioneering study of Hodos (1961) demonstrated that the number of responses made to obtain the last reward, termed the breakpoint, serves as an index of reward strength4. While operant procedures that measure changes in response rate alone cannot separate changes in reward strength from alterations in performance capacity, the breakpoint derived from the PR schedule is a well-validated measure of the rewarding effects of food. The PR task has been used extensively to assess the rewarding impact of drugs of abuse and food in rats (e.g.,6-8), but to a lesser extent in mice9. The increased use of genetically engineered mice and diet-induced obese mouse models has heightened demands for behavioral measures of food reward in mice. In the present article we detail the materials and procedures used to train mice to respond (lever-press) for a high-fat and high-sugar food pellets on a PR schedule of reinforcement. We show that breakpoint response thresholds increase following acute food deprivation and decrease with peripheral administration of the anorectic hormone leptin and thereby validate the use of this food-operant paradigm in mice.

The present report details the protocol employed to measure the rewarding effects of high-fat food in mice using a progressive ratio operant conditioning task.

Relação progressiva Respondendo para Alimentos gordurosos e High-açúcar Palatable em Ratos

Foods that are rich in fat and sugar significantly contribute to over-eating and escalating rates of obesity. The consumption of palatable foods can ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Lateral Crônica Cranial Janela Preparação Ativa<em&gt; In Vivo</em&gt; Observação Após Distal Middle Cerebral Oclusão da Artéria em Ratos

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous deoxyhemoglobin as an endogenous contrast agent to detect changes in blood-level-dependent oxygenation (BOLD effect). We combined fMRI with a novel robotic device (MR-compatible hand-induced robotic device [MR_CHIROD]) so that a person in the scanner can execute a controlled motor task, hand-squeezing, which is a very important hand movement to study in neurological motor disease. We employed parallel imaging (generalized auto-calibrating partially parallel acquisitions [GRAPPA]), which allowed higher spatial resolution resulting in increased sensitivity to BOLD. The combination of fMRI with the hand-induced robotic device allowed precise control and monitoring of the task that was executed while a participant was in the scanner; this may prove to be of utility in rehabilitation of hand motor function in patients recovering from neurological deficits (e.g., stroke). Here we outline the protocol for using the current prototype of the MR_CHIROD during an fMRI scan.

We performed functional MRI using a novel MRI-compatible hand-induced robotic device to evaluate its utility for monitoring hand motor function in individuals recovering from neurological deficits.

Ressonância magnética funcional em conjunto com um novo dispositivo robótico induzido à mão compatível com ressonância magnética para avaliar a reabilitação de indivíduos que se recuperam de déficits de aperto de mão

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

A Revised Surgical Approach to Induce Endolymphatic Hydrops in the Guinea Pig

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) remain unclear. In order to adequately study the attributes of endolymphatic hydrops, such as the origins of low-frequency hearing loss, a reliable model is needed. The guinea pig is a&#160;good model because it hears in the low-frequency regions that are putatively affected by endolymphatic hydrops. Previous research has demonstrated that endolymphatic hydrops can be induced surgically via intradural or extradural approaches that involve drilling on the endolymphatic duct and sac. However, whether it was possible to create an endolymphatic hydrops model using an extradural approach that avoided dangerous drilling on the endolymphatic duct and sac was unknown. The objective of this study was to demonstrate a revised extradural approach to induce experimental endolymphatic hydrops at 30 days post-operatively by obliterating the endolymphatic sac and injuring the endolymphatic duct with a fine pick. The sample size consisted of seven guinea pigs. Functional measurements of hearing were made and temporal bones were subsequently harvested for histologic analysis. The approach had a success rate of 86% in achieving endolymphatic hydrops. The risk of cerebrospinal fluid leak was minimal. No perioperative deaths or injuries to the posterior semicircular canal occurred in the sample. The presented method demonstrates a safe and reliable way to induce endolymphatic hydrops at a relatively quick time point of 30 days. The clinical implications are that the presented method provides a reliable model to further explore the origins of low-frequency hearing loss that can be associated endolymphatic hydrops.

This article demonstrates an extradural approach to obliterate the guinea pig endolymphatic sac and injure the endolymphatic duct with a fine pick in order to induce experimental endolymphatic hydrops.

Uma abordagem cirúrgica revisada para induzir hidrops endoglicêsticos na Cobaia

Endolymphatic hydrops is an enlargement of scala media that is most often associated with Meniere&#39;s disease, though the pathophysiologic mechanism(s) ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

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