Name: piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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이 문서에 있는 multiphoton 이미지를 얻을 수 있도록에 대 한 타 라 Zeric. 두뇌 및 행동, 파 킨 슨 병 및 JPB 기초, R01 MH108186 R01 DA07418에서 지원. F31 친목 1F31MH109293-01A1 S c

동물 관련 된 기준에 따라 수행 하는 모든 절차는 컬럼비아 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 설정 합니다. 안락사는 마 취 제와 마 취에서 자 궁 경부 전위를 통해 수행한 100 mg/kg 및 xylazine 10 mg/kg intraperitoneally 주입. 모든 외 과적 멸 균 방식으로 수행 되었다 (외과 의사 머리 모자, 얼굴 마스크, 멸 균 장갑, 그리고 깨끗 한 일회용 랩 코트 입고 있던) 수술 도구 각각의 사용 사이 압력가 마로 소독 했다.
1. presurgical 단계
<ol><li>고압 무 균을 보장 하기 위해 모든 수술 기구.</li>
	<li>Isoflurane (유도 대 한 4% 및 수술에 대 한 1.5-2%)와 C57bl6 마우스 anesthetize 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해 뒷 발가락 마다 10 분을 꼬집어. 발성 이나 뒷 다리 철회 볼 경우 마 취를 증가.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 눈에 수의 눈 윤 활 유를 적용 합니다.</li>
	<li>3 분 신청 머리 제거 젤 또는 전기 면도기로 면도 하 여 두 피에 머리카락을 제거 합니다.</li>
	<li>장소는가 열 패드 또는 담요 세트 38 ° c를 재순환 하는 보정된 물에 stereotaxic 프레임에서 마우스</li>
	<li>Presurgical 무 통을 제공 하기 위해 피하 buprenorphine (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
	<li>액체 또는 betadine와 70% 에탄올 솜 밀고 주걱을 사용 하 여 세 가지 대체 응용 프로그램으로 두 피를 치료.</li>
	<li>100ml 희석 bupivacaine 50% 식 염 수 국 소 마 취를 제공 하기 위해 두 피 아래에 주입.</li>
</ol>2. 압 전 두개골 창 수술
<ol><li>압력가 마로 소독 멸 균 수술 도구를 사용 하 여 제거 두 피의 1 cm 원 두개골 이상 절단 하 여 원형 패턴에서 수술가 위. 두개골 뼈를 통해과 조직 노출에서 두 피를 들어올립니다.</li>
	<li>집게의 팁을 사용 하 여 모든 나머지과 조직의 분명 노출 된 뼈를 긁어. 이 치과 시멘트 것 이다 떨어지지 않을 나중을 위해 중요 하다.</li>
	<li>가장 낮은 설정에 진동 압 전 수술 단위를 설정 합니다. Note 높은 설정 강렬한 진동으로 인해 혈관을 깰 수 있습니다.</li>
	<li>핸드 피스를 멸 균 순환 팁을 수정 합니다. 참고: 4 m m 원형 팁은 수술에 대 한 적합 합니다. 큰 팁 크기 전체 윈도우 동시에 thinned 수 있습니다으로 수술의 속도에 기여 한다.</li>
	<li>얼음 차가운 인공 뇌 척추 액체 (실제)와 10 mL 주사기를 압 전 핸드 피스를 들고 손을 있습니다.</li>
	<li>1 mL/분의 속도로 두개골에 주사기에서 실제 또는 떨어지는 하 여 두개골을 관개, 두개골 위에 연동 펌프를 사용 하 여 무료로 다른 한편의 사용. 참고: 차가운 실제와 관개는 고주파 진동에서 마찰로 인해 과열을 방지 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 빛 원형 모션으로 두개골에 진동 외과 팁을 적용 (1 당 3 원 s) 얇은 두개골 준비 (5 ~ 10 분) 수행을 원하는 깊이 뼈 얇은. 참고: 여기, 4 m m 창 했다 20 µ m를 박 형 했다 그. 그러나, 윈도우의 크기는 수술 팁의 크기와 달라 집니다. 뼈의 두께 팁을 적용 하는 두개골에 보낸 시간의 길이에 따라 원하는 깊이를 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 handpiece의 각도 조정 하 고 균일 하 게 두개골을 얇은 두개골에 압력을 적용 하는 동안 팁의 각도 변경 합니다.</li>
	<li>뒤에 어떤 얇은 뼈를 남기지 않고 완전 한 뼈 제거를 수행, 균열 창 주변 표시 될 때까지 뼈를 얇은. 기본 dura 손상 없이 집게와 얇은 뼈의 남은 부스러기를 제거 합니다.</li>
	<li>차가운 실제 hemostatic 콜라겐 거품의 1 m m 부분을 담근 다. 집게와 젖은 거품을 누른 얇은 두개골에 배치 합니다. 약 30 얇은 두개골에 앉아서 수 중지 어떤 마이크로 s 개발에서 유혈.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 4 m m 유리 coverslip 뼈에 박 형 창 옆으로 놓고.</li>
	<li>작은 플라스틱 또는 나무 주걱을 기울였다 면의 뒷면을 사용 하 여 장소에는 창 잡아 두개골에 치과 아크릴의 약 100 µ L를 적용.</li>
</ol>3. 포스트 수술 케어
<ol><li>수술 기구에서 마우스를 제거 하 고 복구에 대 한가 열에 놓습니다. 그것은 완전 한 의식 (정상적인 이동성, 걸음 걸이, 및 행동 평가) 회복 될 때까지 계속 모니터링 합니다.</li>
	<li>평가 동물 손질, 음식, 그리고 물 소비, 행동 (예: 절 뚝 거리 또는 돌출된 자세)를 지키고 또는 침략을 증가 하는 감소 활동을 포함 하 여 수술 후 통증의 발현에 대 한 일 동안 하루에 두 번. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에는 동물을 반환 하지 않습니다.</li>
	<li>Buprenorphine 관리 (0.05-0.1 mg/kg) 3 일 동안 수술 후 진통 8-12 h로 피하. 밀접 하 게 dehiscence, 염증, 그리고 감염의 징후에 대 한 수술을 다음과 같은 윈도우의 영역을 모니터링 합니다. 동물을 반환 하지 않으면 베이스 수 유 및 동작을 손질 가능한 개입 또는 안락사에 관한 수 의사를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. 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J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

아무 공개 있다.

수술 수술 끝을 변경 하 여 수정할 수 있습니다. 핸드 피스에 적용할 수 있는 팁을의 많은 다른 크기가 있다. 팁의 모양 또는 크기를 변경 하는 것은 다른 크기의 창 귀 착될 것 이다. 4 m m 팁 이외에 우리는 또한 3 m m 팁을 시도 하 고 그것은 또한 잘 작동을 발견. 얼음으로 관개와도 차가운 실제, 우리는 했다 너무 너무 많은 열을 발생 하 고 선도 손상 기본 dura 뼈 굽기 집중된 진동 때문 (약 0.25 m m)를 좁은 팁으로 좋은 결과를 얻을 수 없습니다. 우리는 다양 한 사용할 수 있습니다, 다른 팁을 시도 하지 않은 그리고 우리 기대 하는 다른 연구소가 다른 팁에 대 한 새로운 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 수술은 비교적 간단 하 고, 하는 동안 우리는 문제 해결에 필요할 수 있는 몇 가지 단계는 발견. 첫 번째는 진동 팁 가시성을 감소 하 고 뼈 수술의 단계 숱이 동안 뼈 깊이 확인에 어려움을 생산 실제 난 기류를 많이 생산. 우리가 좋습니다 얼마나 얇은 뼈가, 뼈의 측면에 멸 균 면봉을 적용 하 여 두개골과 창 건조 휴식 하기 너무 어렵습니다. 거친 표면 얇은 뼈를 손상 이후 면봉, 창에 직접 적용 되지 않습니다. 깊이 확인 한 후 실제 적용 하 고 수술 계속 합니다. 우리는 또한 그 경질에 손상이 있는 경우에, 그것은 일반적으로 외과 의사는 팁에 너무 많은 압박으로 인해 발견. 핸드 피스를 더 부드럽게 누른 적은 힘이 문제를 해결할 가능성이 것입니다. 외과 의사는 강제로 뼈에 팁을 근 근, 하는 경우 그것은 얇은 뼈에 휴식을 일으킬 하 고 두개골 손상. 마지막으로, 뼈를 숱이 후 기본 dura 나타나면 상처, 진동에서 과도 한 열으로 인해 높습니다. 실제 흐름의 속도 증가이 문제를 해결할 것입니다.
벡터의 주요 제한은입니다 핸드 피스는 뼈를 얇은 수 있습니다 하지만 경질을 통해 모든 뼈를 제거할 수 없습니다. 다이아몬드 코팅된 팁 작은 거친 범프 있다. 두개골 얇은 필요한 마찰 경질을 침식 하 고 모든 뼈를 제거 하는 데 사용 된 경우 출혈이 발생할 것. 따라서, 집게를 사용 하 여 나머지 얇은 레이어를 제거 해야 합니다. 여부 얇은 두개골을 통해 이미징 덜 염증과 microglia 및 반응성 이다 확산을 덜 생산에 지속적인 논쟁이 있지만, 어떤 경우에 남아 있는 아무 뼈와 창 선호, 예를 들어, 제공 하는3 이미징의 더 깊이 .
우리는 쥐에 있는 multiphoton 이미징 두개골 창 준비를 최적화 했습니다. 벡터는, 우리의 지식, 광학 이미징 설치류 두개골 창 수술 압 전 기술의 첫 번째 응용 프로그램. 우리는 쥐에 압 전 수술의 사용 증가 속도의 장점을 공유 하 고 또한 인간7,8,,910에 보고 된 부작용을 감소 발견. 압 전 장치 활용 빠른 수술 (그림 2A) 귀착되 고 고속 회전에 비해 출혈의 적은 부작용 드릴 (그림 2B). 우리 또한 발견, 연구소, 내 위상 쉽게 새로운 외과 두개골 창 수술에 전통적인 접근 보다는 법을 배워야 했다. 속도의 장점과 사용 용이성 외과의 사이 다를 가능성이 있습니다. 얇은 두개골 준비는 일반적으로 페이저 접근 일반적으로 미만 10 분을 요구 하면서 드릴 및 메스2, 뼈를 얇은 30-45 분 필요 합니다.
우리는 위상 준비 windows에 우리가 레이어 4 피라미드 뉴런 adeno 관련 바이러스 칼슘 표시기 JRGECO1a 인코딩 페 했다 모터 피 질에서에서 칼슘 과도 이미지 수 발견 (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). 우리 또한 발견, 메스와 로타리 드릴 준비 얇은 두개골 두개골 창에 비해, 이미징 지역 얇은 두개골 로타리와 함께 준비 하는 동안 더 큰 되었고 메스는 20 µ m 직경2의 영상 창 . 벡터와 함께 우리는 신속 하 게 3-4 m m의 얇은 수 있었다. 포트4보고 이미징 윈도우와 비슷합니다. 이 큰 창 빠른 이미징 얇은 두개골 창 메스와 치과 드릴 준비에 대 한 보고의 혜택을 유지 합니다. 또한, 벡터와 준비 창 즉시 군데 수, 전통 뼈 제거 반대 주 창 최적의 수 전에 치료 해야 windows3군데.
이 기술은 공부 경질 아래 혈관에 혈액의 흐름에 변경 적용할 수 있습니다. 중요 한 미래 연구는 두개골 창의 다른 방법으로 벡터의 immunoreactivity를 비교 하는. 이 경우 벡터 기존의 방법에 비해 적은 염증 생성을 결정 하는 중요 한 것입니다. 여기 문서화 압 전 수술 방법 더 많은 연구소 두개골 windows 수행 하 고 성공적으로 다에서 vivoimaging을 사용 하면 노력 하겠습니다.
실제 일정 한 속도로 관개 되는 handpiece 가장 낮은 설정에 진동으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 실제를 지속적으로 적용 한다 얼음 감기 또는 그것 열 것 이다 고 경질 손상. 우리는 적어도 1 mL/분 주사기를 사용 하거나, 손에서 개최 하거나 내장 관개 보다는 연동 펌프를 사용 하 여 핸드 피스에서의 실제를 적용 해야 합니다 발견. 핸드 피스에서 관개 시스템 실제 너무 강제로 배출 하 고 가시성을 크게 저하 됩니다 너무 많은 난 기류 생산.

두개골 창 수술 다 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 설치류를 준비 하는 신경 과학에 있는 중요 한 기술 되었다. 제거 또는 뼈의은 multiphoton 현미경 광학 이미징에 대 한 마우스를 준비 해야 합니다. 이 수술은 완전히 노출 기본 경질1, 뼈의 영역을 제거 하거나 경질2에서 완전 제거 하지 않고 뼈의 영역을 숱이 수행 됩니다. 얇은 두개골 접근 적은 염증과 microglia3 의 활성화를 생산 수 있습니다 하지만 이미지, 작은 이미지 창 크기 (200 µ m)와 제한 된 기간 동안 창 때문에 뼈 자라나2 군데 수의 얕은 깊이 제공 한다 . 광택 및 강화 유리 창 (포트)의 추가 영상 크기 및 영상 기간을 증가 시킬 수 있습니다 하지만4를 수행 하기가 어렵습니다.
모두 현재 수술 얇은 또는 두개골에서 뼈를 제거 하는 고속 회전 드릴을 사용 합니다. 얇은 두개골 기술 또한 더 얇은 뼈2훈련 후 메스를 사용 합니다. 포트 기술은 고속 연마 모래4의 추가 단계를 해야 합니다. 고속 회전 드릴, 공기 구동 터빈 또는 전기 모터는 빠른 속도로 회전 하는 드릴 비트를 발생 합니다. 로타리 드릴 섹션 뼈와 연 조직, 경질을 손상 하 고 혈관을 기본의 위험이 있다. 수술의 성공 여부는 의사의 기술에 따라 달라 집니다. 이 창은 기계 수술 방법으로 준비, 뿐만 아니라 광학 지우고 다른 솔루션으로 두개골의 화학 방법은 개발된5,6되었습니다. 그러나, 압 전 수술 수술의 기계적 방법 이기 때문에, 여기에 우리의 비교 다른 기계적인 방법으로 제한 될 것입니다.
압 전 수술 장치 없이 손상 기본 부드러운 조직, 광물 화 된 뼈를 뜨 초음파 진동을 이용 하 고 따라서 빠르게 얇은 뼈의 큰 지역에 대 한 접근을 제공. 압 전 외과 핸드 피스에서 터빈은 세라믹 디스크의 더미로 대체 하 고 전류를 적용 하는 경우 디스크 초음파 주파수에서 진동. 진동은 뼈 손상 부드러운 조직 없이 조직 형식 간의 차별 하지 않는 회전 훈련 이점을 통해 잘라 코팅된 팁 다이아몬드를 핸드 피스를 통해 전송 됩니다. 압 전 수술 토마 소 Vercellotti에 의해 인간의 사용을 위해 원래 개발 되었다 고 치과에 개선과 cranio-maxilofacial 수술7,,89,10,11 주도하 고 있다 .
압 전 수술 Wistar 쥐에는 뼈를 만드는 데 사용 되었습니다 그리고 자기 공명 영상 (MRI)와 전통적인 치과 드릴12보다 훨씬 적은 피해를 생산 하는 조직학 발견 됐다. 저자 압 전 수술 소프트 뇌 조직 근처 뼈를 제거 하기 위한 안전 했다 결론을 내렸다. 그러나 쥐,, 더 쉽게 손상 된 얇은 경질 있고 그 연구는 만성 광 이미징에 대 한 windows를 준비 하지 않았다. 만성 이미징 혈관이 손상 되지 및 창 아래 혈전 형성 하지 않습니다 필요 합니다. 경질에 손상을 염증으로 인해 창에서 클라우드, 리드 microglia 및 반응성 이다의 확산을 활성화 하 고. 여기 우리가 만들 얇은 두개골과 전체 뼈 제거 두개골 windows 만성 이미징에 대 한 적합 한 마우스에 대 한 압 전 수술을 최적화 했습니다. 우리는 두개골 창 수술 고속 회전 드릴 준비를이 수술 기법을 비교.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP model has the same settings</td></tr><tr><td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td></tr><tr><td>Stereotax frame</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump for irrigation.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Much stronger than regular dental acrylic.</td></tr><tr><td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube opthalmic ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN Vector Core</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

Multiphoton 현미경 널리 뉴런에 vivo에서화상 진 찰에 대 한 적응 되었습니다. 반복 된 이미징 두개골 창의 주입 또는 반복 되는 두개골의 숱이 필요 합니다. 두개골 창 수술은 일반적으로 고속 회전 드릴으로 수행 하 고 많은 조사자 섬세 한 경질 및 혈관 손상에서 훈련을 방지 하기 위해 도전 찾으십시오. 광범위 한 훈련 및 연습의 기본 조직에 손상 없이 뼈를 제거 하는 데 필요한 이며 따라서 두개골 창 수술 수 어려운, 많은 시간이 소요 되며 생산 조직 손상. 압 전 수술, 악 안 면 및 치과 수술을 위해 광범위 하 게 사용 되는 부드러운 조직 손상 없이 뼈를 제거 하는 초음파 진동을 활용 합니다. Multiphoton 이미징에 대 한 준비에 쥐에 있는 두개골 창 수술을 개선 하기 위해 압 전 수술을 적용 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 실험실 내 비교 방법을 적은 수술 시간이 필요 회전 드릴으로 두개골 창 수술 보다 경 막 출혈 때문에 합병증의 낮은 평균 속도가지고 찾을.

압 전 수술을 계속 하기 전에 두개골에서 잔여 어떤과 제거 합니다. 일단 두개골은 불투명 하 고 부드러운 (그림 1a), 외과 의사는 압 전 수술을 시작할 수 있습니다. 진동 피 팁과 뼈를 제거, 그것은 얼음으로 두개골을 관개 하는 중요 한 찬 실제. 적절 한 관개 하단 1 m m 팁의 실제 (그림 1b)에 빠져들 때 이루어집니다. 적절 한 관개 없이 뼈가 과열 하 고 두뇌를 손상 것입니다. 두개골은 외과 의사에 의해 선택 원하는 깊이에 박 형 되었습니다, 후 거기 일부 잔여 뼈에 있는 혈관에서 출혈이 있을 수 있습니다. 빠르게 모든 출혈 중단, 콜라겐 거품의 작은 1 m m 조각 적용 하려면 윈도우의 영역을 실제에 배어. 콜라겐 약 30 두개골에 게 s (그림 1c). 콜라겐 거품 제거 후 창이 반투명, 경질에서 혈관의 명확한 시각화 수 있도록 표시 됩니다. 경질 상당한 멍이 없이 그대로 될 것입니다. (그림 1의 d)입니다. 경질 나타나면 빨간색과 염증, 수술 하는 동안 팁에 적용 하는 너무 많은 압력에서 깨진된 혈관으로 인해 높습니다. 새 창을 보호 하 고 만성 이미징에 대 한 준비, 유리 coverslip 지역에 배치 되어야 합니다. 제대로 적용 된 유리 coverslip 됩니다 부드럽게 창 위에 앉아서 영역에 손해를 발생 하지 않습니다. 유리 coverslip 창의 전체를 커버 해야 합니다. 유리 coverslip 두개골에 제대로 적용 되, 창 유리에서 반투명 상태로 유지 됩니다. 경질 모든 혈관 여전히 표시 (그림 1e) 됩니다. 치과 아크릴 영구적으로 두개골의 표면에 고착 하 유리 coverslip 주위 적용 되어야 합니다. 유리 coverslip 가장자리 치과 아크릴 (그림 1 층)에 적용 해야 합니다.
우리 압 전 수술은 일반적으로 전통적인 두개골 창 보다 훨씬 빠르게 수술 (그림 2A) 당 약 10-12 분을 복용 발견. 우리는 또한 발견 했다 경질 멍이 출혈 (그림 2B) 눈으로 관찰로 인해 적은 합병증. 적절히 창 대뇌 피 질의 뉴런 vivo에서 형광 표시기의 multiphoton 이미징을 허용할 것 이다. 우리는 계층 4 대뇌 피 질의 뉴런의 셀 시체에 빨간 칼슘 표시기 JRGECO1a 이미지를 선택 (그림 3A-3B). 우리는 벡터를 사용 하 여 준비 하는 창을 통해 이러한 셀 시체에서 칼슘 과도 관찰 수 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> 그림 1: 압 전 수술. (한) 후 두개골 제대로 준비가 되었습니다 위상에 대 한. 모든 periosteal 조직, 부드럽고 깨끗 한 표면을 떠나는 제거 되었습니다. (b) 진행 중인 위상의 대표 이미지. 하단의 외과 팁 얼음에 빠져들은 진동의 1 m m 감기 실제. 액체는 1 mL/min의 속도로 두개골에 적용 됩니다. 빛 원형 모션 두개골에 적용 되 고 뼈는 초음파 진동을 통해 박 형. (c) 후 두개골 박 형, 콜라겐 거품 1 m m 원형 조각의 실제 뼈에서 어떤 마이크로 물림을 막으려고 창에 허용 하는 감기에 배어. 반투명 경질 (d) A 성공적인 창 그대로 혈관의 모든 표시 됩니다. 저기 보이는 손상 또는 두뇌의 표면에 멍이. (e) 유리 coverslip 뇌의 표면을 보호 하기 위해 창 위에 배치 됩니다. (f) 치과 아크릴 창 유리 coverslip를 영구적으로 해결 하려면 두개골에 적용 됩니다. 규모는 모든 이미지에 1mm를 바.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> 그림 2입니다. 벡터 또는 치과 훈련 성공률의 비교 드릴 수술. 수술 당 (A) 평균 시간 위상에 대 한 치과 드릴 수술 보다 더 낮 았다 (p < 0.05, 두 꼬리 t 테스트) n = 그룹 당 30 수술 및 외과 의사 당 10 수술 평균. (B) 성공적인 수술 (350 X 확대/축소를 설정 하는 목표를 통해 외과 의사의 눈으로 관찰 경질 출혈 또는 보이는 손상으로 정의)의 비율 보다 더 높았다 위상에 대 한 치과 드릴 수술 (n = 30 수술 각 그룹에 대 한 하나 꼬리 z 테스트)입니다. 오차 막대 표시 sd.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> 그림 3입니다. Vivo에서 두개골 창을 통해 이미징 다 PHASOR thinned. 과도 빨간 칼슘 표시기 JRGECO1a 관찰 했다 murine 모터 피 질 vivo에서 계층 4 피라미드 뉴런에서 몇 군데는 (A) 칼슘 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 같은 창 하지만 레이어 4 모터 코르 텍 스의 다른 지역. Headfixed 마우스 3 m m 창 위상으로 준비 합니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 군데 multiphoton 현미경, 40 X 목표, 1040 nm 여기 파장.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

압 전 수술 개선 인간의 악 안 면 및 치과 수술을 주도하 고 있다. 우리는 쥐에 두개골 창 수술에 대 한 압 전 수술을 최적화 하기 위해 프로토콜을 개발 했습니다.

압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

piezo-high-accuracy-surgical-osteal-removal-phasor-technique-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K 조회수.  Columbia University Medical Campus. 압 전 수술 개선 인간의 악 안 면 및 치과 수술을 주도하 고 있다. 우리는 쥐에 두개골 창 수술에 대 한 압 전 수술을 최적화 하기 위해 프로토콜을 개발 했습니다.

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Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

연구

신경과학

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

발생학

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

의학

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

마우스의 두개골 창 수술을 위한 로봇 천공 개두술의 열 손상 평가

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

자유롭게 움직이는 마우스의 FUN 및 광섬유 광도계를 위한 통합 프로토콜

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is compatible with most of the existing modalities for monitoring brain functions in vivo. Integration with brain function recording modalities not only enables us to address orders and disorders of specific brain functions with closed-loop feedback but also provides us with mechanistic insights about FUN itself. Here, we provide a modified, simple, dependable, and robust protocol for the simultaneous application of FUN and fiber photometry GCaMP6s fluorescence recording in free-moving mice. This involves the fabrication of a well-sized single transducer and its temporary placement on the mice, along with the secure fixation of a fiber optical implant to facilitate the smooth passage of the transducer. The combination of FUN and fiber photometry provides for the optical recording of neural circuitry responses upon FUN in real-time in deep brain regions. To demonstrate the efficiency of this protocol, Thy1-GCaMP6s mice were used as an example to record the neuroactivity in the anterior thalamic nucleus during FUN while the mice are freely moving. We believe that this protocol can promote the widespread use of FUN in both the neuroscience field and the biomedical ultrasound field.

저자 스포트라이트: 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 조절을 조사하기 위한 섬유 광도계와 집속 초음파 신경 조절의 통합

The protocol includes transducer manufacturing, parameters reporting, surgical procedure, and signal recording for the entire operational workflow of concurrent focused ultrasound neuromodulation and fiber photometry recording in free-moving mice.

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

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쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

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Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록