ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

このプロトコルは、通常は何もないショウジョウバエの成人神経新生を引き起こす中心的な脳損傷方法を示すため、重要である。この技術を用いて、成人の神経新生の根底にある分子メカニズムを理解することは、ヒトの神経再生に関連すると予想されます。このテクニックを学ぶには忍耐と忍耐が必要です。

分析のために脳を収集する前に、数週間毎日5〜10頭の脳で練習することをお勧めします。二酸化炭素パッド上のハエを麻酔した後。新たに閉鎖されたF1の若い雄のハエを分化してから6時間以内に並べ替え、バイアルあたり40個以下のハエを含む清潔なバイアルに入れます。

EdUで分割細胞にラベルを付ける予定の場合は、10%スクロースで50ミル以上のEdUを200マイクロリットル調製し、調製した溶液を空のバイアル内の23ミリメートルの丸級3濾紙に置き、オスのハエをバイアルに入れて、怪我の6時間前に前送りを行います。次に、70%エタノールを充填した1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に約100ピンを5分間入れることで、ミヌーティエンピンを消毒します。その後、70%エタノールを噴霧し、清潔なリントフリー組織で乾燥させて二酸化炭素パッドとペイントブラシを消毒します。

工具が清潔で乾燥したら、40人以下の並べ替えられたF1男性を清潔なパッドに移し、2つのグループに分けます。1つのグループは、コントロールの怪我のないハエとして機能します。そして、2番目の実験グループは、外傷性脳損傷を貫通する。

次に、鉗子を使用してマイクロ遠心チューブから4〜5本の新しいMinutienピンを引き出し、二酸化炭素パッドの端の近くに置きます。その後、解剖スコープの下で鋭いポイントを持つまっすぐなミヌーティエンピンを選択します。シャープなピンを再利用し、損傷または鈍いピンを70%エタノールを含む別のチューブに入れ、安全に処分します。

次に、ステレオ顕微鏡LEDランプの標準クロスジェノタイプスイッチを備えたハエに対しては、440〜460ナノメートルで励起を可能にし、500〜560ナノメートルで視覚化できる緑色蛍光タンパク質に適した励起および発光フィルタを備えています。次に、実験群のフライを選択し、実験者が右に向かうハエとヘッドカプセルの後ろ図を持つようなハエを配置します。鉗子を使用して、選択したミヌーティエンピンを片手で拾い、もう一方の手でペイントブラシを持ち上げる。

その後、胸郭の胸郭の前部にブラシを置き、ハエを安定させるために穏やかに押し下げます。頭の右側にあるキノコ本体のセルボディでミヌーティエンピンの先端を狙い、ヘッドカプセルを貫通します。ランドマークを使用する場合は、オセリと眼の後縁の間の後頭のキューティクルをターゲットにします。

怪我をした後、ペイントブラシを使ってミヌーティエンピンから頭をそっと押し出します。RNAシーケンシングまたはQRT PCRに脳を使用する場合、頭の左側に2度目の損傷を与えます。すべての実験的なハエが負傷すると、コントロールを配置し、負傷したハエは、食品を含む別のラベル付きバイアルに配置します。

ハエが食べ物に巻き込まれるのを防ぐために、バイアルを水平に置きます。標準的な十字架のハエを摂氏25度に置き、パーマトウィンは摂氏30度から年齢まで飛びます。24時間以上老化した場合、ハエは1〜2日ごとにきれいな食べ物で移動します。

増殖の有意な増加は、積極的に有糸分裂を起こしている細胞のマーカーである抗pH3を用いて24時間後傷害を観察した。コントロールの中心脳のそれぞれで約 3 つの pH3 陽性細胞が観察されます。.そして、負傷した中央脳のそれぞれで11 pH3陽性細胞。

7日までに、各コントロール細胞の脳に平均2個のEdU陽性細胞が存在する。そして、負傷した中央脳のそれぞれにおいて11個のEdU陽性細胞は、pH3抗体による24時間後傷害を得た結果と同様である。14日間のコントロールでは、中央脳あたり1つのEdU陽性細胞を平均し、負傷した脳は中央脳あたり平均29個のEdU陽性細胞を検出した。

細胞増殖が外傷性脳損傷の後、少なくとも第2週に続く実証。脳が発折後最初の24時間以内に負傷した場合、中央脳で最も強い増殖反応が観察される。7日間の除腸後の傷害は依然として増殖の有意な増加を引き起こす。

しかし、14日までに、細胞が分裂する能力は、脳ごとに1つの分裂細胞に有意に低下する。これは、コントロール脳のそれと似ています。パーマトウィン標識システムを使用すると、コントロールと比較して2日間で2週間で負傷したサンプルでより多くのパーマトウィンクローンが検出された。

クローンの数は、損傷後の時間の経過とともに増加します。2週間後の怪我の後、負傷した脳の50%に新しいキノコの体ニューロンがありました。これらの新しいニューロンは、キノコの体のケイリックスにほぼ彼らの樹状突起を投影しました, キノコの体のローブに軸索.

再生するように見えた脳の他の領域には、楕円体アンテナローブと横角が含まれます。鈍いまたは曲がったピンの使用が死亡率を増加させるので、脳損傷を行う際には、鋭いミヌーティエンピンを使用してください。また、これはまた、死亡率を増加させるので、ペイントブラシでハエにあまりにも強く押さないようにしてください。

この手順に従って、免疫組織化学を使用して自己増殖を定量化し、新しいニューロンおよびグリアを同定することもできる。