Name: application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
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著者は、アルニム Jenett、Aljoscha ナーンサイ、アドバイスのルービン研究室の他のメンバーと未発表試薬および共焦点画像を生成するため Janelia 飛ぶ光プロジェクト チームの共有をありがちましょう。著者も原稿のコメントをガリア研究室のメンバーに感謝します。

1。 多色 FlpOut (MCFO) 実験用のハエの準備 注:、MCFO 技術と呼ばれる Flp を介した停止カセット切除 (FlpOut) の修正バージョンを指します。MCFO ハエの遺伝子を運ぶ熱ショック プロモーター (hsp)-Flp リコンビナーゼや UA の下で別の記者を制御します。各レポーターから成っているエピトープ タグを 10 枚でにおける (myr) スーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) の共通バックボーン (e.g。、HA、旗または V5) が挿入されています。結果の非蛍光性タンパク質は、名前付き &#34; スパゲッティ モンスター受けた &#34; (smGFPs) 14 と異なるエピトープ タグに対して特定の抗体を使用して検出することができます。
<ol><li>クロス MCFO カセットと hsp Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) (材料表参照) 適切なグリア GAL4 ドライバー行へ飛ぶ.
	<ol><li>Hsp が 25 ° C でアクティブになって、いくつかの細胞が非特異的ラベル付けにつながる再結合を受ける可能性がありますは、水漏れしたため、システムを避けるために 18 ° C の交点を設定します。F1 世代を取得する 18 の ° C で約 20 日間を待ちます。熱後 (手順 2 を参照) に衝撃を与える、25 ° C ( 図 3) でハエを維持します</li>。
	</ol></li></ol> 2。衝撃を熱 注: 挿入部位によって hsp Flp の効率は異なります; したがって、最適な熱衝撃時間が最適化するようにしました。このプロトコルでは、hsp Flp が X 染色体に挿入された MCFO フライのストックが使われています (材料の表 を参照してください).
<ol><li>転送の子孫ステップ 1.1 十字架 (F1 世代ハエ、3-4 日古い) 食品と熱を含む新しいバイアルには、37 の ° C の水浴中で彼らを驚かせた 。
	注: 若いハエ (1-2 日古い)、熱衝撃に非常に敏感。1 または 2 の治療による死亡率を減らすためにヒート ショックを実行する前より多くの日を待ちます。F1 世代のいくつかは熱ショックなしのコントロールとして飛ぶ使用します</li>。
	<li>熱ショック時のストレスによる死亡率を減少させるために食物と一緒に普通のバイアルにハエを維持します。女性と男性、別のバイアル</li>。
	<li>均一熱ショックのように水に全体のバイアルを浸すことを確認してください。適切な出発点として多く GAL4 ドライバー行とグリア細胞の疎ラベルに 5-8 分ショックを使用します。ショック期間に各ドライバーおよび実験 (短いまたは長い熱衝撃時間が必要になる場合があります) の最適化しなければなりません</li>。
	<li>熱衝撃から回復するハエを許可するために数分間ベンチに水平にバイアルを置く熱ショック後 。
	注: バイアルを変更する必要はありません</li>。
	<li>25 ° C でハエを維持し、解剖 (手順 3 と 4 を参照してください) に最適な記者式の熱ショック後の日が 2 以上</li>。
</ol> 3。解剖準備およびソリューション <ol><li>、解剖の日は、20% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 %pfa 解を得るための 20 μ L で S2 細胞培養液 180 μ L を混合することによって 200 μ L の PCR チューブに新鮮な固定液を準備します。前に、解剖中に氷の上固定液を維持します 。
	注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります 。
	注: を混ぜて 2% 溶液の代わりに 4 %pfa ソリューションを準備する 200 μ L の PCR チューブで 20% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 μ L 160 μ L の S2 細胞培養培地</li>。
	<li>最適な染色結果最大管あたり 8-10 脳の遺伝子ごとの 1 つの PCR チューブを使用します</li>。
	<li>ソリューションを洗う大人の脳の準備: 0.5% 0.5% ウシ血清アルブミン PBS でトリトン X-100 。
	注: 染色液 1% トリトン X-100 を必要ことがあります。トリトン X-100 の高濃度増加抗体の組織への浸透と、深い組織 (大人の ショウジョウバエ 脳におけるシナプス領域 など) の内側にある染色領域する必要がある</li>。
	<li>ブロック ソリューションを準備: 3% ヤギ血清, 3% 通常ロバ血清と 0.5 %pbs でトリトン X-100</li>。
	<li>洗浄ソリューションとブロッキング液成人の脳を数週間の 4 ° C で保存ことができます</li>。
	<li>氷の上の深いうつ病井戸ガラス板を置くし、フィル各次のソリューションとも: pbs と S2 細胞培養培地使用の 70% エタノール 1 つ</li>。
</ol> 4。大人の脳解剖 <ol><li>3 cm の皿を解剖顕微鏡のステージ上の位置し、冷たい S2 細胞培養培地でそれを埋めます。解剖手順中に組織が健康な状態であることを確認するこの中にすべての解剖を実施します 。
	注: ブラック シリコーン (イメージ) で良い背景のコントラストを提供する複数のミリメートルと並んで解剖皿を使用し、解剖時に鉗子を保持します</li>。
	<li>CO 2 と目的遺伝子型のハエを麻酔します</li>。
	<li>鉗子、翼で飛ぶをつかむ 30 の冷たい 70% エタノールで洗うと s 追加 30 冷 PBS とし、s.</li>
	<li>S2 細胞培養液で満たされている井戸の深い不況に、フライを転送します</li>。
	<li>同じ遺伝子型のすべてのハエについて同じ手順を繰り返します、解剖、組織を保持するまで冷たい S2 細胞培養培地でそれらを維持します 。
	注: 麻酔だけで S2 セル培地の培養時間が長く約 30 分の時間内に解剖することができますハエの数はティッシュを傷つけることがあります</li>。
	<li>鉗子でハエをつかむし、顕微鏡下で S2 細胞培養培地でその場が水没します</li>。
	<li>は、体の残りの部分から頭をデタッチします。体を破棄し、S2 細胞培養液中に浸漬頭を維持します。解離の全体の持続期間のための鉗子で頭を保持するために非常に重要です。組織を損傷することがなく取得することは困難であろう頭にフロートする起動する場合</li>。
	<li>は、すべての回で、少なくとも 1 つの鉗子で頭を押しながら 1 つ目を引いて、郭清を開始します。鉗子の先端は避けるために網膜のすぐ下の損傷の下に組織されていることを確認します。もう片方の目を抜くし、脳が表示されるまでにキューティクルを削除を開始します</li>。
	<li>は、すべての気管組織と脳の周りの表皮組織がきれいに表示されますまでを削除します。最適な染色結果を得る脳の周りのすべての気管組織を削除することを確認します。組織は固定し、染色する準備が整いました</li>。
	<li>タイム固定ステップするために PFA ソリューションに転送する前に冷たい S2 解剖脳細胞の培維持します</li>。
</ol> 5。大人の脳の染色 < ol> <li>は、室温 (RT) で PFA ソリューションに P10 ピペットと分離脳を転送します。組織の損傷を避けるためには、鉗子を郭清後脳を転送するため使用しないでください。200 μ L PCR チューブ、nutator ですべての手順を実行します</li>。
	<li>の手順をすべて P200 ピペットと古いソリューションを破棄する前にチューブの底に解決する脳を可能。組織を吸引せず、上澄みを削除してください。露光量から組織を保護します</li>。
	<li>修正 2% の 200 μ L で脳 S2 細胞培養培地の 1 時間または 4% PFA PFA 30 分。再現性を高めるためにサンプル間同じ固定にしてください</li>。
	<li>3 (またはそれ以上) を洗う洗浄ソリューションでは、成人の脳の 200 μ L で 15 分の後は、30 分間ソリューションをブロックの 200 μ L で組織をブロックします。解決を妨げるの長い培養時間可能です</li>。
	<li>200 μ L の総ボリュームで大人洗脳ソリューションで希釈した一次抗体と脳が 4 ° C で一晩加温 。
	注: インキュベーション時間は、使用される抗体の種類によって異なる場合があります。長い孵化必要があります。
	<ol><li>3 MCFO マーカーのラベルは、アンチの頭脳を孵化させなさい-HA (1: 500)、反フラグ (DYKDDDDK epitope) (1: 100) と反 V5 一次抗体</li>。
		<li>プライマリ直接された抗体は通常プライマリ + セカンダリの組み合わせの代わりにされる可能性があります (e.g。、反-V5:DyLight 549 (レバレッジ))。この場合、二次抗体と直接標識抗体を処理します 。
		注: 各遺伝子型の染色の特異性を確認するためのコントロールとして、いくつかの脳をしてください。一次抗体の孵化をスキップし、次の手順に進みます</li>。
	</ol></li> <li>洗浄ソリューション (ステップ 3.3) 成人の脳の 200 μ L で 3 回 1 h の組織を洗うし、洗濯ソリューション一晩 4 で大人の脳で希釈した二次蛍光体の抱合体/プライマリ直接共役抗体とそれらを孵化° C、200 μ L の総ボリュームで常温では、4 h 注: 適切な抗体の例: AlexaFluor 488 (1: 250) 反-V5:DyLight 549 (レバレッジ) と DyLight (1: 100) 647-標識抗体</li>。
	<li>の 1 h アダルト洗脳で 200 μ L の PBS 一晩で 4 ° C または RT で 1-2 時間の最終的な洗浄に続いて、ソリューションの 200 μ L で 3 回脳を洗う; PBS の最終的な洗浄ステップ トリトン X-100 の痕跡を削除し、必要があります。最適な染色結果。ガラス coverslips に耐フェード エージェントでメディアをマウントで脳をマウントします</li>。
</ol> 6。脳のイメージング用マウント はさみを使用して適切なサイズに <ol><li>トリム イメージングのスペーサー。高分解能顕微鏡の 2 つのガラス coverslips 間標本とイメージングのスペーサーをサンドイッチします 。
	注: イメージング スペーサーは薄い (0.12 mm 厚) 供試体圧縮なしの実装可能皮およびガラス coverslips または顕微鏡のスライドする棒を接着スペーサー</li>。
	<li>使用鉗子は 1 つの表面から接着性ライナーを取り外してガラス カバーガラス (22 mm × 60 mm) の表面にスペーサー、ダウン、接着面を適用します。メディアをマウントの 10 μ L を新しいガラス基板に適用します</li>。
	<li>で、P10 のピペットは、メディアをマウントの横にある、coverslip に 200 μ L 管から脳を転送します。一緒に組織ソリューションで脳を維持するためにいくつかの PBS を転送します</li>。
	<li>で、P10 のピペットは、PBS の量を制限しようとすると、メディアをマウントのドロップに PBS から脳を移動します。イメージングのスペーサーと coverslip でメディアをマウントで標本を転送します。見本をカバーするのに十分なメディアをマウントを使用します</li>。
	<li>は、スペーサーの上から他の接着性ライナーを取り外して、標本上にガラス基板を追加します。鉗子の先端でシール接着領域の上穏やかな圧力を適用します。すぐにマウントされている組織を画像または後で分析のための-20 ° C でスライドを保存します</li>。
</ol> 7。画像取得 <ol><li>40 X を用いた共焦点顕微鏡共焦点蛍光画像の取得スタック (NA = 1.2、水浸漬) 目的または 63 X (NA = 1.4、オイルの液浸) 目的 (ピクセル サイズ = 1,024 x 1,024 xy 平面で共焦点の 2 つのセクション間の距離 = 0.5 μ m)。検出器ゲインとない飽和ピクセルとピクセル値は、画像内に存在するように各チャネルのオフセットを調整します。これは情報の損失を回避し、検出器のダイナミック レンジの使用を保証します 。
	注: 3 D イメージングは時間がかかるため、測定値は別の場所で同時に複数のサンプルをスキャンすることによって自動化できます。水浸対物レンズで蒸発を防ぐには、屈折率 n と特別な油浸漬媒体を使用して = 1.33</li>。
	<li>チャネル色相と輝度の調整に変更、最大密度予測の共焦点スタックを処理し、標準的な画像解析ソフトウェアを使用して対照的 (材料の表 を参照してください).</li>
</ol>

<ol>
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作者は、競合または競合する興味を持ちます。

このプロトコルでは、高解像度で興味の組織内の別のセル型の形態を研究する簡単で効率的な方法について説明します。MCFO を用いた異なるエピトープ タグで複数の記者は多色確率ラベル (図 2) の組み合わせで使用されます。Brainbow/Flybow15,16,17などの他のメソッドと同様に、MCFO よりラベル多様化マ?...

グリア細胞、神経系 (NS) の非神経細胞集団はニューロンの静的なフレームワークを提供するために長い間信じられていた、したがって詳細に至りませんでした。ただし、ヒトでは、グリアは NS (~ 90%) のセルの大部分を構成する、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ミクログリア、シュワン細胞を含むいくつかの異なるカテゴリに分類されます。ショウジョウバエグリアは、NS で細胞の約 10% を構成します。興味を持って、その形態と機能が脊椎動物1,2で見つけられるそれらに非常に類似します。その形態には、血液脳関門 (BBB) アストロ サイト様細胞、神経鞘、上皮形成が含まれます。
ショウジョウバエ中枢神経系 (CNS) は次の主構造体で構成されています:; 神経細胞の細胞体を含む皮質領域ハーバーのシナプス接続 neuropils接続別 neuropiles; 小規模および大規模な軸索路(図 1) 中枢神経系と感覚器官や筋肉を接続する末梢神経。すべてのこれらの解剖学的構造に関連付けられているグリア細胞が見つかった: 皮質領域、アストロ サイトのようなグリア細胞 (ALG), 脊髄グリア細胞 (EG) 構造の領域、脊髄グリア細胞の皮質グリア (CG) は中央軸索路と周辺機器に関連付けられているも神経 (EGN)、そして最後に、グリア細胞シートのような 2 つ、perineurial グリア (PG) と subperineurial (SPG)、これは一緒に全体の NS (図 2) をカバーする連続した層を形成します。
前の研究は、そのグリアを示されている; NS の開発に重要な役割を果たすインスリン様ペプチドを全身循環に反応して神経細胞の数を監視、ニューロン、グリア-ニューロン乳酸シャトルなどに栄養サポートを提供して貪食3,4で死にかけている神経細胞を排除,5,6成熟した NS でグリア BBB を維持、神経伝達物質を取るとイオンの恒常性を維持、マクロファージできません、BBB に違反し、動物の行動の6と同様、シナプスの活性を調節するので、NS で主要な免疫細胞として機能。,7,8,9,10,11。
グリア細胞のサブタイプが異なるが特殊な機能を実行するかどうか重要な未解決の問題に残る。ただし、成体における特にグリア細胞の体系的なゲノム解析は、その操作に対応する遺伝的ツールの欠如によって妨げられています。ここでは、複雑な細胞間相互作用を研究するセル形状の効率的かつ簡単な評価を可能にする手法を提案します。この手法は、大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を特徴付けるに適用されていますが、ニューロン12,13 を研究に使用される特定の GAL4 ドライバー、に応じて合わせることができます。、混ざり細胞と原則としていかなる任意の発達段階内の任意組織。

<table><tbody><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>Glass dissection dish</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Glass dissection plates</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>home made with charcoal</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 cell culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Primary antibody, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Secondary antibody, dilution 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Secondary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contact company for ordering</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for automated scanning</td></tr></tbody></table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

セルには、異なる形態と複雑な解剖学的関係が表示されます。細胞彼らの隣人との対話の方法相互作用は細胞のタイプ間または特定の種類の内であっても異なる?彼らは空間のルールの種類が従うか。このような基本的な質問体内への回答は、これまでのところ高解像度 1 つのセルのラベルのためのツールの欠如によって妨げられています。ここでは、多色 FlpOut (MCFO) を用いた単一細胞をターゲットに詳細なプロトコルを提供しています。このメソッドは、3 つ異なるタグ記者 (HA、旗、V5) UA 制御の下で 2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターで静かに保管されているに依存します。熱衝撃パルスは、個々 の細胞における FRT 停止 FRT カセットをランダムに削除する熱衝撃波の Flp リコンビナーゼの発現を誘導する: 式は、GAL4 ドライバーを表すセルでのみ発生します。これは、高解像度で個々 の細胞の形態の可視化を可能にする特定の細胞型の別様に着色されたセルの配列に します。例として、MCFO 技術は大人のショウジョウバエ脳グリア細胞サブタイプが異なる形態を視覚化するための特定のグリア GAL4 ドライバーと組み合わせることができます。

このセクションでは、大人のショウジョウバエ脳における MCFO 技術を使用して得られる結果の例を示しています。メソッドの概略図を図 3に示します。3 異なる膜タグ記者 (myr smGFP HA、myr smGFP フラグ myr smGFP V5) UA コントロールの下で、2 つの FRT サイト (FRT-停止-FRT) に挟まれた転写ターミネーターが黙っていた。熱衝撃パルスは...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K ビュー.  Ludwig-Maximilians-University Munich. 細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA 式システムを使用して、細胞間相互作用を調査する方法について説明します。

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

神経科学

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

発生生物学

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

生物学

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

要約

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シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

の中枢神経系における単一細胞のラベリング

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

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シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

の中枢神経系における単一細胞のラベリング

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用