この方法は、他の蛍光タンパク質からのシグナルを観察するために容易に適応することができ、または他の成人の軸索を画像化するために使用することができこの技術の主な利点は、軸索およびそれらの末端アーバーの優れた3次元の再構築および視覚化を容易にする。ガラスマルチウェルプレートに適切な数のウェルを70%エタノールで充填することで始めます。ブラシを使用して、任意の年齢または性別の15〜20個の二酸化炭素麻酔付きハエを各井戸に加え、ハエが完全に水没するまでエタノールにそっと手を出します。
1分以上後、1回の洗浄につき少なくとも10分間、リン酸緩衝生理食塩水中に0.3%非イオン性界面活性剤溶液でハエを3回洗い流します。最後の洗浄後、胸部または脚を損傷することなく、各フライの頭と腹部を取り除くために鉗子を使用し、細かい鉗子のペアの先端を使用して、コクサ胸部接合部に穏やかにしっかりと圧力をかけ、胸部セグメントから片方の脚を取り外します。準備した新しいマルチウェルプレートの1つの井戸に足を置き、氷の上に4%パラホルムアルデヒドを入れ、摂氏4度で一晩インキュベーションします。
脚を浮かべずに固定バッファに優しく押し込んで、足を固定して得ることが重要です。翌日、1回20分間、新鮮な0.3%非イオン界面活性剤洗浄剤溶液で5回脚を洗浄します。最後の洗浄後、洗剤を取り付け媒体に交換し、脚を取り付け媒体に少なくとも24時間置き換えます。
翌日、ガラス顕微鏡スライドのコーティングされた端に約20マイクロリットルの70%グリセロールを加え、グリセロールを22 x 22ミリのカバースリップで覆います。次に、カバースリップの右側に取り付け媒体の約10マイクロリットルラインを加え、10マイクロリットルラインの右側に2番目の30マイクロリットルの取り付け媒体を適用します。細かい鉗子を使用して、片方の脚を媒体の滴でマルチウェルプレートから、外付け側の上方向または下向きの10マイクロリットルの取り付け媒体に移します。
6~8本の脚が取り付けられ、整列するまで繰り返し、2番目のカバースリップが最初のカバースリップの上にわずかに置くように脚の上に2番目のカバースリップを置きます。その後、カバーリップの各コーナーでマニキュアを使用して、それらを所定の位置に固定します。脚を画像化するには、488ナノメートルのレーザーと2つの検出器を同時に使用して、GFPとキューティクルの両方の蛍光を得るための最初のトラックを設定します。
20 ~25倍の油浸しの目的を選択し、解像度を 12 ビット深度の 1024 x 1024 ピクセルに設定し、Z 間隔を 1 マイクロメートルに設定します。スライドを顕微鏡ステージにロードし、両方の検出器に同じレーザーパワーを使用して、最初の検出器のゲインを調整して明るいGFP信号を得て、2番目の検出器を調整して、キューティクル信号の高い領域の一部がこの検出器で飽和信号を生成するようにします。次に、タイルまたは位置のオプションを使用して脚をイメージ化し、脚が伸びるか大きすぎて 1 つのフレームでイメージ化できない場合に脚全体をキャプチャします。
画像処理の場合は、ImageJ Fiji で共焦点スタックを開き、Bio-Formats プラグインを使用して、TIFF 形式でない画像を開きます。チャンネルを分割するには、[画像]、[カラー]、[スプリット チャンネル] の順に選択します。GFP 信号からキューティクル信号を引くには、プロセスと画像計算機を開き、画像 1 として探知器からスタックを選択します。
操作ウィンドウで、減算を選択し、内因性のGFP信号のみが得られるように、検出器2からトラックを画像2として選択します。画像、スタック、Z保護を使用して、内因性GFP信号の最大強度投影を生成します。明るさとコントラストを調整するには、明るさコントロール ウィンドウのコントロールを使用します。
次に、キューティクルの平均強度を生成し、続いて画像、カラー、およびマージチャンネルを生成して、GFPスタックを検出器2から取得したキューティクルのみのスタックにマージします。これは、組織特異的なGFP信号と、脚のセグメント内の軸索の樹状を識別するのに役立つキューティクル信号で構成されるRGB画像になります。マクロを使用するには、コンフォーカル スタックを開き、[イメージ]、[調整]、[明るさ/コントラスト] をクリックします。
次に、[プラグインとマクロの実行] をクリックしてマクロを実行し、指示に従います。画像計算ウィンドウで操作を指定するように求められたら、イメージ 1 をスタック 1 として選択します。操作ウィンドウで、減算を選択します。
スタック 2 としてイメージ 2 を選択します。コントラストを調整するように求められたら、明るさコントロールウィンドウのコントロールを使用して、GFP の最大投影画像の明るさのコントラストを調整し、キューティクルの平均投影を調整して、GFP を緑色で示す RGB 合成画像とグレーのキューティクルを示す両方の信号の RGB マージ画像を生成します。次に、スタック 1 とスタック 2 の結果をマージして、次のステージで使用できる GFP とキューティクル スタックを組み合わせて生成します。
脚を 3 次元で視覚化するには、適切な 3D ソフトウェア プログラムで RGB スタックを開きます。ポップアップダイアログウィンドウで、モード変換セクションですべてのチャンネルを選択し、前の分析から取得したボクセルのサイズを入力します。チャンネル 1 モジュールで右クリックし、[表示とボレン]を選択します。
その後、Volrenモジュールを左クリックします。[プロパティ]セクションで、[詳細設定]を左クリックし、[DDR]を選択します。次にガンマ値を調整して、キューティクルの背景を確認します。
チャンネル 2 モジュールで右クリックし、[表示][Volren を表示]を選択します。次に、ボレンモジュールを左クリックして編集し、ボレングリーン.colを選択します。この手順を使用すると、キューティクルからの信号をGFP信号と組み合わせて、脚内の軸索の位置を特定することができます。
脚を固定することは非常に重要です。適切に固定された脚では、脚の内部構造は均一な色で、暗い気管が見えます。不十分な固定脚では、暗い材料がタルサスおよび脛骨に存在し、気管系は大腿骨およびコクサではっきりと見えない。
ここで説明した手順は、高分解能の高い太くてオート蛍光性のキューティクルを通して運動ニューロン軸索の蛍光発現を検出するという課題を克服するものである。そこで、得られたクリーンで詳細な蛍光信号により、3Dイメージングプログラムを用いて軸索の立体的特徴を可視化し、定量化することができます。そこでこの技術により、成人ショウジョウバエをモデルとして使用して、運動ニューロンの発達を研究するだけでなく、ERASなどの変性疾患が統合された運動システムに及ぼす影響を理解することができます。
