저자는 아 르 님 Jenett, Aljoscha Nern, 및 조언을 루빈 연구소의 다른 회원 들과 공유 되지 않은 시 약 및 confocal 이미지를 생성 하기 위한 Janelia 비행 빛 프로젝트 팀 감사 합니다. 저자 또한 원고에 의견에 대 한 갈리아 연구소의 회원을 감사합니다.

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리 참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되었습니다. 결과 비 형광 단백질의 이름은 &#34; 스파게티 괴물 GFPs &#34; (smGFPs) 14 다른 epitope 태그에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 감지할 수 있습니다.
<ol><li>크로스 파리 MCFO 카세트와 hsp-Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)는 적절 한 폐해 GAL4 드라이버 라인에 (재료의 표 참조) .
	<ol><li>는 hsp 이미 25 ° C에 활성화 하 고 몇 셀 재결합 한 불특정 라벨을 선도 받을 수 시스템의 시키는 피하기 위하여 18 ° C에서 십자가를 설정 합니다. F1 세대를 18 ° C에서 약 20 일을 기다립니다. 열 후 (2 단계 참조) 충격, 25 ° C ( 그림 3)에서 날아 유지.</li>
	</ol></li></ol> 2. 열 충격 참고: 삽입 사이트 따라 hsp Flp의 효율은 달라질 수 있습니다; 그리고 따라서, 최적의 열 충격 시간 최적화가. 이 프로토콜에 대 한 hsp Flp X 염색체에 삽입 된 MCFO 비행 재고 사용 되었습니다 (재료의 표 참조).
<ol><li>전송 자손 단계 1.1에서에서 십자가의 (F1 세대 파리, 3-4 일) 음식과 열을 포함 하는 새로운 유리병에 물 욕조에 37 ° C에서 그들을 충격. 
	참고: 젊은 파리 (1-2 일)는 열 충격에 매우 민감합니다. 치료로 인 한 사망률을 줄이기 위해 열 충격을 수행 하기 전에 더 많은 일 1 또는 2를 기다립니다. 사용 F1 세대의 일부 컨트롤, 열 충격 없이 파리.</li>
	<li>열 충격 동안 스트레스 유발 사망률의 속도 감소 음식으로 일반 튜브에서 파리를 유지. 여성 및 남성 별도 튜브에 넣어.</li>
	<li>전체 유리병 균질 열 충격을 보장 하기 위해 물에 젖어 있는지 확인 합니다. 5-8 분 충격 적당 한 시작 지점으로 사용 하 여 스파스 많은 GAL4 드라이버 라인; 명과 셀의 라벨에 대 한 각 드라이버 및 실험 (짧은 또는 긴 열 충격 시간이 필요할 수 있습니다)에 대 한 충격 기간을 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>열 충격 후 열 충격에서 회복 하기 위해 파리를 수 있도록 하기 위해 몇 분 동안 벤치에 가로로 튜브 하다. 
	참고: 그것은 튜브를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	<li>25 ° C에서 파리를 유지 하 고 해 부 (3, 4 단계 참조) 그들 2 일 이상 열 충격 후 최적의 기자 식.</li>
</ol> 3. 해 부 준비 및 솔루션 <ol><li>해 부, 주 20 %paraformaldehyde (PFA)를 2 %PFA 솔루션의 20 µ L와 S2 세포 배양 매체의 180 µ L를 혼합 하 여 200 µ L PCR 튜브에 신선한 통 솔루션을 준비. 전과 해 부 동안에 얼음 통 솔루션 유지. 
	주의: PFA 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다. 
	참고: 혼합 S2 세포 배양 매체의 160 µ L 2% 솔루션 대신 4 %PFA 솔루션을 준비 하는 200 µ L PCR 튜브에 20 %paraformaldehyde (PFA)의 40 µ L.</li>
	<li>튜브 당 8-10 두뇌의 최대 유전자 당 1 개의 PCR 관을 사용 하 여 최적의 얼룩 결과.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션의 준비: 0.5% 소 혈 청 알 부 민, 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100. 
	참고: 얼룩, 1%를 포함 하는 솔루션에 따라 트라이 톤 X-100 필요할 수 있습니다. Triton X-100의 높은 농도 조직에 항 체의 침투를 증가 하 고 그것은 깊은 조직 (예: 성인 초파리 뇌의 시 냅 스 지역) 안에 얼룩 지역 필요.</li>
	<li>차단 솔루션 준비: 3% 정상 염소 혈 청, 3% 정상 당나귀 혈 청, 그리고 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션 및 차단 솔루션의 몇 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음에 깊은 우울증 웰 스 유리 접시를 넣고 각 채우기 다음 솔루션과 잘:와 70% 에탄올, 하나 PBS, S2 세포 배양 매체와 하나 하나.</li>
</ol> 4. 성인 뇌 해 부 <ol><li>3cm는 stereomicroscope의 무대에서 요리를 해 부하 고 차가운 S2 세포 배양 매체와 그것을 채우기. 조직 해 부 절차 동안 건강 한 유지에이 매체의 모든 해 실시. 
	참고: (이미지)에서 좋은 배경 대조를 제공 하는 블랙 실리콘의 몇 밀리미터 늘어서 해 접시를 사용 하 고 해 부 동안에 집게를 보존.</li>
	<li>CO 2 원하는 유전자의 파리 anesthetize.</li>
	<li>집게, 날개에 의해 파리를 잡아와 30에 대 한 차가운 70% 에탄올에 그것을 씻어 다음 추가 30에 대 한 차가운 PBS 가진 s s.</li>
	<li>깊은 우울증 잘 S2 세포 배양으로 가득으로 즉시 전송.</li>
	<li>동일한 유전자 형의 모든 파리에 대 한 동일한 절차를 반복 하 고 해 부, 조직 유지 됩니다 때까지 차가운 S2 세포 배양 매체에서 그들을 유지. 
	참고: Anesthetize 수 수 해 부 약 30 분의 기간에 S2 세포 배양 매체에서 긴 보육 시간 파리의 수는 조직 손상 될 수 있습니다만.</li>
	<li>집게와 함께 파리를 잡아와, stereomicroscope에서 잠수함 S2 세포 배양 매체에서 비행.</li>
	<li>머리는 시체의 나머지 부분에서 분리합니다. 본문을 삭제 하 고 S2 세포 배양 매체에 빠져들 머리를 유지. 그것은 매우 중요 한 해 부의 전체 기간에 대 한 집게로 머리를 잡아입니다. 머리를 시작 하는 경우는 조직 손상 없이 검색 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>항상 적어도 하나의 집게로 머리를 잡고 한쪽 눈을 꺼내 여 해 부를 시작 합니다. 그는 집게의 끝은 바로 피하려고 망막 아래는 조직 손상 아래 다는 것을 확인 하십시오. 다른 눈에 밖으로 끌어와 두뇌가 나타날 때까지 표 피를 제거 시작.</li>
	<li>제거 모든 tracheal 조직과 뇌 주변의 표 피 조직 깨끗 한 때까지 합니다. 최적의 얼룩 결과; 뇌 주변의 모든 tracheal 조직을 제거 확인 조직 고정 하 고 얼룩이 될 준비가 됩니다.</li>
	<li>차가운 S2에 모든 해 부 머리 고정 단계 시간 위하여 PFA 솔루션으로 그들을 전송 하기 전에 배양 세포 유지.</li>
</ol> 5. 성인 두뇌 얼룩 < ol> <li>전송 P10 피 펫과 격리 된 뇌 실 온 (RT)에서 PFA 솔루션으로. 조직 손상을 방지 하려면 해 부 후 두뇌를 전송 집게를 사용 하지 마십시오. 200 µ L PCR 튜브는 nutator에 있는 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>튜브의 하단에 정착을 두뇌 허용 P200 피 펫과 오래 된 솔루션을 삭제 하기 전에 모든 단계. 발음은 조직 없이 상쾌한을 제거 하려고 합니다. 가벼운 노출에서 조직 보호.</li>
	<li>수정 2%의 200 µ L에서 두뇌 PFA S2 세포 배양 매체 1 h 또는 4% PFA 30 분. 재현성을 증가 하기 위하여 샘플 사이 동일한 고정 시간을 유지.</li>
	<li>세척 솔루션, 성인 뇌의 200 µ L에 각각 15 분의 3 (또는 이상) 세척 후 30 분에 대 한 솔루션을 차단의 200 µ L로 조직 차단. 솔루션을 차단에 더 이상 부 화 시간이 가능 하다.</li>
	<li>두뇌 두뇌 세척 솔루션 200 µ L의 총 볼륨 희석 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 품. 
	참고: 보육 시간 사용 하는 항 체의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 더 이상 외피 필요할 수 있습니다.
	<ol><li>3 MCFO 마커의 라벨에 대 한 안티와 두뇌를 품 어-하 (1: 500), 반대로 플래그 (DYKDDDDK epitope) (1: 100), 및 안티-v 5 기본 항 체.</li>
		<li>기본 직접 활용 된 항 체는 정상적인 1 차 + 2 차 조합 대신 사용할 수 (예., 안티-V5:DyLight 549 (1: 200)). 이 경우에, 2 차 항 체로 직접 활용 된 항 체 치료. 
		참고: 각 유전자 형에 대 한 컨트롤을 확인 하는 얼룩의 특이성으로 일부 머리를 유지. 1 차적인 항 체 외피를 생략 하 고 다음 단계로 직접 이동.</li>
	</ol></li> <li>성인 뇌 세척 솔루션 (단계 3.3)의 200 µ L에 3 번 1 시간을 위한 조직을 세척 하 고 보조 fluorophore-어원이 같은 말/기본 직접 활용 된 항 체 두뇌 4 솔루션을 하룻밤 세척 희석으로 그들을 품 어 ° C 또는 200 µ L의 전체 볼륨에 RT에서 4 h 참고: 적절 한 항 체의 예: AlexaFluor 488 (1: 250), 안티-V5:DyLight 549 (1: 200) 및 DyLight 647 (1: 100)-항 체를 활용 시켰다.</li>
	<li>성인 뇌 세척 솔루션, 4 ° C에서 하룻밤 또는 RT에 1-2 h는 PBS의 200 µ L에서 최종 세척 뒤의 200 µ L에 1 시간에 3 번 두뇌 세척, PBS 최종 세척 단계 Triton X-100의 모든 흔적을 제거 하 고 필요 최적의 얼룩 결과입니다. 유리 coverslips에 방지 페이드 에이전트 설치 매체에 두뇌를 탑재.</li>
</ol> 6. 이미징에 대 한 두뇌의 장착가 위를 사용 하 여 적절 한 크기를 <ol>이미징은 트림 <li>스페이서. 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 두 개의 유리 coverslips 사이 견본 및 이미징 스페이서 샌드위치. 
	참고: 이미징 스페이서는 얇은 (0.12 m m 두께) 접착제 스페이서 껍질 및 유리 coverslips 또는 현미경 슬라이드에 충실 하는 압축 하지 않고 표본의 장착 수.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 1 개의 표면에서 접착제 라이너를 제거 하 고 스페이서, 접착 면이 아래로, 유리 coverslip (22 m m x 60 m m)의 표면에 적용. 새로운 유리 coverslip 장착 매체의 10 µ L 적용.</li>
	<li>P10와 피 펫, 200 µ L 튜브에서 설치 매체의 드롭 옆 coverslip 두뇌를 전송. 조직, 함께 솔루션에 두뇌를 유지 하기 위해 일부 PBS 전송.</li>
	<li>P10와 피 펫, PBS에서 PBS의 양을 제한 하는 설치 매체의 드롭 두뇌를 이동 합니다. 설치 매체에 있는 표본 이미징 스페이서와 coverslip에 전송 합니다. 충분 한 설치 미디어를 사용 하 여 표본을 커버.</li>
	<li>는 스페이서의 상단에서 다른 접착제 라이너를 제거 하 고는 표본 위에 유리 coverslip 추가. 집게의 끝에와 함께 부드러운 압력 밀봉 접착제 영역에 적용 됩니다. 이미지 탑재 된 조직을 즉시 또는 나중에 분석-20 ° C에서 슬라이드 저장.</li>
</ol> 7. 이미지 수집 <ol><li>confocal 형광 이미지 40 X confocal 현미경을 사용 하 여 취득 스택 (나 = 1.2, 물 침수) 목표 또는 63 X (NA = 1.4, 기름 침수) 목표 (픽셀 크기 xy 평면;에서 1024 x 1024 = 두 개의 confocal 섹션 사이의 거리 = 0.5 µ m). 감지기 이득 및 오프셋 아무 포화 픽셀 및 0 픽셀 값은 이미지;에 존재 하는 방식으로 각 채널에서을 조정합니다 이 정보 손실 방지 및 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하 여 보장. 
	참고: 지금까지 3D 영상 시간이 소요 때문에에 측정 다른 위치에서 동시에 여러 개의 샘플을 검색 하 여 자동화할 수 있습니다. 물 침수 목적으로 증발을 피하기 위해, 사용 하 여 특별 한 기름 침수 매체 굴절률 n = 1.33.</li>
	<li>Confocal 스택 최대 밀도 프로젝션, 채널 색조 및 밝기 조정에 변화를 처리 하 고 모든 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 대조 (재료의 표 참조).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. 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M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system.">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li></ol>

작가의 아무도 경쟁 또는 충돌 관심 있다.

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 ...

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.
다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.
이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 , 5 , 6. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동6 조절 역할 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경12,13 공부에 적응 수 있습니다. , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-30</td>
			<td>Glass dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7223-34</td>
			<td>Glass dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Black</td>
			<td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td>
			<td>805998</td>
			<td>home made with charcoal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExpressFive S2 cell culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10486-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit HA-tag</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat FLAG-tag</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-06712</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td>
			<td>AdSerotec</td>
			<td>0411</td>
			<td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat DyLight 647</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFate Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Seal Spacer</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Contact company for ordering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>101152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>518 F</td>
			<td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>W 2010</td>
			<td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R56F03-GAL4 (EG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>39157</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R86E01-GAL4 (ALG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>45914</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>64085</td>
			<td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Time Macro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀?...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K 조회수.  Ludwig-Maximilians-University Munich. 셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

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Assessment and Evaluation of the High Risk Neonate: The NICU Network Neurobehavioral Scale

There has been a long-standing interest in the assessment of the neurobehavioral integrity of the newborn infant. The NICU Network Neurobehavioral Scale (NNNS) was developed as an assessment for the at-risk infant. These are infants who are at increased risk for poor developmental outcome because of insults during prenatal development, such as substance exposure or prematurity or factors such as poverty, poor nutrition or lack of prenatal care that can have adverse effects on the intrauterine environment and affect the developing fetus. The NNNS assesses the full range of infant neurobehavioral performance including neurological integrity, behavioral functioning, and signs of stress/abstinence. The NNNS is a noninvasive neonatal assessment tool with demonstrated validity as a predictor, not only of medical outcomes such as cerebral palsy diagnosis, neurological abnormalities, and diseases with risks to the brain, but also of developmental outcomes such as mental and motor functioning, behavior problems, school readiness, and IQ. The NNNS can identify infants at high risk for abnormal developmental outcome and is an important clinical tool that enables medical researchers and health practitioners to identify these infants and develop intervention programs to optimize the development of these infants as early as possible. The video shows the NNNS procedures, shows examples of normal and abnormal performance and the various clinical populations in which the exam can be used.

The NICU Network Neurobehavioral Scale (NNNS) was developed as an assessment for the at-risk infant. The purpose of this article is to describe the NNNS, provide video examples of the NNNS procedures and discuss the ways in which the exam has been used.

평가 및 고위험 신생아의 평가 : 신생아 중환자 실 네트워크 신경 행동 학적 규모

There has been a long-standing interest in the assessment of the neurobehavioral integrity of the newborn infant.  The NICU Network Neurobehavioral Scale ...

연구

행동분석학

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

헤로인은 절제 쥐의 추구에 장시간 음식 제한의 효과를 연구하기위한 절차

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Study Motor Skill Learning by Single-pellet Reaching Tasks in Mice

Reaching for and retrieving objects require precise and coordinated motor movements in the forelimb. When mice are repeatedly trained to grasp and retrieve food rewards positioned at a specific location, their motor performance (defined as accuracy and speed) improves progressively over time, and plateaus after persistent training. Once such reaching skill is mastered, its further maintenance does not require constant practice. Here we introduce a single-pellet reaching task to study the acquisition and maintenance of skilled forelimb movements in mice. In this video, we first describe the behaviors of mice that are commonly encountered in this learning and memory paradigm, and then discuss how to categorize these behaviors and quantify the observed results. Combined with mouse genetics, this paradigm can be utilized as a behavioral platform to explore the anatomical underpinnings, physiological properties, and molecular mechanisms of learning and memory.

Persistent practice improves the precision of coordinated movements.&#160;Here we introduce a single-pellet reaching task, which is designed to assess the learning and memory of forelimb skill in mice.&#160;

마우스의 단일 펠릿 도달 작업을 통한 학습 연구 모터 기술

Reaching for and retrieving objects require precise and coordinated motor movements in the forelimb. When mice are repeatedly trained to grasp and ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here with the goal of uncovering rhythm disorders, such as beat deafness. Beat deafness is characterized by poor performance in perceiving durations in auditory rhythmic patterns or poor synchronization of movement with auditory rhythms (e.g., with musical beats). These tasks include the synchronization of finger tapping to the beat of simple and complex auditory stimuli and the detection of rhythmic irregularities (anisochrony detection task) embedded in the same stimuli. These tests, which are easy to administer, include an assessment of both perceptual and sensorimotor timing abilities under different conditions (e.g., beat rates and types of auditory material) and are based on the same auditory stimuli, ranging from a simple metronome to a complex musical excerpt. The analysis of synchronized tapping data is performed with circular statistics, which provide reliable measures of synchronization accuracy (e.g., the difference between the timing of the taps and the timing of the pacing stimuli) and consistency. Circular statistics on tapping data are particularly well-suited for detecting individual differences in the general population. Synchronized tapping and anisochrony detection are sensitive measures for identifying profiles of rhythm disorders and have been used with success to uncover cases of poor synchronization with spared perceptual timing. This systematic assessment of perceptual and sensorimotor timing can be extended to populations of patients with brain damage, neurodegenerative diseases (e.g., Parkinson&#8217;s disease), and developmental disorders (e.g., Attention Deficit Hyperactivity Disorder).

Behavioral tasks that allow for the assessment of perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) are presented. Synchronization of finger tapping to the beat of an auditory stimuli and detecting rhythmic irregularities provides a means of uncovering rhythm disorders.

비트의 청각 장애를 폭로 : 감지 리듬 장애를 누르면 동기화 손가락 및 지각 타이밍 작업에

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Novel Approach to Assess Motor Outcome of Deep Brain Stimulation Effects in the Hemiparkinsonian Rat: Staircase and Cylinder Test

Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus is an effective treatment option for Parkinson&#39;s disease. In our lab we established a protocol to screen different neurostimulation patterns in hemiparkinsonian (unilateral lesioned) rats. It consists of creating a unilateral Parkinson&#39;s lesion by injecting 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right medial forebrain bundle, implanting chronic stimulation electrodes into the subthalamic nucleus and evaluating motor outcomes at the end of 24 hr periods of cable-bound external neurostimulation. The stimulation was conducted with constant current stimulation. The amplitude was set 20% below the individual threshold for side effects. The motor outcome evaluation was done by the assessment of spontaneous paw use in the cylinder test according to Shallert and by the assessment of skilled reaching in the staircase test according to Montoya. This protocol describes in detail the training in the staircase box, the cylinder test, as well as the use of both in hemiparkinsonian rats. The use of both tests is necessary, because the staircase test seems to be more sensitive for fine motor skill impairment and exhibits greater sensitivity to change during neurostimulation. The combination of the unilateral Parkinson model and the two behavioral tests allows the assessment of different stimulation parameters in a standardized way.

Deep brain stimulation (DBS) is an effective treatment option for Parkinson's disease. We established a study design to screen novel stimulation paradigms in rats. The protocol describes the use of the staircase test and cylinder test for motor outcome assessment in DBS treated hemiparkinsonian rats.

계단 및 실린더 테스트 : 소설 접근은 Hemiparkinsonian 쥐에 깊은 뇌 자극 효과의 모터 결과를 평가하는

Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus is an effective treatment option for Parkinson&#39;s disease. In our lab we established a protocol to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For example, in the cat, visual information about an impending obstacle can modulate stepping for avoidance. Locomotor adaptation can also occur independent of vision, as sudden tactile inputs to the leg by an expected obstacle can modify the stepping of all four legs for avoidance. Such complex locomotor coordination involves supraspinal structures, such as the parietal cortex. This protocol describes the use of reversible, cooling-induced cortical deactivation to assess parietal cortex contributions to memory-guided obstacle locomotion in the cat. Small cooling loops, known as cryoloops, are specially shaped to deactivate discrete regions of interest to assess their contributions to an overt behavior. Such methods have been used to elucidate the role of parietal area 5 in memory-guided obstacle avoidance in the cat.

Complex locomotion in naturalistic environments requiring careful coordination of the limbs involves regions of the parietal cortex. The following protocol describes the use of reversible cooling-induced deactivation to demonstrate the role of parietal area 5 in memory-guided obstacle avoidance in the walking cat.

가역 냉각 유도 Deactivations 공부 장애물 메모리 걷는 고양이에 대뇌 피 질의 기여를

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific responses to changing temperatures according to their physiological tolerance and adaptability. Drosophila flies also possess a temperature sensing system that has become fundamental to understanding the neural basis of temperature processing in ectotherms. We present here a temperature-controlled arena that permits fast and precise temperature changes with temporal and spatial control to explore the response of individual flies to changing temperatures. Individual flies are placed in the arena and exposed to pre-programmed temperature challenges, such as uniform gradual increases in temperature to determine reaction norms or spatially distributed temperatures at the same time to determine preferences. Individuals are automatically tracked, allowing the quantification of speed or location preference. This method can be used to rapidly quantify the response over a large range of temperatures to determine temperature performance curves in Drosophila or other insects of similar size. In addition, it can be used for genetic studies to quantify temperature preferences and reactions of mutants or wild-type flies. This method can help uncover the basis of thermal speciation and adaptation, as well as the neural mechanisms behind temperature processing.

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Here we present a protocol to automatically determine the locomotor performance of Drosophila at changing temperatures using a programmable temperature-controlled arena that produces fast and accurate temperature changes in time and space.

시간과 공간에서 온도 변화에 대 한 응답에서 초파리 의 성능을 결정 하는 자동화 된 방법

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Assessing the Coherence of Parents' Short Narratives Regarding their Child Using the Five-Minute Speech Sample Procedure

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with parents. This paper focuses on such a method, namely Five-Minute Speech Sample-Coherence (FMSS-Coherence). In this method, a parent is asked to speak for five uninterrupted minutes about her/his child and their relationship. The resulted narrative is coded for coherence, namely the extent to which the parent provides&#160;in the narrative&#160;a clear, consistent, multidimensional and well-supported portrayal of the child. FMSS-Coherence is based on attachment research that shows that the coherence of parents&#8217; narratives is indicative of the quality of the parent-child relationship and child adjustment. It overcomes the limitations of attachment narrative measures which are typically labor intensive. FMSS-Coherence is less nuanced than extant attachment narrative measures. Yet, studies of families from different cultural backgrounds, across different child ages and in the context of typically developing children as well as children with special needs suggest that coherence can be reliably evaluated using the FMSS procedure. Furthermore, parents&#8217; FMSS-Coherence is associated with parenting quality and children&#8217;s socio-emotional adjustment. Thus, it holds promise for researchers and practitioners who seek a relatively time- and cost-effective method for assessing the coherence of parents&#8217; narratives regarding their child.

This paper introduces a method for assessing the coherence of parents' short narratives regarding their child and their relationship using the five-minute speech sample procedure.

5분 음성 샘플 절차를 사용하여 자녀에 관한 부모의 짧은 이야기의 일관성 평가

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with ...

Radiotracer Administration for High Temporal Resolution Positron Emission Tomography of the Human Brain: Application to FDG-fPET

Functional positron emission tomography (fPET) provides a method to track molecular targets in the human brain. With a radioactively-labelled glucose analogue, 18F-fluordeoxyglucose (FDG-fPET), it is now possible to measure the dynamics of glucose metabolism with temporal resolutions approaching those of functional magnetic resonance imaging (fMRI). This direct measure of glucose uptake has enormous potential for understanding normal and abnormal brain function and probing the effects of metabolic and neurodegenerative diseases. Further, new advances in hybrid MR-PET hardware make it possible to capture fluctuations in glucose and blood oxygenation simultaneously using fMRI and FDG-fPET.
The temporal resolution and signal-to-noise of the FDG-fPET images is critically dependent upon the administration of the radiotracer. This work presents two alternative continuous infusion protocols and compares them to a traditional bolus approach. It presents a method for acquiring blood samples, time-locking PET, MRI, experimental stimulus, and administering the non-traditional tracer delivery. Using a visual stimulus, the protocol results show cortical maps of the glucose-response to external stimuli on an individual level with a temporal resolution of 16 s.

This manuscript describes two radiotracer administration protocols for FDG-PET (constant infusion and bolus plus infusion) and compares them to bolus administration. Temporal resolutions of 16 s are achievable using these protocols.

인간의 뇌의 고시간 해상도 양전자 방출 단층 촬영을위한 방사선 추적기 관리 : FDG-fPET에 응용 프로그램

Functional positron emission tomography (fPET) provides a method to track molecular targets in the human brain. With a radioactively-labelled glucose ...