我々 は心から彼の貴重な提案や議論の茂雄北をありがちましょう。我々 はまた原稿の彼らの重要な読書のジョンとすみれエクスタインをありがちましょう。

注: この研究で使用される標本は、プロパンと液体窒素で急速凍結された微生物を凍結置換アセトン 2% オスミウム四酸化二を含むとエポキシ樹脂1,2,3、埋め込み 4,5,6,7,8,9,10、11,12,13 ,14,15,16,17,18。
1. 支持膜 (図 1-3) の準備
注:19ガラスの上の鋳造法を使用しての銀色のホルムバール支持フィルムを用意しています。
<ol><li>1.5 %100 mL を加えるホルムバール作る装置 (図 1) に二塩化エチレンでホルムバール。ゴム製ボール19を使用して ' を通る空気とソリューションを押すことによって装置の上部の列でホルムバール ソリューション (76 × 26 × 1.3 mm) スライド ガラスの半分を浸しなさい。<ol>
<li>三方活栓を開いて、圧力を減らすために 'b' を通る空気を解放によって列からソリューションをドレインします。スライド ガラスの表面に膜を形成する装置から空気で乾燥してスライド ガラスを取り出してください。ホルムバール フィルムの乾燥を加速するのに白熱ランプを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(図 2 a)、かみそりの刃でスライド ガラス上のフィルムの 4 つのエッジを削り、スライド20日から映画の分離を容易にするスライドに呼吸にスライド ガラスを浸すことによって水のフィルムをフロートした後、水をゆっくりと低い水平角度 (約 10 °、図 2 b)。</li>
	<li>穴 (直径 4 mm) アルミ ラック (30 mm × 25 × 3 mm) を使用して水からホルムバール映画スクープ (図 3 a)。乾燥器で使用 (図 3 b) までホルムバール フィルムでラックを保ちます。</li>
</ol>2. 超音波トリム ブレードと実体顕微鏡 (図 4) の下でかみそりの刃21試料ブロックのトリミング
<ol><li>ブロックの先端 (図 4 a) 光学顕微鏡で観察することによって、ブロックの表面に細胞があることを確認します。</li>
	<li>チャック (ブロック ホルダー) で試料ブロックをマウントし、トリミング ステージ21 (図 4 b) のチャックをマウントします。このトリミング ステージには、供試体の背面から照明メカニズムがあります。</li>
	<li>0.7 mm × 1.0 mm (図 4 c、5 d) のサイズにブロックをトリムします。エポキシ樹脂は非常に難しいため、まず超音波トリム ブレードを使用してブロックをトリミングします。超音波トリム ブレードは新たに導入されたマシン、ブロックは簡単に切り捨てられます。それからさらにかみそりの刃が付いているブロックをトリムします。(図 5 d、図 8を参照) を切削方向をマークする 1 つの肩をカットします。</li>
</ol>3. ミクロトーム (図 5) を使用してダイヤモンド ナイフで試料ブロックのトリミング
<ol><li>ウルトラミクロトームの試料ホルダーのチャックの試料ブロックを設定します。試料を置くシリアル極薄断面が場合の実際の位置に対して反時計回り 90 ° 実行 (参照してください図 5 d)。</li>
	<li>ダイヤモンド トリミング ナイフ (参照してください図 5 d) ブロックの表面をカットします。ダイヤモンド ナイフ エッジを標本ブロック面に平行に設定し、全ての試料 (図 5 d) を失うように試料表面の最小量をカットします。 注: この手順は、試料の表面を滑らかに行われます。スリムな一部の試料表面の一部はそのまま (したがってこの部分は輝いていない鏡、図 5 dのような)、シリアル区分のため試料の任意の部分を失うように。供試体はブロックの表面にさらされるためにです。</li>
	<li>(図 5 c) 試料ブロックの切断を監視するナイフ ステージ上ミラー (メサ カット、M) を配置します。</li>
	<li>ナイフ ステージ (図 5 a) 左に 30 ° 回転させてトリミング ナイフを使用してブロックの左端 (上側、図 5 d、シリアルセクショニングでサンプルになります) をカットします。</li>
	<li>(シリアル断面、図 5 dで試験片の下側になります) 標本の左端からナイフ ステージ (図 5 b) 右に 30 ° を回転させることにより約 100 μ m でのブロックの顔をカットします。 注: 連続切片は、約 90 の標本のスリムの部分からカットされますサイズ約 1 mm x nm。大きい部分が平行になるよう試料表面とナイフのエッジを調整する使用されます。ナイフ エッジに平行に試料表面を調整した後、大部分はかみそりの刃で削除されます。ミクロトームを用いた試験体の上下を切断することによって試料の両側になり滑らかな正確に平行互い (図 5 d) ストレートと切れ目のないリボンのセクションを取得する必要があります。</li>
</ol>4 21を互いに平行に顔を試料表面とナイフのエッジの調整
<ol><li>トリミング ナイフを削除し、標本ブロック 90 ° 右回りに回転します。</li>
	<li>極薄のセクショニング ナイフをナイフ ステージに設定します。</li>
	<li>試験片表面の大きい一部分を使用して互いに平行に顔を試料表面と、鋭利なエッジを調整します。 注: シリアル断面の切断面が小さいので、特に垂直方向でのみ、この部分を使用して試料表面とナイフ エッジを調整し難いので、標本の大部分は調整に使用です。このように、標本の大部分を使用して容易に調整。</li>
</ol>5. 試料ブロック (図 6) のネオプレン ソリューションの広がり
<ol><li>試料チャックを配置すると、元の位置と同じ位置でするには、チャックとミクロトームのチャック ホルダー テープを適用し、(図 6 a) 境界でカットします。</li>
	<li>試料チャック、ミクロトームから取り出して (図 6 b) 顕微鏡の下に置きます。連続切片の取得元となる、スリムな部分を残してかみそりの刃をもつ試料の大部分を遮断します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して、セクションの側面の接着剤を作るために, 使用する試料に約 1 μ L 0.5% ネオプレン ソリューション (図 6 b) をドロップします。ネオプレン ソリューション全体の標本をカバーします。試料のそばにフィルター紙の部分で余分なネオプレン ソリューションをすぐに吸収します。セクションのリボンを取得シリアル細胞の断面の写真を撮るために不可欠、ネオプレン接着剤は非常に有用なセクションを一緒に付けるため。</li>
	<li>3 スリット グリッドの準備 (スリットのサイズ: 中間、0.4 mm x 2.2 mm、両方側面 0.2 mm × 2.2 mm) (図 6 c) 60 ° にグリッドのハンドルを曲げることによって連続切片を拾う、ため治療 0.5% ネオプレン ソリューション、グリッドとグリッドによって親水性を作るグロー放電22。</li>
</ol>6. シリアル セクション (図 7-9) を作る
<ol><li>試料ブロックの場所は、によって録音された部品を整列させる 5.1 (図 6 a) と同じ位置にミクロトームのチャックします。これによりブロックの顔とナイフ エッジお互いに完全に平行。供試体の近くにナイフをもたらします。</li>
	<li>ナイフ ボートを水で埋めます。</li>
	<li>ミクロトームを気流 (図 7) を防ぐためにプラスチック製のカバーでカバーします。 注: 問題が発生する極薄切片としばしばセクションの検索中に空気の流れ。プラスチック製のカバーは 3 つの穴: 両眼のレンズの 1 つの穴があり、他の 2 つの穴は、カバーが上にあるときに操作を許可するように腕。木製アームレストは、グリッドと連続切片の取得などの繊細な作業をしながら腕を配置するために使用されます。木製アームレストは、トームにオペレーターの手の振動を送信しないようにミクロトーム テーブル (図 7矢印) から別のテーブルに配置されます。</li>
	<li>200 nm 厚 (図 8) で試料の切削を開始します。200 nm の厚さで設定は、供試体の表面にナイフを持って来ることで時間を節約します。</li>
	<li>最初のセクションは、カット後切片厚を 70 に設定 nm (図 8)。</li>
	<li>連続切片数が 20 (正確に言えば、約 1.8 mm; セクションの数のセクションの幅によって異なりますリボン到達後) に達したとき、切片厚を 10 に設定をカットしながら nm (図 8)。 注: ミクロトームは、10 nm 厚のセクションを切り取ることはできません、ので新しいセクションが表示されない、以前の断面は、ナイフエッジ離れ離れになっています。髪の毛のペアを使用して手動でセクションを分離することの難しさを避けるために連続切片を拾うため分離されたセクション グループ (図 9) を取得することが重要です。透過型電子顕微鏡の視野は 2.0 mm なのでセクションはせいぜい 1.8 mm をする必要があります。</li>
	<li>切片厚を 60 に設定 nm (図 8)。マシンは以前の 10 nm の厚さを追加しますので、これは 70 nm セクション (図 8) になります。</li>
	<li>切片厚を 70 に設定 nm (図 8) 長 1.8 mm のセクションを取得するまで切断を継続。</li>
	<li>6.6 6.8 を繰り返して 5 1.8 mm 長いセクションが (図 9) を得られます。私たちの研究室で利用できる透過型電子顕微鏡で 5 つの標本のホールダーがあるが、5 は制限されていませんので、通常 5 つのセクション グループを行います。</li>
</ol>7. シリアル セクション (図 10-12) を拾う
<ol><li>'セクション保持ループ'23を配置 (ループの内径: 5.0 mm) (図 10 a) の 3 番目のセクション グループ (図 10 b)。 注: 正しい順序で写真を撮るための区分の順序でセクションを取得するために必要です。ただし、ナイフ ボートに 5 つのセクション グループがある、のでそれしばしば取得混乱しているグループが。ループを 3 番目のグループに配置することによって、オペレーターの近くに 2 つのグループは、明らかになればオペレーターから遠い 2、2 番目の最初と 4 番目と 5 番目のグループ (図 10 b)。これは順序を混合を防ぐ。</li>
	<li>'水表面調達ループ'23を配置 (WSRL、ループの内部の直径: 4.0 mm) (図 11 a) ナイフ ステージ (図 11 b)。WSRL は、底に磁石を備えているためナイフ舞台にしっかりと立つが。<ol>
<li>連続切片のすぐ上のシャフトとのハンドルを移動することによって、WSRL のループを配置します。ループ セクションを取り囲むように水面の上に WSRL のループを下げます。</li>
		<li>水の表面が表面張力 (図 11 c d) によって発生するので下ネジを回してループを押し下げます。ループの中央セクションに移動、水の頂点に位置、髪のストランド21を使用して、断面の方向を調整します。</li>
		<li>裸スリット-グリッド、ピンセットによる開催は、水の表面 (図 11 d) に平行に触れることにより、セクション グループを拾います。セクション最初に、グリッドに触れることがなく、水 (図 11 d) のグリッドの中央に正確にセクションを配置するが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ホルムバール サポート フィルム16 (図 12)、水の小さなドロップと一緒にセクションでグリッドを配置し、ろ紙を使用して余分な水分を削除します。 注: 支持膜のしわは、しばしば問題のセクションは、膜 (セクション) は、直接膜 (フィルム) を触れるので支持フィルムとグリッドを使用してピックアップです。サポート フィルムのしわを取得の問題がホルムバール サポート フィルム16水の小さなドロップと一緒にセクション軸受グリッドを配置することによって削減します。</li>
</ol>8. 染色のセクション16,24 (図 13)
<ol><li>セクションが完全に乾いたら、グリッド、周りからホルムバール フィルムを引き裂くし、セクションを軸受グリッドを削除します。</li>
	<li>適切な順序 (図 13) で染色チューブ16の溝にグリッドを設定し、ウラニル酢酸および鉛のクエン酸のための24のセクションを染色します。 注: ある溝深さ 0.6 mm 管の長軸に沿ってかみそりの刃でカットします。チューブは16染色、洗浄プロセスの間にグリッドへ直接な取り扱いは必要ありませんので、ピンセットを使用する場合にサポート フィルムの破損事故を防止するために役立ちます。</li>
</ol>9. シリアル セクション (図 14) の観察
<ol><li>試料ホルダーの軸に垂直なグリッド スリットの長軸を方向づけるマルチ ホルダー (図 14 a)、適切な順番で 5 グリッドを設定します。'グリッド フィクサー' はハンドルを触れないので、カットがグリッドのハンドル (矢印) にはありません。</li>
	<li>' グリッド fixers' (図 14 b) のグリッドを修正し、透過型電子顕微鏡試料ホルダーに挿入します。 注: それターゲット細胞の写真を撮影する前にすべてのセル セクション (図 15) 汚染なしと良好な固定性、良好な状態で興味深い微生物や細胞を見つけるための低倍率の画像を撮影する便利です。</li>
	<li>高倍率でのすべてのセルのセクションで標的細胞の写真を撮る。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. 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J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで紹介した方法は、高価な機器を必要としません。染色管 (図 13)、水表面を上げるループ (図 11 a)、ループ セクションを保持 (図 10 a) 3 スリット グリッド (図 6 c) アルミ ラック (図 3) のみが必要です。現在のメソッドの多くの機能があります。標本の大部分は、互いに平行に?...

適切なシリアル極薄断面法は細胞および三次元電子顕微鏡レベルでの細胞成分の研究に不可欠であります。酵母細胞の細胞周期におけるスピンドル極体のダイナミクスを検討し、, 細胞周期と重複1,2,3,の時間の間に彼らの微細構造の形態学的変化を明らかにいる4,5。2006 年に「構造」を組み合わせることで新しい単語 'ストラクトーム」を造語と '-青梅 '、'構造情報、電子顕微鏡レベルで全体細胞の、定量的および三次元' 6,7として定義。
シリアルの極薄断面法を必要とするストラクトーム解析による酵母とExophiala dermatitidisの酵母細胞が約 200,000 リボゾーム7、8、を持っていたことがわかった。大腸菌セル 26,000 リボゾーム9、結核菌細胞いた 1,700 リボゾーム10明神らせん状細菌のみ 300 リボゾーム11を持っていた。この情報だけでなく各有機体、9種の同定にも成長率の推定に役に立ちます。
さらに、ストラクトーム解析; 新しい有機体の発見につながったParakaryon myojinensisは、細胞構造が原核生物と真核生物12,13,14,15の間中間日本の海岸沖の深海で発見されました。現時点では、シリアルの極薄断面法マスターに長い時間がかかるので困難であると見なされます。本研究では難なく極薄シリアルセクショニングを実行できます誰も信頼性の高い方法を開発しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formvar making apparatus</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>652</td>
			<td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>-</td>
			<td>76 x 26 x 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum rack with 4-mm holes</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>658</td>
			<td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic trimming blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesa cut</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit nickel grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2458</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit copper grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2459</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section-holding loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>526</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-surface-raising loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>527</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tube</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-specimen holder</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>EM-11170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

細胞と細胞成分を透過型電子顕微鏡の高倍率で 3 次元観察試料の超薄切片を準備する必要があります。連続超薄切片の準備は非常に困難であると考えられている適切な方法を使用する場合より簡単です。本稿では微生物の連続超薄切片を安全に取得するためのステップバイ ステップの手順を紹介します。このメソッドの重要なポイントは、: 1) 標本の大部分を使用し、互いに平行になるので、試料の表面とナイフのエッジを調整するには2) グループの連続切片をカット、スリット格子; に連続切片のグループを取得するときに髪の毛のペアを使用してセクションを分離することの難しさを避けるために3) 'セクション保持ループ' を使用してセクション グループの順序を混合しないように4)「水表面調達ループ」を使用してセクションは水頂点に配置され、こと; グリッドの目的の位置に配置するためのグリッドを最初タッチを確認するには5) アルミ ラック支持フィルムを使用し、容易にグリッド上のセクションを回復するしサポート フィルムのしわを避けるために・ 6) 染色チューブを使用し、誤ってピンセットでサポート フィルムを破ることを避けます。この新しいメソッドは、難なく連続超薄切片を取得できます。メソッドは、自動テープ収集ウルトラミクロトーム メソッドとシリアル ブロック顔または集束イオンビーム走査電子顕微鏡を使用して達成することができない、3 D の高解像度で微生物の細胞構造を解析することが可能になります。

このプロトコルでは、3 スリット格子は連続切片を拾うために使用されていました。グリッドは、ニッケルや銅の作られています。連続切片は、真ん中のスリットに配置されます。両側スリットは、グリッドとそれらを拾うときにセクションを表示する必要があります。グリッド連続切片と平行するときしてピンセット (図 11 d) でそれらを拾い?...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

本研究は、透過型電子顕微鏡の高価な機器なし微生物の連続超薄切片を得るため信頼性が高く、簡単な手順を示します。

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

14.0K ビュー.  Chiba University. 本研究は、透過型電子顕微鏡の高価な機器なし微生物の連続超薄切片を得るため信頼性が高く、簡単な手順を示します。

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Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted significant interests across the research fields of materials science, physics, chemistry and biology. The key enabling technology is a liquid cell. We fabricate liquid cells with thin viewing windows through a sequential microfabrication process, including silicon nitride membrane deposition, photolithographic patterning, wafer etching, cell bonding, etc. A liquid cell with the dimensions of a regular TEM grid can fit in any standard TEM sample holder. About 100 nanoliters reaction solution is loaded into the reservoirs and about 30 picoliters liquid is drawn into the viewing windows by capillary force. Subsequently, the cell is sealed and loaded into a microscope for in situ imaging. Inside the TEM, the electron beam goes through the thin liquid layer sandwiched between two silicon nitride membranes. Dynamic processes of nanoparticles in liquids, such as nucleation and growth of nanocrystals, diffusion and assembly of nanoparticles, etc., have been imaged in real time with sub-nanometer resolution. We have also applied this method to other research areas, e.g., imaging proteins in water. Liquid cell TEM is poised to play a major role in revealing dynamic processes of materials in their working environments. It may also bring high impact in the study of biological processes in their native environment.

We have developed a self-contained liquid cell, which allows imaging through liquids using a transmission electron microscope. Dynamic processes of nanoparticles in liquids can be revealed in real time with sub-nanometer resolution.

液晶セルの透過型電子顕微鏡を使用して液体の材料の動的過程を明らかにする

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

工学

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

その場での透過型電子顕微鏡での時間依存絶縁破壊：マイクロエレクトロニクスデバイスの故障メカニズムを理解することが可能

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and nanocrystalline materials. The traditional techniques associated with scanning electron microscopy (SEM), such as electron backscatter diffraction (EBSD), do not possess the required spatial resolution due to the large interaction volume between the electrons from the beam and the atoms of the material. Transmission electron microscopy (TEM) has the required spatial resolution. However, due to a lack of automation in the analysis system, the rate of data acquisition is slow which limits the area of the specimen that can be characterized. This paper presents a new characterization technique, Transmission Kikuchi Diffraction (TKD), which enables the analysis of the microstructure of UFG and nanocrystalline materials using an SEM equipped with a standard EBSD system. The spatial resolution of this technique can reach 2 nm. This technique can be applied to a large range of materials that would be difficult to analyze using traditional EBSD. After presenting the experimental set up and describing the different steps necessary to realize a TKD analysis, examples of its use on metal alloys and minerals are shown to illustrate the resolution of the technique and its flexibility in term of material to be characterized.

This paper provides a detailed method to characterize the microstructure of ultra-fine grained and nanocrystalline materials using a scanning electron microscope equipped with a standard electron backscatter diffraction system. Metal alloys and minerals presenting refined microstructures are analyzed using this technique, showing the diversity of its possible applications.

トランスミッション菊池回折を用いて超微細粒とナノ結晶材料のキャラクタリゼーション

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Fabrication of Magnetic Nanostructures on Silicon Nitride Membranes for Magnetic Vortex Studies Using Transmission Microscopy Techniques

Electron and x-ray magnetic microscopies allow for high-resolution magnetic imaging down to tens of nanometers. However, the samples need to be prepared on transparent membranes which are very fragile and difficult to manipulate. We present processes for the fabrication of samples with magnetic micro- and nanostructures with spin configurations forming magnetic vortices suitable for Lorentz transmission electron microscopy and magnetic transmission x-ray microscopy studies. The samples are prepared on silicon nitride membranes and the fabrication consists of a spin coating, UV and electron-beam lithography, the chemical development of the resist, and the evaporation of the magnetic material followed by a lift-off process forming the final magnetic structures. The samples for the Lorentz transmission electron microscopy consist of magnetic nanodiscs prepared in a single lithography step. The samples for the magnetic x-ray transmission microscopy are used for time-resolved magnetization dynamic experiments, and magnetic nanodiscs are placed on a waveguide which is used for the generation of repeatable magnetic field pulses by passing an electric current through the waveguide. The waveguide is created in an extra lithography step.

A protocol for the fabrication of magnetic micro- and nanostructures with spin configurations forming magnetic vortices suitable for transmission electron microscopy (TEM) and magnetic transmission x-ray microscopy (MTXM) studies is presented.

磁気渦の研究伝達顕微鏡検査の技術を使用してシリコン窒化膜の磁性ナノ構造の作製

Electron and x-ray magnetic microscopies allow for high-resolution magnetic imaging down to tens of nanometers. However, the samples need to be prepared ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

収差補正走査透過電子顕微鏡と 1 桁台のナノメートルの電子ビーム露光

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

Graphene-Assisted Quasi-van der Waals Epitaxy of AlN Film on Nano-Patterned Sapphire Substrate for Ultraviolet Light Emitting Diodes

This protocol demonstrates a method for graphene-assisted quick growth and coalescence of AlN on nano-pattened sapphire substrate (NPSS). Graphene layers are directly grown on NPSS using catalyst-free atmospheric-pressure chemical vapor deposition (APCVD). By applying nitrogen reactive ion etching (RIE) plasma treatment, defects are introduced into the graphene film to enhance chemical reactivity. During metal-organic chemical vapor deposition (MOCVD) growth of AlN, this N-plasma treated graphene buffer enables AlN quick growth, and coalescence on NPSS is confirmed by cross-sectional scanning electron microscopy (SEM). The high quality of AlN on graphene-NPSS is then evaluated by X-ray rocking curves (XRCs) with narrow (0002) and (10-12) full width at half-maximum (FWHM) as 267.2 arcsec and 503.4 arcsec, respectively. Compared to bare NPSS, AlN growth on graphene-NPSS shows significant reduction of residual stress from 0.87 GPa to 0.25 Gpa, based on Raman measurements. Followed by AlGaN multiple quantum wells (MQWS) growth on graphene-NPSS, AlGaN-based deep ultraviolet light-emitting-diodes (DUV LEDs) are fabricated. The fabricated DUV-LEDs also demonstrate obvious, enhanced luminescence performance. This work provides a new solution for the growth of high quality AlN and fabrication of high performance DUV-LEDs using a shorter process and less costs.

A protocol for graphene-assisted growth of high-quality AlN films on nano-patterned sapphire substrate is presented.

紫外発光ダイオード用ナノパターンサファイア基板上のAlNフィルムのグラフェン支援準ファンデルワールスエピタキシー

This protocol demonstrates a method for graphene-assisted quick growth and coalescence of AlN on nano-pattened sapphire substrate (NPSS). Graphene layers ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different materials show variability in resistive switching properties due to the intrinsic nature of the material used, leading to discrepancies in the field because of underlying operation mechanisms. This highlights a need for a reliable technique to understand mechanisms using nanostructural observations. This protocol explains a detailed process and methodology of in&#160;situ nanostructural analysis as a result of electrical biasing using transmission electron microscopy (TEM). It provides visual and reliable evidence of underlying nanostructural changes in real time memory operations. Also included is the methodology of fabrication and electrical characterizations for asymmetric crossbar structures incorporating amorphous vanadium oxide. The protocol explained here for vanadium oxide films can be easily extended to any other materials in a metal-dielectric-metal sandwiched structure. Resistive switching crossbars are predicted to serve the programmable logic and neuromorphic circuits for next-generation memory devices, given the understanding of the operation mechanisms. This protocol reveals the switching mechanism in a reliable, timely, and cost-effective way in any type of resistive switching materials, and thereby predicts the device&#39;s applicability.

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Presented here is a protocol for analyzing nanostructural changes during in&#160;situ biasing with transmission electron microscopy (TEM) for a stacked metal-insulator-metal structure. It has significant applications in resistive switching crossbars for the next generation of programmable logic circuits and neuromimicking hardware, to reveal their underlying operation mechanisms and practical applicability.

混相a-VOxに基づく非対称クロスバーのバイアスと作製を用いたSitu透過電子顕微鏡

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Performing In Situ Closed-Cell Gas Reactions in the Transmission Electron Microscope

Gas reactions studied by in situ electron microscopy can be used to capture the real-time morphological and microchemical transformations of materials at length scales down to the atomic level. In situ closed-cell gas reaction (CCGR) studies performed using (scanning) transmission electron microscopy (STEM) can separate and identify localized dynamic reactions, which are extremely challenging to capture using other characterization techniques. For these experiments, we used a CCGR holder that utilizes microelectromechanical systems (MEMS)-based heating microchips (hereafter referred to as &#34;E-chips&#34;). The experimental protocol described here details the method for performing in situ gas reactions in dry and wet gases in an aberration-corrected STEM. This method finds relevance in many different materials systems, such as catalysis and high-temperature oxidation of structural materials at atmospheric pressure and in the presence of various gases with or without water vapor. Here, several sample preparation methods are described for various material form factors. During the reaction, mass spectra obtained with a residual gas analyzer (RGA) system with and without water vapor further validates gas exposure conditions during reactions. Integrating an RGA with an in situ CCGR-STEM system can, therefore, provide critical insight to correlate gas composition with the dynamic surface evolution of materials during reactions. In situ/operando studies using this approach allow&#160;for detailed investigation of the fundamental reaction mechanisms and kinetics that occur at specific environmental conditions (time, temperature, gas, pressure), in real-time, and at high spatial resolution.

Performing In Situ Closed-Cell Gas Reactions in the Transmission Electron Microscope

Here, we present a protocol for performing in situ TEM closed-cell gas reaction experiments while detailing several commonly used sample preparation methods.

透過型電子顕微鏡 で の密閉セルガス反応の実施

Gas reactions studied by in situ electron microscopy can be used to capture the real-time morphological and microchemical transformations of materials at ...

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the surgical and instrumental expertise required to accurately quantify the structure and organization across multiple length scales have stunted its advancement. This work provides a detailed description of the murine dissection, en bloc staining, sample processing, and correlative imaging procedures for depicting the heart valve at different length scales. Hydrostatic transvalvular pressure was used to control the temporal heterogeneity by chemically fixing the heart valve conformation. Micro-computed tomography (&#181;CT) was used to confirm the geometry of the heart valve and provide a reference for the downstream sample processing needed for the serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM). High-resolution serial SEM images of the extracellular matrix (ECM) were taken and reconstructed to provide a local 3D representation of its organization. &#181;CT and SBF-SEM imaging methods were then correlated to overcome the spatial variation across the pulmonary valve. Though the work presented is exclusively on the pulmonary valve, this methodology could be adopted for describing the hierarchical organization in biological systems and is pivotal for the structural characterization across multiple length scales.

Here, we describe a correlative workflow for the excision, pressurization, fixation, and imaging of the murine pulmonary valve to determine the gross conformation and local extracellular matrix structures.

ネズミ肺動脈弁の相関画像化のための手術とサンプル処理

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...