우리는 진심으 그의 귀중 한 제안 및 토론을 위한 시게오 기타 감사합니다. 우리 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 존과 스미 레 크 스 테 인을 감사합니다.

참고:이 연구에 사용 된 표본은 미생물, 액체 질소, 프로 판으로 급속 하 게 냉동 동결 2% 오스뮴 tetroxide, 포함 된 아세톤에 대체 및 에폭시 수 지1,2,3,에에서 포함 된 4,5,6,7,,89,10,11,12,13 ,,1415,,1617,18.
1. 지원 영화 (그림 1-3)의 준비
참고: 은색 Formvar 지원 영화 캐스팅에 유리 방법19를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.
<ol><li>100 mL 1.5%의 추가 Formvar Formvar 만드는 장치 (그림 1)을 에틸렌 dichloride에. 공기 고무 공19를 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 유리 슬라이드 (76 m m 26 m m x 1.3 m m x) 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서의 절반을 찍어.<ol>
<li>3-방법으로 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 솔루션을 배출. 유리 슬라이드 표면에 필름 형태의 유리 슬라이드와 공기에서 건조 장치에서 꺼내 주세요. 백열 램프를 사용 하 여 Formvar 영화의 건조를 가속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>영화 (그림 2a), 면도날으로 유리 슬라이드에 4 개의 가장자리에서 근 근이, 슬라이드20에서 영화의 분리를 촉진 하기 위해 슬라이드에 호흡으로 유리 슬라이드를 immersing 하 여 물에 영화에서 부동 하는 후에 물이 천천히 낮은 수평 각도 (약 10 °, 그림 2b).</li>
	<li>구멍 (지름 4 mm) 알루미늄 랙 (25 m m x 3 m m x 30)를 사용 하 여 물에서 Formvar 영화 올리다 (그림 3a). 사용 (그림 3b)까지 한 desiccator Formvar 영화와 함께 랙 유지.</li>
</ol>2. 초음파 트리밍 블레이드와 면도날 21 stereomicroscope (그림 4)에서 표본 블록 트리밍
<ol><li>셀 블록의 표면에는 블록의 끝 (그림 4a) 가벼운 현미경으로 관찰 하 여 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>척 (블록 홀더), 표본 블록을 탑재 하 고 트리밍 단계21 (그림 4b)에 물림 쇠를 탑재. 이 트리밍 단계는 표본 뒤쪽에서 조명 메커니즘이 있습니다.</li>
	<li>0.7 m m x 1.0 m m (그림 4, 5)의 크기에 블록을 잘라. 에폭시 수 지 매우 하드 이기 때문에, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용 하 여 블록을 잘라. 초음파 트리밍 블레이드는 새로 도입된 된 기계 이며 블록 쉽게 잘립니다. 다음에 면도날으로 더 블록 트림. (참조 그림 5 d, 그림 8) 절단의 방향을 표시 한 어깨를 잘라.</li>
</ol>3. 톰 (그림 5)를 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록 트리밍
<ol><li>ultramicrotome의 견본 홀더 척 견본 블록 설정 합니다. 장소는 표본 90도 시계 반대 방향으로 직렬 ultrathin 단면 때 실제 위치에 대 한 수행 (참조 그림 5 d).</li>
	<li>다이아몬드 트리밍 나이프 (참조 그림 5 d)와 블록의 표면을 잘라. 다이아몬드 칼 날 견본 블록 얼굴에 평행 하 게 설정 하 고 어떤 견본 (그림 5 d)을 잃을 수 없습니다 견본 표면의 최소 금액을 잘라. 참고:이 단계 표본 표면을 매끄럽게 수행 됩니다. 슬림 부분의 견본 표면의 일부는 그대로 (따라서이 부분은 아니라 처럼 빛나는 거울, 그림 5 d), 직렬 단면에 대 한 표본의 일부를 잃을 수 없습니다. 이것은 표본 블록의 표면에 노출 되어 있기 때문 에입니다.</li>
	<li>표본 블록 (그림 5c)의 절단을 모니터링 하는 데 칼 스테이지의 거울 (메사 컷, M)를 배치 합니다.</li>
	<li>잘라 칼 무대 왼쪽 (그림 5a)에 30 ° 회전 하 여 트리밍 나이프를 사용 하 여 블록의 왼쪽된 가장자리 (이것은 상단에, 그림 5 d, 직렬 단면에 샘플의 된다).</li>
	<li>칼 무대 오른쪽 (그림 5b)에 30 ° 회전 하 여 표본 (이 됩니다 직렬 단면, 그림 5 d에 견본의 더 낮은 측)의 왼쪽된 가장자리에서 약 100 µ m에서 블록 얼굴을 잘라. 참고: 직렬 섹션은 약 90의 견본의 슬림 부분에서 삭감 될 것 이다 nm 크기에서 약 1 m m x. 큰 부분은 평행 되도록 견본 표면 및 칼 날을 조정 하기 위해 사용 됩니다. 칼 날에 평행 되도록 견본 표면 조정 후 큰 부분 면도날으로 제거 됩니다. 톰을 사용 하 여 견본의 상단 및 하단 측면을 절단 하 여 표본 양쪽 모두 될 원활 하 고 정확 하 게 서로 평행 하 게 (그림 5 d)는 직선과 끊어지지 리본 섹션을 얻을 필요가 있다.</li>
</ol>4. 조정 견본 표면 및 칼 가장자리를 서로 21 병렬 마주
<ol><li>트리밍 나이프를 제거 하 고 표본 블록 시계 방향으로 90 ° 회전.</li>
	<li>칼 단계로 ultrathin 단면 나이프를 설정 합니다.</li>
	<li>서로 견본 표면의 큰 부분을 사용 하 여 병렬 마주 견본 표면 및 칼 날을 조정 합니다. 참고: 큰 표본 부분의 사용 됩니다 조정 직렬 단면 절단 얼굴 너무 작습니다, 어렵게 견본 표면 및 칼 지만,이 부분을 사용 하 여 수직 방향에 특히 조정 때문에. 따라서, 표본의 큰 부분을 사용 하 여 쉽게 조정 합니다.</li>
</ol>5. 견본 블록 (그림 6)에 네오프렌 솔루션 확산
<ol><li>원래 위치와 정확히 같은 위치에 견본 척을 배치 하는 척 척 홀더는 톰의에 테이프를 적용 하 고 경계 (그림 6a)에서 잘라.</li>
	<li>톰에서 표본 척 밖으로 하 고 stereomicroscope (그림 6b)에서 그것을 배치. 면도날으로 견본의 큰 부분을 잘라, 슬림 부분 직렬 섹션에서 떠나는 것입니다 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 섹션 측 접착제 있도록 직렬 단면에 사용할 표본에 약 1 µ L 0.5 %neoprene 솔루션 (그림 6b) 드롭. 커버 neoprene 솔루션 전체 표본. 필터 종이 시료 근처에 배치와 함께 과잉 neoprene 솔루션을 즉시 흡수. 섹션의 리본을 얻기 직렬 셀 섹션의 사진 촬영을 위한 필수적 이며 neoprene 접착제 섹션을 함께 튀어나와 매우 유용.</li>
	<li>준비 3-슬릿 격자 (슬릿의 크기: 중간, 0.4 m m x 2.2 m m, 모두 양쪽 0.2 m m x 2.2 m m) (그림 6c) 60 ° 격자의 핸들 여 직렬 섹션을 따기 위한 치료 0.5 %neoprene 솔루션, 격자 및 격자에 의해 친수성 만들기 글로우 방전22.</li>
</ol>6. 직렬 섹션 (그림 7-9)
<ol><li>장소 견본 블록 녹화 부분을 정렬 하 여 5.1 (그림 6a)와 같은 위치에서 톰에 다시 척. 이 블록 얼굴과 칼 날 완벽 하 게 서로 평행 하 게 유지합니다. 다음에 견본에 가까운 칼가지고.</li>
	<li>물으로 칼 보트를 채우십시오.</li>
	<li>공기 (그림 7)를 방지 하기 위해 플라스틱 커버는 톰을 커버. 참고: 공기 ultrathin 단면화 및 섹션의 자주 검색 하는 동안 문제가 발생할. 플라스틱 덮개는 3 개의 구멍: 한 구멍 쌍 안 렌즈 이며 다른 두 구멍 덮개에 사용 하는 동안 작업을 허용 하도록 무기에 대 한. 나무 팔걸이 격자와 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 하 고 있는 동안 무기를 배치 하는 데 사용 됩니다. 나무 팔걸이 톰 연산자의 손의 진동 전송 수 없습니다 톰 테이블 (그림 7, 화살표), 다른 테이블에 배치 됩니다.</li>
	<li>200 nm 섹션 두께 (그림 8)에 시료를 절단 시작 합니다. 200 nm 두께 시료의 표면에 칼을 데 려에 시간을 절약할 것 이다.</li>
	<li>첫 번째 섹션을 잘라 후 설정 섹션 두께 70 nm (그림 8).</li>
	<li>직렬 섹션의 수에 (정확 하 게 말하기, 약 1.8 m m; 섹션의 수에 따라 섹션의 폭의 리본에 도달 후) 20를 도달 하는 경우, 설정 섹션 두께 10 nm (그림 8)을 계속 하는 동안. 참고: 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션에서 칼 날 분리 되. 그것은 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 수동으로 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 직렬 섹션을 따기 위한 분리 된 섹션 그룹 (그림 9)를 얻는 것이 중요. 전송 전자 현미경에서 시야 2.0 m m 이므로, 섹션에서 가장 긴 1.8 m m 이어야 한다.</li>
	<li>설정 섹션 두께 60 nm (그림 8). 이 기계는 이전 10 nm 두께 추가 합니다 때문에 70 nm 섹션 (그림 8)을 생산할 예정 이다.</li>
	<li>섹션 두께 70 다시 설정 nm (그림 8) 절단 1.8 m m 긴 섹션 얻을 때까지 계속.</li>
	<li>6.6-6.8를 반복 하 여 1.8 m m 긴 섹션 5 (그림 9) 얻을 수 있습니다. 우리가 일반적으로 이후 5 견본 홀더 전송 전자 현미경에서 우리의 실험실에서 사용할 수 있지만 5도 아니다 5 섹션 그룹을 확인 합니다.</li>
</ol>7. 직렬 섹션 (그림 10-12)를 따기
<ol><li>'루프 섹션 지주'23 장소 (루프의 내부 직경: 5.0 m m) (그림 10a)에 세 번째 섹션 그룹 (그림 10b). 참고: 그것은 적절 한 순서로 사진을 찍을 그들의 단면 순서 섹션을 검색 하는 데 필요한입니다. 그러나 칼 보트에 5 섹션 그룹 이후, 그것은 종종 되 면 혼동 그룹은. 세 번째 그룹에는 루프를 두어서, 그것은 분명해 연산자 가까이 두 그룹은 첫 번째 및 두 번째, 그리고 연산자에서 먼 2는 네 번째 및 다섯 번째 그룹 (그림 10b). 이 순서를 혼합 되지 것입니다.</li>
	<li>'물 표면 높이 루프'23 장소 (WSRL, 루프의 내부 직경: 4.0 m m) (그림 11a) 칼 스테이지 (그림 11b). WSRL 하단에 자석으로 되어 있기 때문에 칼 무대에 굳게 설 것 이다.<ol>
<li>그것의 축과 핸들을 이동 하 여 직렬 섹션 바로 위에 WSRL의 루프를 배치 합니다. 낮은 물 표면에 WSRL의 루프는 루프 encircles 섹션.</li>
		<li>물 표면 표면 장력 (그림 11 c-d)에 의해 발생 합니다 있도록 나사를 아래쪽으로 선회 하 여 루프를 아래로 누릅니다. 섹션 루프의 중심을 이동, 물의 꼭대기에 위치 하 고 머리 가닥21을 사용 하 여 섹션의 방향을 조정 합니다.</li>
		<li>벌 거 벗은 슬릿-그리드, 핀셋에 의해 개최 되 고 (그림 11 d) 물 표면에 평행 하 게 유지 하는 그것을 만져 섹션 그룹을 선택 합니다. 그것은 섹션 그리드를 먼저 터치 하는 물, 격자 (그림 11 d)의 중앙에 정확 하 게 섹션을 배치 하는 것이 중요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물 작은 방울과 함께 섹션 격자를 Formvar 지원 영화16 (그림 12)에 놓고 필터 종이 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다. 참고: 지원 영화의 주름 때 종종 문제가 섹션 선택 사용 하 여 그리드 지원 영화 막 (섹션) 막 (지원 영화)를 직접 접촉 하기 때문에. 지원 영화에 주름을 지 고의 문제는 Formvar 지원 영화16에 물 작은 방울과 함께 섹션 베어링 그리드를 배치 하 여 크게 감소 된다.</li>
</ol>8. 얼룩 섹션16,24 (그림 13)
<ol><li>섹션은 완전히 건조 후 격자, 주위에서 Formvar 영화 눈물 고 섹션 베어링 격자를 제거 합니다.</li>
	<li>(그림 13), 적절 한 순서로 얼룩 튜브16 의 홈에 격자를 설정 하 고 얼룩 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산24섹션. 참고: 저기 홈 깊이 0.6 m m 튜브의 긴 축을 따라 면도날으로 잘라. 튜브는 격자의 직접 처리 얼룩 및 세탁기 과정16동안 필요 하지 않습니다 이후 핀셋를 사용 하는 경우 지원 영화의 실수로 파손을 방지 하기 위한 유용 합니다.</li>
</ol>9. 직렬 섹션 (그림 14)의 관찰
<ol><li>방향을 견본 홀더 축에 수직 그리드 슬릿의 긴 축에 적절 한 순서로 (그림 14a), 멀티 견본 홀더 5 격자를 설정 합니다. 격자의 핸들 (화살촉) 할 필요가 없습니다 수 컷, ' 그리드 설치 ' 핸들 건드리지 않을 때문에.</li>
	<li>' 그리드-설치 ' (그림 14b)와 격자를 해결 하 고 전송 전자 현미경 견본 홀더를 삽입. 참고: 그것은 종종 목표 셀의 사진을 복용 하기 전에 모든 셀 섹션 (그림 15) 좋은 조건 좋은 고정과 오염 없이 재미 있는 미생물 또는 세포를 찾을 수의 낮은 확대 이미지를 유용 합니다.</li>
	<li>높은 확대에 모든 셀 섹션에 대상 셀의 사진을 찍을.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. 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K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 방법을 비싼 장비를 요구 한다. 그것은 필요로 한 알루미늄 랙 (그림 3), 3-슬릿 격자 (그림 6c), 섹션 지주 루프 (그림 10a), 루프 물 표면 높이 (그림 11a), 및 얼룩 튜브 (그림 13). 현재 방법의 많은 기능을 확인 하 고 있습니다. 시료의 큰 부분 그들은 얼굴을 서로 병렬 견본 ?...

적절 한 직렬 ultrathin 단면 기술은 세포와 세포 구성 요소 전자 현미경 수준에서 3 차원으로 공부에 불가결 이다. 우리 효 모 세포의 세포 주기에서 스핀 들 극 본문의 역학을 공부 하 고 세포 주기 및 중복1,2,3, 의 시간 동안 그들의 열 대권 외의 형태학 변화 공개 4,5. 2006 년에, 우리는 '구조'를 결합해 새로운 단어 'structome'를 만들어낸와 '-오 ', '양적 및 3 차원 구조 정보 전자 현미경 수준에 전체 셀의 ' 6,7로 정의.
Structome 분석, 직렬 ultrathin 단면 기술을 요하는 그것 발견 Saccharomyces cerevisiae 와 Exophiala dermatitidis 효 모 세포 약 200000 리보솜7,8, 는 했다 대장균 셀 26000 리보솜9, 결핵균 셀 했다 1700 리보솜10 고 묘 진 나선형 박테리아만 300 리보솜11했다. 이 정보 뿐만 아니라 각 유기 체 뿐만 아니라 종9의 성장 율을 예측에 유용 합니다.
또한, 새로운 유기 체;의 발견에 지도 하는 structome 분석 Parakaryon myojinensis 는 누구의 셀 구조 원핵생물과 진핵생물12,13,,1415의 그들 사이 중간 했다 일본의 해안 떨어져 깊은 바다에서 발견 되었다. 현재, 직렬 ultrathin 단면 기술 너무 어려운 마스터 오랜 시간이 걸릴 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서는 아무도 직렬 ultrathin 단면 어려움 없이 수행할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했습니다.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

셀 및 전송 전자 현미경 검사 법에서 고배율에서 3 차원 구성 요소 셀을 관찰 표본의 직렬 ultrathin 섹션을 준비 해야 합니다. 직렬 ultrathin 섹션 준비는 매우 어려운 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 오히려 쉬운 경우 적절 한 메서드를 사용 하입니다. 이 종이에 우리는 안전 하 게 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 방법의 핵심 포인트는: 1)는 시료의 큰 부분을 사용 하 여 견본 표면 및 칼 가장자리; 서로 평행 하 게 되도록 조정 하 2)을 그룹에서 직렬 섹션을 잘라내어 슬릿 격자;에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 3) '섹션 지주 루프'를 사용 하 여 섹션 그룹;의 순서를 혼합 하지 마십시오 4) 사용 하 여 '물 표면 높이 루프' 확인 섹션의 꼭대기에 위치 하는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자;에 원하는 위치에 배치 하려면 5) 사용 하 여 지원 영화는 알루미늄 선반에 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화;의 주름을 방지 하 그리고 6) 얼룩 튜브를 사용 하 여 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해. 이 새로운 메서드는 어려움 없이 직렬 ultrathin 섹션을 취득 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 3d, 집중 된 이온 빔 전자 현미경 검사 및 직렬 블록-얼굴 또는 자동 테이프 수집 ultramicrotome 메서드를 사용 하 여 얻을 수 없는 높은 해상도에서 미생물의 세포 구조를 분석 가능 하 게.

이 프로토콜에서는 3-슬릿 격자 직렬 섹션을 따기 위해 사용 되었다. 격자는 니켈 이나 구리의 만들어집니다. 직렬 섹션 중간 슬릿에 배치 됩니다. 양쪽에 슬릿 그리드와 그들을 따기 때 섹션을 볼 필요가 있습니다. 핀셋 (그림 11 d)으로 그들을 따기 때 격자를 직렬 섹션으로 병렬 계속 핸들 굽습니다 (그림 6 c, 오른쪽). 작은 핸들...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K 조회수.  Chiba University. 이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

연구

생화학

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

생체공학

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

신경과학

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

신경 과학에서 가장 섹션 샘플링의 공평한 접근

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

생물학

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...