著者は、ここで説明する方法の設定の間に彼らの入力についてジェローム ・ Larghero と Valérie Vanneaux (Hôpital サン ルイ, パリ, フランス) を感謝したいです。
この作品は、ANR からの補助金によって支えられた [GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02]、財団注ぐラ凝った Médicale [バイオ工学プログラム - DBS20140930777] LABEX オリビエ Goureau、クリステル Monville [ANR 10 LABX 73] を復活させるから。NeurATRIS、トランスレーショナルリサーチ インフラストラクチャ (Investissements d'Avenir) [ANR-11-INBS-0011] 神経科学、INGESTEM、国家インフラ (Investissements d'Avenir) biotherapies の多能性のエンジニア リングに支えられ、幹細胞分化 [ANR-11-INBS-000] クリステル Monville します。カリム ベン M'Barek は、DIM Stempole と LABEX 復活 [ANR 10 LABX 73] から奨学金によって支えられました。幹 Biotherapies 協会フランセーズ contre レ Myopathies (AFM) でサポートされているまれな疾患研究所の一部である-Téléthon。

このプロトコルで使用されるすべての人間材料は欧州連合の規則に従って使用され。本研究で使用される人間の ES 細胞株は、ユニークな胚から派生しました。胚を寄付した人カップルは完全に知らされた、匿名の寄付のための同意を与えた。臨床グレード ヒト ES 細胞株だったこの胚由来、バンク、修飾、および適切なロスリン細胞 (イギリス) によって記載されています。ハムは、病院ガイドライン (APHP、Hôpital セントルイス) に従って胎盤寄付のためのインフォームド コンセントを署名した母親の帝王無菌条件下で調達されました。
1. 培地や試薬の調製
<ol><li>
RPE 細胞培養培地の調製
	<ol>
<li>RPE 細胞培養培地を準備するには、4% 血清代替品 (500 mL の最終巻の 20 mL)、1,000 倍希釈 2-メルカプトエタノール (500 mL の最終巻の 500 μ L)、および 1 %eagle′s 最小値必要な媒体 (MEM) 非本質的なアミノ酸溶液 (5 mL に最終的なを追加します。500 mL の体積) ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 高グルコース (500 mL の最終巻の 475 mL) に。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
交通機関/保存媒体の作製
	<ol>
<li>輸送/保存媒体を準備するペニシリン-ストレプトマイシン (500 mL の最終巻の 5 mL) の 1% を CO2に追加-独立した媒体 (500 mL の最終巻、495 mL) 4 ° C で保管してください</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サーモライシン酵素の再懸濁
	<ol>
<li>サーモライシンのストック溶液の調製<ol>
<li>サーモライシンの貯蔵液の準備、雪解けの-20 ° C、常温で保存されていたサーモライシンの粉を実行します。</li>
			<li>酵素活性は、バッチからの変数をすることができる、使用するバッチのサーモライシン粉末で提供される分析の証明書に基づいてこの活動を計算します。分割、「活動中性プロテアーゼの計算 = ANPC」(分析証明書で示される) 181 (あるチロシンの分子量) によって。得られた結果は、指定したサーモライシン パウダー (U/バイアル) の総酵素活性に対応します。</li>
			<li>200 U/mL の原液を準備するには、200 (U/mL) で割った値総酵素活性 (U/バイアル) に対応する水の量を追加します。</li>
			<li>上下に追加された水をピペットで酵素を溶解します。渦 30 s とチェックのためのソリューション、粉末が完全に中断されてかどうか。詳細ピペッティングによる解散の必要があります。</li>
			<li>因数原液-20 ° C で保存</li>
		</ol>
</li>
		<li>サーモライシンの実用的なソリューションの準備 注: サーモライシン ソリューションは、ハムの治療の日に準備されなければなりません。<ol>
<li>-20 ° C で保存されている 200 U/ml サーモライシンのストックの因数を解凍します。1 U/mL の最終的な酵素活性を得るためにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で原液 200 x を希釈します。1-4 ハム パッチを治療するために 40 mL を準備します。</li>
			<li>使用前に、0.2 μ m フィルターを通してサーモライシン ソリューションをフィルター処理します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ゼラチンの巻き上げ
	<ol>
<li>20% ゼラチン液とブロックの準備 注: 20% ゼラチン液とブロックでを使用する前に 1 週間を準備することがあります。<ol>
<li>暖かい CO2-42 ° C (1 h) 最大で 30 分間湯せんする独立した媒体。50 mL のチューブで 40 mL にゼラチン 10 g ウォーム CO2を追加-独立した媒体と渦ソリューション。</li>
			<li>42 ° c. で 30-60 分のゼラチンを溶かす渦ソリューションを均質化する各 10 分。</li>
			<li>ソリューションが均一と、4 つの 6 cm の培養皿に 20% のゼラチン溶液 4 mL を追加します。泡を避けるため。料理を守るプラスチック パラフィン フィルムを追加し、4 ° C で凝固するソリューション</li>
		</ol>
</li>
		<li>8% ゼラチン溶液の調製 注: 8% ゼラチン溶液が準備使用前に、の日と 4 ° C で保存<ol>
<li>暖かい CO2-42 ° C (1 h) 最大 30 分まで独立した媒体。50 mL のチューブで 46 ml ゼラチン 4 g 暖めて CO2を追加-独立した媒体と渦ソリューション。</li>
			<li>42 ° c. で 30-60 分のゼラチンを溶かす管を保護し、同じ日に使用する場合は、37 ° C で水のお風呂でそれを維持するプラスチック パラフィン フィルムを追加または後で使用する場合、4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 人間の羊膜のサーモライシン治療
<ol><li>
ひと羊膜洗浄
	<ol>
<li>ハムの小さな断片 (約 30 mm × 30 mm) ナイロンの足場は、PBS で 4 ° C で既にいずれかの固定、または冷凍として供給があります。場合は 37 ° c 30 分のインキュベーターで膜を融解、凍結します。</li>
		<li>膜を洗浄します。<ol>
<li>80 mL の PBS を含む 250 mL ボトルに 1-4 膜を配置します。必要に応じてできるだけ多くのボトルを使用します。</li>
			<li>5 分間高速でプレート シェーカーの各ボトルを振るし、PBS を破棄します。80 mL の PBS の繰り返しを追加します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サーモライシン治療
	<ol>
<li>サーモライシン (1 U/mL) 膜を含むボトルあたりの作業液の 40 ミリリットルを追加 (ボトルあたり 1-4 膜では一度に最大 3 本)。</li>
		<li>5 分で 450 rpm と、渦のボトルを振る 30 を s. を繰り返して 1 倍。</li>
		<li>サーモライシン液を捨て、80 mL の PBS を追加します。</li>
		<li>450 rpm で 5 分間ボトルを振る。PBS を破棄し、80 mL の PBS を追加します。3 倍を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 文化挿入時の人間の羊膜の固定
<ol><li>ハムの 1 つずつを削除する (つまり、瓶の底に達することができる) 長い滅菌の鉗子を使用し、各ハムを 10 mL の PBS を含む 10 cm 培養皿に転送します。</li>
	<li>10 mL の PBS を含む新しい 10 cm 培養皿で下向きナイロン膜の 1 つを配置します。2 つのナイロン膜を修正するために使用する 4 つのクリップをデタッチします。</li>
	<li>ナイロンと膜間文化挿入の小さいリングを挿入します。</li>
	<li>膜が小さいリングを完全にカバーすることを確認します。膜の上に文化の挿入の 2 番目の部分をクリップします。ハムの基底膜は、文化挿入中直面しています。最後の 2 つのクリップを外します。</li>
	<li>必要に応じて文化挿入外膜の過剰滅菌はさみでカットします。PBS を追加 12 ウェル プレートに文化挿入固定膜鉗子を使用して、転送し、37 ° C、5% CO2でインキュベーターでプレートを格納します。</li>
	<li>その他の膜 (ステップ 3.2 から 3.5) からこれらの操作を繰り返します。</li>
</ol>4. 解凍と人間の羊膜の網膜色素上皮細胞の播種
<ol><li>
網膜色素上皮細胞の融解
	<ol>
<li>RPE 細胞バンクは、液体窒素の極低温バイアルあたり 100 万セルに固定されます。必要に応じてできるだけ多くセラム チューブを解凍 (350,000 の細胞は膜ごとシード)。</li>
		<li>極低温バイアルあたり RPE 培地 3 mL を含む 15 mL チューブを準備します。バイアルは解凍後、各チューブにセルを転送します。その他のバイアルに、この操作を繰り返します。</li>
		<li>均質化 (上下に数回をピペット RPE 培地で細胞を再懸濁します) 細胞液の 10 μ L を取るし、1.5 mL チューブに転送。トリパン ブルーの 10 μ L を追加します。カウント室でこのソリューションの場所 15 μ L は、4 X 目的と顕微鏡下で実行可能なセル (青色で着色) の数をカウントします。その他のバイアルに、この操作を繰り返します。</li>
		<li>一方で、110 x gで 5 分間破棄で 15 mL チューブに上清を遠心分離機し、700,000 細胞/ml で細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
人間の羊膜に網膜色素上皮細胞の播種
	<ol>
<li>インキュベーターから膜を含む 12 ウェル プレートを取り外します。</li>
		<li>PBS を吸い出しなさい。4.1.4 文化挿入部で準備した細胞懸濁液 500 μ L を追加します。(よく) 内文化挿入外 RPE 媒体の 1 mL を追加します。その他の膜を繰り返します。</li>
		<li>インキュベーター内膜を含む 12 ウェル プレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 人の羊膜の網膜色素上皮細胞培養のメンテナンス
<ol><li>更新中 2 週では、通常の月曜日と金曜日、まで、少なくとも x 文化の 30 日。</li>
	<li>各ウェルの文化挿入外媒体を吸引し、新鮮な媒体 (文化挿入外 1 mL と 500 μ L 中) を更新します。37 ° C、5% CO2でインキュベーターでプレートを配置します。</li>
</ol>6. 網膜色素上皮のパッチの移植のための準備
注: から始まる文化の 30 日、ティッシュは移植の準備ができて。
<ol><li>温かみのある 37 ° C で 30 分間の水のお風呂で 8% ゼラチン溶液チャンバー内部冷たい CO2と vibratome の-(4 ° C) で独立した媒体。</li>
	<li>
Vibratome に 20% のゼラチンのブロックを配置します。
	<ol>
<li>冷蔵庫から 20% のゼラチンのブロックを含む 6 cm 培養皿を取る。メスを使用すると、5 cm × 5 cm のブロックをカットします。シアノアクリ レート接着剤または同等のものをサポートするブロックの上面に貼り付けます。</li>
		<li>Vibratome に新しいブレードを配置します。</li>
		<li>かみそりの刃の同じレベルになるまでは、ブロックのレベルを調整します。</li>
		<li>サポートのまわりの浴室を詰めて新鮮な CO2-4 ° C で独立した媒体中程度の速度を使用してブロックを均一にカットまで、滑らかな表面につながる vibratome でブロックをカットします。0 の位置を設定します。</li>
		<li>それが完全に乾くまで、ゼラチンのブロックの周り中を吸引し、37 ° C の定温器からの組織を含む 12 ウェル培養プレート</li>
		<li>鉗子を使用して、慎重にゼラチンのブロックの上に文化挿入を開きます。(細胞が培養されないリング) の外部のセルを含まない膜のすべての部分をはさみでカットします。全体の残留培地を吸引します。</li>
		<li>37 ° C で膜をカバーするために 8% のゼラチン溶液の 1 mL を追加します。過剰に慎重に取り外します。5-8 分を固めるためのゼラチンを許可するを待ちます。</li>
		<li>新鮮な CO2を追加-膜が覆われるまでお風呂に (4 ° C) 培地で独立しました。</li>
		<li>ブロックの動作の認識の残り、中速度-100 μ m の位置にある vibratome でカットします。セクションの終わりには、組織の方向を維持するために気をつけてください。</li>
		<li>メス、セクションの方向を識別するためにコーナーをカットします。</li>
		<li>ヘラでゼラチンに埋め込まれた膜を収集し、受信者の目に移植まで 4 ° C で保存媒体でいっぱい 6 ウェル プレートに配置します。</li>
		<li>移植の時に、(1-3 のラット、ヒト以外の霊長類の約 10-15 mm2 ) 手術顕微鏡下で受信者の目のサイズにインプラントのサイズを調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li><li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa.">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li><li>Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. 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U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs.">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).</li><li>Capeans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+as+support+for+human+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cell+growth.">Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).</li><li>Ohno-Matsui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+amniotic+membrane+on+retinal+pigment+epithelial+cell+differentiation.">The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation.</a> Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).</li><li>Paolin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membranes+in+ophthalmology:+long+term+data+on+transplantation+outcomes.">Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer.">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+therapies+in+combination+with+substrate+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration.">Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Song, M. J., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+the+future:+Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+build+two+and+three+dimensional+ocular+tissue+for+cell+therapy+and+disease+modeling.">Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling.</a> Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).</li><li>Ramsden, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+retinal+regeneration:+Past,+present+and+future).">Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future).</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li><li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+the+RPE+in+AMD.">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives.">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li></ol>

オリビエ Goureau 保留中のひと多能性幹細胞からの網膜細胞の生成に関連する特許発明者は。他の作家が何を開示するあります。

生物学的足場とその動物モデルにおける着床に備えて網膜色素上皮細胞の培養方法について述べる。プロトコルの重要な手順の 1 つは、ゼラチンに包含まで手順に沿ってハム向きのメンテナンスです。確かに、膜のネイティブの上皮が削除され、その基底膜露出9になります。網膜色素上皮細胞は、この基底膜の上にシードする必要があります。ゼラチンを埋め込むため作成...

RPE は、生存と密接に関連付けられて1を光受容体の恒常性に不可欠です。その機能や生存、RP と AMD を含むいくつかの病理学の条件を変更します。
RP は、視細胞や網膜色素上皮細胞または両方2,3の機能に影響を与える継承のイネ突然変異のグループです。特に、網膜色素上皮に影響を与える突然変異細胞 RP2の 5% を占めていると推定されます。AMD は、リードの中心部に最終的に失明、網膜色素上皮層が変更される、別の条件です。AMD は、遺伝・環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされ、高齢者4,5,6に影響を与えます。予測によると、AMD は 1 億 9600 万患者 2020年7によって世界の懸念になります。これらの疾患の効果的な治療法が存在しないと死者/機能しない既存 RPE 細胞8を補うために新しい網膜色素上皮細胞の移植は、提案された戦略の一つ。
最高の機能的な結果を確保するために接木される最終製品の定式化のモードが欠かせません。配信、簡単でわかりやすい方法であるにもかかわらず、細胞懸濁液として注入された RPE 細胞の生存、統合、および機能9,10、11,12に関する懸念します。,13。 科学者は今より多くの開発を提供する複雑な製剤設計網膜組織9,13,14,,1516。この文脈では、体外で RPE 移植9使用できる組織を生成する独自の方式を開発しました。
人間の萌芽期の茎 (ES) の細胞由来網膜色素上皮細胞バンクは、このプロトコルで使用されます。ただし、代替 RPE 細胞ソース別のセル(人間誘導された多能性幹細胞、主な網膜色素上皮細胞等)から銀行と別の方法で区別されるこのプロトコルに適しています。分化が含まれているサイトカインおよび/または小さい分子17,18,19,20,21,22を使用してプロトコルします。
移植するのに設計された組織を足場に準備されるべき。過去数年間で異なる足場はポリマーまたは生物学的起源13,23,24行列に基づいて開発されました。生物基質の使用は、ハムが、裸のブルッフ膜のようなその他の基板を実装できます。記載方法は RPE のネイティブ環境に関連する生物学的足場を使用しての利点があります。
ヒト ES 細胞由来網膜色素上皮細胞は、石畳単層として完全に編成するためには、少なくとも 4 週間培養します。その段階で得られる上皮が機能と9を偏光します。最後に、この組織に容易にしわがよったようハイドロゲル キャリア注入のプロシージャの間にそれを保護するためにそれ以上の剛性と弾力性を与えるしの薄い層に埋め込まれています。この製品は、移植まで 4 ° C で保存されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile biosafety cabinet</td>
			<td>TechGen International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid waste disposal system for aspiration</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>BVC 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controlled +37&#160;&#176;C cell incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>BVC 21 NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#160;&#181;L pipette: P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#160;mL pipette: P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>75001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+4&#160;&#176;C refrigerator</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (x2)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555227F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant subaqua pro</td>
			<td>SUB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CP225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SC30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Rocking Shaker</td>
			<td>IKA-WERKE</td>
			<td>IKA MTS 214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LAB DANCER S40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.200 &#181;m single use syringe filter</td>
			<td>SARTORIUS</td>
			<td>16532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe without needle 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles 250mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>28024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture insert</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00001N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#160;mm cell culture disches: B6</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>121-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Castorama</td>
			<td>3178040670105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X (500&#160;mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5339880001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12618-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol (50&#160;mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>18045-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human amniotic membrane</td>
			<td>Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering transplantation-suitable retinal pigment epithelium tissue derived from human embryonic stem cells

目の病理学の条件をいくつかの機能および/または網膜色素上皮 (RPE) の生存に影響を与えます。網膜色素変性症 (RP) と加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のいくつかのフォームが含まれます。細胞療法はすでに人間の予備的な結果を奨励することで、これらの病気を治すために提案された最も有望な治療戦略の一つです。ただし、移植片の作製法では、その機能的帰結in vivoが大きな影響を与える。確かに、細胞懸濁液として接ぎ木した網膜色素上皮細胞は同じ細胞網膜組織として移植より機能の低いです。ここで、エンジニア RPE 組織および生体内注入の準備簡単で再現性のある方法をについて説明します。ひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞は、生物学的サポート、ひと羊膜 (ハム) にシードされます。このサポート人工足場と比較して、内在性の網膜色素上皮細胞が接続されている、ブルッフ膜の近くにある基底膜を持っていることの利点があります。しかし、その操作は簡単ではない、適切な養殖のいくつかの戦略とin vivoの移植のための準備を行った。

ハムには、網膜色素上皮細胞の播種する前に削除する必要があります上皮の層が含まれています。揺れ下サーモライシンと膜の酵素処理が実行されます。順番は (1 つの側面は上皮) 膜の極性を失う、それは組成物は、(図 1 a) プロバイダーによって異なる場合がありますサポートに固定されています。この段階でサポートする膜の密着性の確認、...

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Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K ビュー.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). 人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。

ビデオ: Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell replacement therapies. Terminally differentiated cell types could be used for the treatment of various degenerative diseases. In vitro differentiation of these cells towards tissues of the lung, liver and pancreas requires as a first step the generation of definitive endodermal cells. This step is rate-limiting for further differentiation towards terminally matured cell types such as insulin-producing beta cells, hepatocytes or other endoderm-derived cell types. Cells that are committed towards the endoderm lineage highly express a multitude of transcription factors such as FOXA2, SOX17, HNF1B, members of the GATA family, and the surface receptor CXCR4. However, differentiation protocols are rarely 100% efficient. Here, we describe a method for the purification of a CXCR4+ cell population after differentiation into the DE by using magnetic microbeads. This purification additionally removes cells of unwanted lineages. The gentle purification method is quick and reliable and might be used to improve downstream applications and differentiations.

Here, we describe a method for the purification of differentiated human embryonic stem cells that are committed towards the definitive endoderm for the improvement of downstream applications and further differentiations.

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for differentiating hiPSCs into cardiomyocytes (hiPSC-CMs), endothelial cells (hiPSC-ECs), and smooth muscle cells (SMCs) are often limited by low yield, purity, and/or poor phenotypic stability. Here, we present novel protocols for generating hiPSC-CMs, -ECs, and -SMCs that are substantially more efficient than conventional methods, as well as a method for combining cell injection with a cytokine-containing patch created over the site of administration. The patch improves both the retention of the injected cells, by sealing the needle track to prevent the cells from being squeezed out of the myocardium, and cell survival, by releasing insulin-like growth factor (IGF) over an extended period. In a swine model of myocardial ischemia-reperfusion injury, the rate of engraftment was more than two-fold greater when the cells were administered with the cytokine-containing patch comparing to the cells without patch, and treatment with both the cells and the patch, but not with the cells alone, was associated with significant improvements in cardiac function and infarct size.

We present three novel and more efficient protocols for differentiating human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells and a delivery method that improves the engraftment of transplanted cells by combining cell injection with patch-mediated cytokine delivery.

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

要約

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胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

要約

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胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング