我々 は工学・物理科学研究会議 (EPSRC, イギリス) 学際的共同研究グラント EP/K03197X/1 保健と健康イノベーション チャレンジ基金 (HICF) を通じて Wellcome の信頼を感謝したいです。.資金調達の参照番号: 0510-069。

インフォームド コンセント後すべてのひと肺組織を得、地域の倫理委員会で承認された研究。
1. 生物学的試料の調製
<ol><li>
プローブの準備
	<ol>
<li>各プローブの 1 mM 在庫ソリューションを構成する (例えば、カルセイン AM, UBI 3, 10 月 UBIなど) 滅菌 dH2O、化合物11をプローブ、凍結乾燥重量を量ることの微妙なバランスを使用します。DH2O を追加する量が重量を量られた質量と分子プローブの重量に基づいて計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細菌文化の準備 注: このメソッドの黄色ブドウ球菌は模範ひずみとして使用されました。任意の適切な菌株を選択できます。適切な励起と発光スペクトルを持つ細菌をラベル任意の商業染料は、細菌を積極的にラベルを選択できます。<ol>
<li>滅菌ループを使って新鮮なホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレートから単一コロニー希望菌株を選択します。文化メディアにループの終わりを浸すことによってポンドの 10 mL の 50 mL の遠心管中に植民地を接種します。37 ° C で 16 時間 250 rpm で孵化させなさい (または夜通し)。</li>
		<li>900 μ L 1 mL キュベットの LB に一晩かけて培養の 100 μ L を追加することによって一晩文化の OD595を決定します。595 で外径を測定分光光度計で nm (1 ml の LB キュベットを空白として使用)。得られた OD を一晩かけて培養の OD を取得する 10 に乗算します。</li>
		<li>一晩文化のサブカルチャー。595 の光学濃度を調整することによってこれを行う nm (外径595) 新鮮なポンドの 10 の 0.1 mL を 10 mL に追加する一晩かけて培養の必要量を計算 0.1 OD595を調整する新鮮なポンド。37 ° c, 250 rpm、文化まで中間ログ相 (外径595 0.6 - 0.8)、文化を孵化させなさい約 4 時間。</li>
		<li>文化の光密度 (ステップ 1.2.2) と 1 x 10 の収穫8コロニー 1.5 mL マイクロ チューブ (例えば、細菌文化が OD595 場合に単位 (CFU) (外径595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) 細菌文化を形成測定します。0.6、収集 1.67 mL)。文化常温細菌を餌に 1 分間、10,000 × g で遠心分離機します。リン酸で二度ペレット洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) 再 (ピペッティング上下に慎重に) によって、1 mL の PBS は、上記のように遠心、上清を廃棄、繰り返しペレット。上清を取り外すとき細菌のペレットが外れないように注意してください。1 mL の PBS に最終的なペレットを再懸濁します。 注: は、表示プロシージャごとに必要に応じて多くのサンプルを準備します。1.2.5.1、1.2.5.2、または 1.2.5.3 ステップが続く 1 h までのプロトコルがここで一時停止可能性が。</li>
		<li>細菌染色<ol>
<li>カルセイン AM と細菌をラベル付け、洗浄培養に 1 μ M の最終的な集中に染料を追加します。文化 300 rpm で振とうしながら 37 ° C で 30 分間インキュベートします。ステップ余分な染料を取り除く 1.2.4 のように遠心沈降法による PBS 3 回で counterstained の細菌懸濁液を洗浄します。1 mL の PBS に再懸濁します、100 μ L 外径595 0.5 カルセイン午前を 200 μ l 添加染色細菌を取得する PBS で 1:1 の希釈します。プロトコルは、1 h までここで停止可能性があります。</li>
			<li>ラベル テスト プローブ (例えばUBI 3 か UBI 10)、細菌培養 OD595 0.5 で 200 μ L PBS を取得する PBS で 1:1 の 100 μ L を希釈します。細菌とプローブの徹底的な混合を確実にしたマイクロ チューブを数回反転を最終濃度 10 μ M のプローブのいずれかを追加します。 注: イメージングは臨床シナリオを模倣するプローブの添加後すぐに実行する必要があります。</li>
			<li>コントロールを準備するには、文化無染色の 200 μ L を取得する PBS で 1:1 の希釈 100 μ、無染色細菌サンプルは595 0.5 サンプルを OD します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ひと肺組織体外の準備 注: ひと肺組織のサンプルは、肺癌に対する外科的切除を受けた患者から得られました。イメージング用すべての組織は、癌の成長から正常肺組織のサンプルから得られました。サンプルは、オペレーティング劇場から新鮮な撮影され、使用するまで-80 ° c チューブ ・遠心分離チューブに格納されています。<ol>
<li>イメージング、直前にドライアイス冷凍庫からひと肺組織のサンプルを削除します。常温で組織に少し; 解凍を許可します。1 x 4 mm2セクションにメスをスライスするだけ。 注: 融解のレベルは重要です。冷凍も解凍も組織がなく、チッピングなしスライスし、組織は柔らかすぎてスライスします。</li>
		<li>鉗子を使用すると、96 ウェル クリア フラット下部組織培養プレートのウェルにスライスしたひと肺組織を配置します。ドライアイス-80 ° C のフリーザーに戻る輸送のための任意の未使用のひと肺組織をストレージ コンテナーと場所にすぐに戻る。</li>
		<li>100 μ L の PBS をピペットでそれぞれの肺組織のサンプルに追加します。すべての組織は、PBS で覆われている (そして井戸の壁にこだわっていない) ようにピペット チップを使用します。組織がわずかに膨らむし、浮くことがあります。サンプル ソリューションに組織から濾すこと血を許可するように数分間に PBS を残します。できるだけ PBS の多くを削除します。組織は、ピペットの先端の端をブロック可能性があります。これを防ぐためにプレート/チップ配置の角度をみてください。</li>
		<li>無染色の 100 μ L をピペット、カルセインだというラベルの付いた、またはテスト プローブ標識も含む各肺組織に細菌。また肺組織と 100 μ L の PBS を使用してコントロールを設定します。これらのコントロールの井戸には、細菌なしプローブ蛍光バック グラウンドやプローブの非特異的活性化の増加を測定する肺組織だけで追加できます。肺組織と PBS 井戸も含まれる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FCFM CLE デバイスとイメージング
<ol><li>
CLE デバイスをセットアップします。 注: CLE システム 20 分ウォーム アップ レーザーを許可するように校正前に、の準備します。<ol>
<li>システムのトランスの背面に on/off スイッチを押すし、指定したコンピューターをオンに。レーザースキャニング ユニット (LSU) の前面のオン/オフ ボタンを押します。ユニットがオンになっていることを示す緑のライトの外観を確認します。</li>
		<li>CLE ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。ログイン情報を入力し、(10-30 s) の初期化に LSU を待ちます。</li>
		<li>繊維をイメージング新しい FCFM の使用は、付属 CD のインストールが必要です。インストール CD をコンピューターの CD ドライブに挿入し、画面の指示に従ってください。</li>
		<li>繊維クリーナー FCFM イメージング光ファイバー コネクタ ユニットをクリーンアップします。前進ほこり/汚れのクリーニング リボン コネクタをこする。LSU の前面から保護の黄色のキャップを取り外します。</li>
		<li>LSU のハブを準備するには、ゆっくり止まるまで反時計回り銀ハブを回転します。上向きコネクタの平らな面と、FCFM イメージング ファイバー コネクタをハブに挿入します。場所で繊維を押し、それを 2 回クリックするまで時計回りに銀ハブを回します。さらに 45 ° 銀のハブを時計回りに回転させることで接続が完了します。 注: 繊維が認識されない場合、イメージングファイバー FCFM をインストールされており、正しい向きで接続されていることを確認します。</li>
		<li>ポップアップ イメージング繊維校正 FCFM を完了するための指示に従います。3 つのステップがある: (1) FCFM イメージング繊維試験 (ステップ 2.1.7 - 2.1.8)、背景 (2) 買収 (2.1.9 ステップ)、(3) 光ファイバー検出 (ステップ 2.1.10)。</li>
		<li>画面の '開始レーザー' ボタンを押します。レーザーが中心します。</li>
		<li>新鮮なバイアルを選択 (黄色: キャリブレーション; 赤: きれい; 青: リンス) キャリブレーションからキットし、画面の指示に従って: 黄色のバイアルに繊維をイメージング FCFM の遠位端に配置し、モニターの蛍光性の増加のため見る場所、(攪拌) なし赤のバイアルにファイバー先端。(下図のコンピューターのモニター上に) 消える蛍光を待ちます。最終的にブルーの瓶で先端を洗浄します。 注: 蛍光が消えていない場合 8% H2O2とレンズ クリーニング組織 FCFM イメージング繊維をきれいし、再開します。満足のいく結果が得られるまで手順を繰り返します (イメージの品質が明確で、明白な汚れからマークがない)。</li>
		<li>青い瓶に繊維をイメージング FCFM を配置します。プレス 'スタート レーザー' '計算' オプションになったらこれが続きます。</li>
		<li>黄色のバイアルに繊維をイメージング FCFM を配置します。プレス 'スタート レーザー' '計算' オプションになったらこれが続きます。</li>
		<li>自動校正時の赤のバイアルに置くことによって繊維をイメージング FCFM の遠位端をきれい > 10 の青のバイアルに続いて s > 4 s、ソフトウェアによって示される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CLE でデータの収集
	<ol>
<li>セットアップ後、保存場所とファイルのプレフィックスを選択するウィンドウが開きます。データ ストレージの目的のフォルダーを選択、それに応じてプレフィックスの名前します。</li>
		<li>フットペダルを置き、オペレーターが簡単にアクセスすることができます。左のペダル: レーザーがオン/オフ。センター ペダル: 一時停止;右のペダル: 録画/停止します。 注: レーザー コントロールは、画面上のコントロールからもアクセスできます。</li>
		<li>画面上の「スタート」をクリックか、レーザーをオンに左の足ペダルを押します。これは集録を開始し、100% のレーザー出力と 12 フレーム/秒 (デフォルト設定) のフレーム レートを使用して画像を得る。 注: 他のアプリケーションの画面サンプルの種類に応じて、必要な場合にこれらの設定を変更できます。</li>
		<li>それぞれの細菌懸濁液サンプル画像します。<ol>
<li>FCFM イメージングファイバーの遠位端を挿入し、サンプルを尋問する懸濁液を通してゆっくりと繊維を移動します。</li>
			<li>任意の長さの動画を記録 (10 分程度)、右足ペダルを押すか繊維がサンプルをゆっくり移動、画面上のレコード コントロールを選択します。</li>
			<li>8% H2O2とレンズのサンプル間の組織を洗浄 FCFM イメージングファイバーの遠位端をきれいに。 注: 10 30 s の典型的なビデオ長さの in vitroイメージング十分です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>肺組織のサンプルのそれぞれをイメージします。<ol>
<li>サンプルに光・ イメージングは、ファイバーの末端と組織の間の直接の接触が行われることを確保する FCFM の遠位端を挿入します。ゆっくりサンプルを尋問する周りイメージングファイバーの末尾を移動します。 注: 組織から繊維の端を持ち上げた焦点平面から組織が削除されます。ただし、これを使用して、組織に満たされていないラベルの付いた細菌の画像があります。</li>
			<li>任意の長さの動画を記録 (10 分程度)、右足ペダルを押すか繊維がサンプルをゆっくり移動、画面上のレコード コントロールを選択します。 注: 通常、ビデオの長さ 30 s が組織にex vivoイメージングのために十分。</li>
			<li>レンズの組織と 8% H2O2サンプル間のクリーニングできれいに FCFM イメージングファイバーの遠位端。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
システムをオフにします。
	<ol>
<li>レーザーをオフにして、左足のペダルを押すかをクリックして、画面に表示されるボタンをクリックします。</li>
		<li>CLE デバイスから銀の LSU ハブを反時計回り止まるまで回して FCFM イメージング繊維を外します。LSU のハブから、LSU から光ファイバー コネクタを注意深く引いてイメージングファイバー FCFM を削除します。</li>
		<li>きれいにし 8% H2O2とレンズ クリーニング組織 FCFM イメージング ファイバーを消毒します。FCFM イメージングファイバーの近位端と LSU ユニットの前面に保護キャップを戻ります。ストレージ ボックスに繊維をそっと置きます。</li>
		<li>すぐデータ キャプチャ ソフトウェアと外付けの USB デバイスに保存されているファイルをコピーします。コンピューターをシャット ダウンし、3 のフロント パネル I/O を押して LSU デバイスをオフに緑色の光が消えるまで s。</li>
		<li>ひと肺組織や地域の規制によると細菌の処分します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>ソフトウェアを開き、ソフトウェア ダッシュ ボード上の 'に行く' アイコンをコンピューター上の適切なディレクトリを選択して分析用のファイルをインポートします。または、ファイルをドラッグして、ソフトウェアのダッシュ ボードにドロップすることができます。</li>
	<li>それらを開いて各ビデオ ファイルをダブルクリックします。動画が自動的に最適化されたカラー ルックアップ テーブル (LUT) の再生し、カラー テーブルを調整します。自動の強度強度スケール バー上の杖ボタンをクリックして、拡大/縮小を無効にします。ボタンの周囲に黒い影が無い場合、この機能は無効です。 注: は自動輝度のスケールを比較して同じデータ セットからのビデオを分析することは不可能、各ビデオを通して継続的なコントラスト強調を防ぐために無効にしなければなりません。</li>
	<li>最高のコントラストを与えるに最小値と最大のバーを移動することによってスケーリング目的の強度を選択します。広いダイナミック レンジを確保するためスケーリング強度の選択がキャプチャされるヒストグラム ツールを使用します。 メモ: ダイナミック レンジが画像が飽和していないようにことを確認 (つまり彩度を示す、イメージの白い領域を制限する)、低強度機能が逃されないように。</li>
	<li>目的の拡大/縮小が達成される「デフォルト (緑)」として記載されているドロップ ダウン メニューのボタン上で右しますクリック。LUT を保存するオプションを選択します。LUT を目的の場所に保存します。</li>
	<li>お互いにデータ セット内でビデオ、「デフォルト (緑)」ドロップ ダウン メニューをクリック右し同じ LUT を適用し、' 負荷 LUT' を選択します。一貫した強度、データセット内のすべてのビデオにスケーリングを適用する適切なファイルを選択します。</li>
	<li>加工動画をエクスポートするには、'映画リール' ボタンをクリックします。適切なビデオ形式、例えば「プレゼンテーション用」、を選択する .mpg ファイルが生成されます。'エクスポート' を押し、ビデオのファイルを保存するファイルの場所を選択します。'カメラ' ボタンをクリックして、単一のフレームのスナップショットをエクスポートできます。.Jpg、.bmp、.png ファイルを保存することが可能です。ファイルのデスティネーションを選択し、保存を押します。 注: ビデオは、プレゼンテーションやさらに定量化の準備のための任意のソフトウェアに、インポートできます。ラベル付けされた細菌は、ビデオで緑の '' が点滅ドットとして視覚化されます。肺ティッシュの構造は黒表示肺胞腔と順序付けられた蛍光ストランドとして明らかになります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: <a target="_blank" href="https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf">https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf</a> (2016)</li><li>Caliendo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Tests,+Better+Care:+Improved+Diagnostics+for+Infectious+Diseases.">Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases.</a> Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).</li><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point+of+care+diagnostic+tests+for+viral+and+bacterial+respiratory+tract+infections-needs,+advances,+and+future+prospects.">Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects.</a> Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).</li><li>Neumann, H., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Yamada's Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).</li><li>Chauhan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy.">Confocal laser endomicroscopy.</a> Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).</li><li>Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+in+endoscopy:+endomicroscopy+and+endocytoscopy.">Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+non-invasive+head+and+neck+cancer+imaging:+A+comprehensive+review.">Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review.</a> Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).</li><li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vivo+fluorescence+microimaging+of+the+alveolar+ducts+and+sacs+during+bronchoscopy.">Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy.</a> Eur Respir J. 33, (2009).</li><li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+endomicroscopy+of+the+human+airways.">Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways.</a> Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).</li><li>Akram, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+labelled-ubiquicidin+antimicrobial+peptide+for+immediate+in+situ+optical+detection+of+live+bacteria+in+human+alveolar+lung+tissue.">A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue.</a> Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).</li><li>Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+ecology+of+the+lung:+new+conceptual+models+of+pulmonary+microbiology+and+pneumonia+pathogenesis.">Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis.</a> Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).</li><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Magiorakos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+carbapenem+resistance+in+Europe:+just+the+tip+of+the+iceberg.">The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).</li><li>Chastre, J., Fagon, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator-associated+Pneumonia.">Ventilator-associated Pneumonia.</a> Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).</li><li>Krstaji&#263;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+widefield+fluorescence+microendoscopy+enables+multiplexed+molecular+imaging+in+the+alveolar+space+of+human+lung+tissue.">Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue.</a> J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).</li></ol>

KD: エジンバラの分子イメージングの創設者ディレクター。マウナ ・ ケアの技術アドバイザーから受信したコンサルティング。
MB: エジンバラの分子イメージングの創設者ディレクター。

2 番目のアカウントの下気道感染症病の最も高い負担グローバル12,13, と実質的な上昇数抗菌耐性菌に起因する感染症のされている報告されている14。肺炎入院の一般的な原因のまま。、ICU で肺炎の開発は診断の不確実性は悪化し、非常に高い死亡率率15に関連付けられています。肺炎の発症中に遠位部の肺健康で最小の微生物叢によって比較的生殖不能である領域の肺胞腔内細菌に増殖します。
このメソッドは、の細菌特異光学イメージング プローブ11, しかし、デザイン、合成、検証前のヴィヴォ比較的遅い段階をについて説明し、この検証手順を開始する前にプローブの評価は前に示した11 として不可欠.
CLE は病気を照会するための新たな臨床技術はその場でリアルタイムで状態です。生検と洗浄液のコレクションがありますが疑われる呼吸器の病理学の調査のための従来の手法に比べて多くの利点を提供しています。生検は侵襲的な換気された患者の罹患率と死亡率を引き起こす可能性が、収集された洗浄液はしばしば上気道から菌で汚染されました。肺炎の検出でクレの使用は多少互換性のあるイメージングの貧しい空室状況による限定プローブ多くの努力10にもかかわらず、病気の機能情報を提供する場合があります。肺炎の迅速診断の見通しを提供 CLE を組み合わせて光のエージェントと侵襲的現在の標準的な方法に比べています。
このプロトコルへの重要なステップは、試料調製と CLE プラットフォームのセットアップです。最終的な臨床応用に関連する人間の組織を得ることも重要、この研究で示されているように、ひと肺組織などです。組織の自家蛍光の程度大きな種間変動イメージング対象細菌プローブの感度を欺くことができるため、人間の組織を使用する必要があります。さらに、検索およびひと肺組織の使用のための倫理を得ることは不可欠であります。技術的なレベルでは、正しい清掃イメージングの LSU のプラットフォーム、およびキャリブレーションにイメージングの繊維の添付ファイルは相当数の細菌が肺組織検体に追加されますを確保するが、良好な解像度と一貫性のあるイメージのため不可欠です。プローブのパネルをスクリーニング法の有用性をさらに拡大、病原体、病原性肺炎の可能性が高いものなどの範囲を指定してプロシージャを繰り返しが必要です。
この技法の最大の制限は、臨床的に承認された CLE デバイスが 1 つだけのレーザーを持っていることは (488 nm)。したがって、現在、蛍光プローブ設計のための選択がこのシステムで使用するため限られた臨床的に単色の励起波長 660 nm の近赤外域に存在するデバイスを承認します。それは非常に望ましい組織の自家蛍光のレベルを細菌プローブの感度を改善するためにスペクトルの異なる蛍光体を開発するプローブを有効に同じデバイス内に実装 2 番目のレーザー ラインを持っています。デュアル カラー CLE デバイス開発中ながら、ない臨床的に承認されたかおよび/または彼らの費用が重要な16。
CLE体外病原細菌と人間の肺の組織前のヴィヴォ画面潜在的なプローブを用いたフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕微鏡など従来の in vitro技術と臨床的有用性間のギャップします。この手順を提供しています自信を持って臨床 CLE と結合されるへの繰越に有望な化合物を選択するとき画像;かどうかテスト プローブ ターゲット特異性を維持または組織に直接バインドなどの任意のオフのターゲット ラベル、説明またはホストと不安定性の蛋白分解酵素を示していますを示唆を提供します。また、ひと肺組織プラス プローブ バインディングとリアルタイムでアクティベーションの速度を完全に特徴づける細菌のサンプルを直接アクティブ化可能なプローブの追加に関連するでしょう。
急速に患者の遠位部の肺内イメージングの可能性を評価するために新規の細菌特異プローブをスクリーニングするためのパイプラインは診療所にはるかに高速の翻訳であることと考えています。これは主な理由はその微少量を意味、気管支鏡の操作チャンネルを挿入したカテーテルを介して肺内細菌特異プローブをローカル配信でした (< 100 μ g) 量を配信でした。したがって、全身の配信および化合物の体内のない状態、他の多くの感染先体内で、または核の場合と同様。また、毒性のリスクが軽減されますこのような少量のイメージング用プローブを提供する関連する合併症 (ただし、毒性スクリーニングは、翻訳に必要となる)。次のプローブの注入しカテーテルを FCFM 繊維と我々 はこのメソッド内で実行したのとほぼ同じ方法でクレ、尋問肺の同じ領域で置き換えることができます。イメージングは、プローブは検出できない濃度に洗い流す前に、プローブのインストール以降急速に実行してください。
それは疾患を特定するのには, 受診を注意してもこの手法を用いたプローブ細菌イメージング エージェントに限定されるべきではないが、炎症などの代替ターゲット プローブの検証に広げることも。このアプローチは、FCFM を介してイメージングは許容体内で他疾患の場所に適応可能である必要があります。

この手法は、CLE FCFM を用いた可視化のための潜在的な臨床的有用性化合物の迅速同定による前のヴィヴォひと肺組織内の細菌特異光学イメージング エージェントを評価するための迅速なスクリーニング プロセスをについて説明します遠位部の肺原内細菌。
上昇の抗菌薬耐性1の時代の抗菌薬処方を配給する世界的な急務があります。このため、高い特異性、感度とリアルタイムで細菌感染を識別するその行為が高度診断法の開発は、2を求めた。集中治療室 (Icu)、内などの批判的気分が優れない患者における肺炎の診断を確認する現在の技術は、多くの場合からの細菌培養の技術と一緒に非特異的臨床または放射線機能の解釈に基づいてください。吸気流体/組織、結果を生成するまで 3 日を取ることができます。さらに、培養液から遠位部の肺し、取得より近位気道3から汚染しやすいです併用抗菌療法または貧しいサンプリング技術による否定的な文化は、しばしば。また、ポリメラーゼ連鎖反応などの分子生物学の手法が過度に敏感な患者の過剰を危険にさらす、吸気流体で使用した場合です。新たな診断アプローチは分子光イメージング、作ってその場で分子病理組織の可能性;ただし、開発および光学イメージング化合物の検証は必要です。それにもかかわらず、細菌のアクティブ化可能な光プローブ経由で直接可視化は潜在的存在の研究を許可する非常に強力なメソッド、肺炎の進化、患者と重要なは、使用できるホスト病原体の相互作用を研究するにはリアルタイムで治療への応答in-situ 。
CLE は複数疾患4など、消化器5腫瘍6、7、および気道や肺胞8,を照会するためのフィールド内の確立された調査手順9. 病理組織イメージング臨床内視鏡のチャンネルを通過するバンドル ファイバーを用いたポイント ・ オブ ・ ケア構造イメージングが可能になり、フォーム直接共焦点顕微鏡によるイメージングする組織表面との接触。しかし、残る 1 つの制限はジェネリック造影剤の必要性です。したがって、病特定プローブは、特定の細菌剤などの使用が疑われる感染部位での細菌の直接可視化によるこの療法の有用性が大幅に拡張。光エージェントは、リアルタイム、高解像度イメージング診断可能性を有効にする他の技術に比べて多くの利点を提供しています。さらに、光学プローブは、複数のターゲットは、比較的低コストですべて達成を尋問のための多重見通しを提供しています。光エージェントの数は、しかしどれもまだ正常に内に実装されてクリニック10そのような目的のための開発中です。細菌に対する特異性小分子プローブのライブラリを合成し、細菌性肺炎その場で11を検出するためのプローブ関数の評価のための迅速で有効なパイプラインを開発しました。
適切なプローブ候補者を識別するために次の前提条件が FCFM によるひと肺組織体外のプローブの尋問前に満たさなければならなかった: i) 水溶解度、ii) 特異性と臨床的に急速にラベルの選択性関連する細菌, iii) 高い信号対雑音比と iv) 肺環境内で劣化への耐性。後者評価された気管支肺胞洗浄液 (BALF) で急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、患者は ICU における肺プロテアーゼおよび炎症性環境によって特徴付けられる条件であります。また、プローブはひと肺肺胞組織内で臨床的に承認された光 CLE イメージング デバイスによる検出のための適切な蛍光体を持っていた。
これらの前提条件のそれぞれを尋問するパイプラインは次のように (各段階で渡されるプローブだけに運ばれた前方次): (1) 調査するプローブのライブラリが合成されました。(2) 各プローブは、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) 細菌の分類; ように、生きている細菌のパネルに追加されました。(CLSM; 3) 主のひと好中球と共培養哺乳類セル以上細菌分類の選択性を設立(4) 安定性および ARDS 患者 BALF の存在下で細菌の分類の成功は CLSM、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間飛行 (MALDI-TOF) 質量分析計のによって決定されました。(候補者の 5) 最適な濃度を選択性を確保するため哺乳類細胞に細菌を維持; CLSM で測定しました。(懸濁液の FCFM によって 6) 候補者をイメージしました、信号対雑音だった検出のため十分な安定性とを確保する前のヴィヴォひと肺肺胞組織に。手順 6 がこのプロトコルの中で詳しく説明します。手順 1-5 のための方法論は、以前に報告した11をされています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1233px;" width="1233">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">1-14 Microfuge</td>
			<td style="width:263px;">SciQuip</td>
			<td style="width:119px;">90616</td>
			<td style="width:545px;">Small benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">96-well plate</td>
			<td style="width:263px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td style="width:545px;">Assay plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>17783&#160;</td>
			<td style="width:545px;">Commercial fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Cellvizio 488 nm Research CLE</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC-0001-488</td>
			<td style="width:545px;">Confocal laser endomicroscopy device</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Cletop-S</td>
			<td style="width:263px;">Cletop</td>
			<td style="width:119px;">14110601</td>
			<td style="width:545px;">Fibre cleaner</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Eppendorf (1.5 mL)</td>
			<td style="width:263px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30120086</td>
			<td style="width:545px;">1.5 mL microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Eppendorf Research Plus Pipettes</td>
			<td style="width:263px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11568663</td>
			<td style="width:545px;">Micro pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Falcon tube (50 mL)</td>
			<td style="width:263px;">Scientific Lab Supplies</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:545px;">50 ml centrifugation tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Gibco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:545px;">PBS - wash media</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:307px;">IC-Viewer</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LW-0001</td>
			<td style="width:545px;">Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Incu-Shake midi</td>
			<td style="width:263px;">Sciquip</td>
			<td style="width:119px;">SQ-4020</td>
			<td style="width:545px;">Floor standing shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysogeny Broth&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich (Miller)</td>
			<td>L3522</td>
			<td style="width:545px;">LB Growth media for S. aureus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">non-standard research AlveoFlex 488 nm</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MP-0002-AF3</td>
			<td style="width:545px;">Fibred confocal fluorescence microscopy fibre</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Quanti Kit 488 nm</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LQ-0005</td>
			<td style="width:545px;">Calibration kit for the CellVizio 488 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">S. aureus ATCC 25923</td>
			<td style="width:263px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">25923</td>
			<td style="width:545px;">Bacterial strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Semi-micro spectrophotometry cuvette</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C5416-100EA</td>
			<td style="width:545px;">For spectrophotometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Thermomixer comfort</td>
			<td style="width:263px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">41102422</td>
			<td style="width:545px;">Benchtop heater with shaking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">UV 1101 Biotech photometer</td>
			<td style="width:263px;">Biochrom WPA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:545px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical screening of novel bacteria-specific probes on ex vivo human lung tissue by confocal laser endomicroscopy

スピードと細菌検出の精度向上は患者成層と抗菌薬の適切な使用を確保するため重要であります。細菌の存在を認識する診断技術の開発は、この目標を達成するためにポイント ・ オブ ・ ケアでリアルタイムが必要です。ホスト内での細菌の直接同定用光イメージング技術は、魅力的な方法です。化学プローブの設計と検証の複数の試みはしかしどれもまだ正常に翻訳されているクリニック検討されてきた。ここで前のヴィヴォ細菌特異プローブ繊維共焦点蛍光顕微鏡 (FCFM) を用いた遠位部の肺内の細菌の同定のための検証手法について述べる。私たちのモデルは、ひと肺組織前のヴィヴォと画面小説細菌固有の密接に患者と遭遇する期待される撮像条件を模倣した化合物をイメージングする臨床的に承認された共焦点レーザー endomicroscopy (CLE) プラットフォームを使用しました。したがって、この手法により化合物をスクリーニングの潜在的な臨床少ない自信を提供します。

本研究では臨床的に承認された CLE デバイスを用いた感染症のひと歯槽肺体外組織モデルにおける新規細菌特異プローブの急速なスクリーニングのための方法を説明してきました。
FCFM でクレは、(エラスチンとコラーゲンの高い豊富) のためにこの地域は自然に高い蛍光 488 nm レーザー8が興奮すると遠位部の肺内構造の情報を得るに適して。逆に、肺胞腔が発するない、組織構造とするエアスペースの間により高コントラストが (図 1) を視覚化するよう。
疾患の関連のプローブまたは細菌特異プローブなどの造影剤をリアルタイムで取得する病気プロセスの機能について有効にします。合成については以前、細菌固有のライブラリの初期の in vitroスクリーニング プローブ11;ここで細菌特異性蛋白の安定性、および時間の経過とともに細菌の膜の内で保持が決定されました。有望な細菌特異プローブ (UBI-10) は、細菌の細胞膜 (UBI 3) 内で貧しい人々 の保持を示したものと同様、研究では、内で識別されました。これらは、黄色ブドウ球菌をラベルに使用した商業 counterstaining (カルセイン AM) の制御と比較されました。
無染色、カルセイン AM、UBI-3、および UBI 10黄色ブドウ球菌をラベル撮像した懸濁液の FCFM で 100 %488 nm レーザーの出力と 12 フレーム/秒 (図 2) のフレーム レート。ここで PBS でラベルのない細菌をイメージしました、蛍光シグナルは検出できなかった。これは、ラベル付けされた細菌がイメージされたとは対照的です。ソリューションの一般的なバック グラウンド蛍光 PBS 唯一コントロールに比べて上昇、NBD (プローブ fluorophore) は排出量が少ないのでこれは明らかだった UBI 3 や UBI 10 細菌懸濁液を FCFM でイメージしました、どこ蛍光信号水溶液、しかし、明るい点状ドット、洗浄ステップを必要とせず、ソリューション全体ではっきりと見える。これは極地環境で NDB から発生した蛍光シグナルの増加により、すなわち、細菌の膜です。カルセイン AM はアクティブ化可能なプローブではないので細菌染色後の洗浄ステップ ソリューション内で自由なプローブの高い蛍光背景を削除する必要があります。UBI 3 と UBI 10 のようなラベルの付いた細菌、カルセイン AM の付いた細菌は、明るい緑色の点状ドットとして、FCFM によってソリューションで検出されました。ビデオの形式でデータを収集している '輝き' コア間、フォーカス、このメソッドによって画像のラベル付けされた細菌の特徴の入出庫を移動するこれらのドットが表示されます。
ラベルの付いた細菌その後ex vivoひと肺組織の小さなスライスに追加され FCFM (図 3) でもう一度イメージ化します。ここでだけ PBS またはラベルのない黄色ブドウ球菌は、肺組織に追加された、(コラーゲンとエラスチンの明るい緑の鎖と肺胞腔内の暗い部分を見て) 肺組織される構造だけが検出されました。これらの制御条件の点状のドットが見つかりませんでした。同様に、唯一肺組織構造 (およびない点状ドット) は黄色ブドウ球菌と UBI-3; 肺組織状態の可視化しました。このプローブが安定に保持されませんでしたを示す細菌細胞膜すなわち、それはおよび/または (として以前に実証11) 肺組織内のネイティブの蛋白分解酵素の存在下では劣化が洗い流されました。
しかし、明るい点状ドットは両方のカルセイン AM ポジティブ コントロール黄色ブドウ球菌のサンプルでは、ラベルの付いた、最も有望な細菌特異プローブ (UBI-10)黄色ブドウ球菌のサンプル表示されていた。'きらきら' ドットは、強力な組織の自家蛍光 (図 3) にもかかわらず表示されていた。したがって、FCFM によって得られた結果は、共焦点レーザー顕微鏡による細菌特異プローブのパネルの生体外で事前審査にご同意いた、リアルタイムで感染症のイメージングのための臨床的に関連する検出方法を示した。
ここで示された結果は、その独特の蛍光による FCFM によるイメージングのための適切な臓器である肺をデモンストレーションします。明るい特徴的な構造により、肺胞腔内と確認する CLE オペレーターです。暗い肺胞の空気と相まって、これらの地域は、コントラストの高い蛍光に分類された細菌のイメージングのための完璧な背景を提供します。
フレーム単位でさらに二次ソフトウェアを使用してを特徴付ける点状のドットの数を定量化することが本研究での細菌の検出は明るい点状ドットの可視化による質的に決定されます、ことプローブ ライブラリ。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig1.jpg"> 図 1:ひと肺組織の自家蛍光の静的なイメージ。前のヴィヴォひと肺組織が繊維化共焦点蛍光顕微鏡 (FCFM)、488 nm 励起、100% レーザー パワーと 12 フレーム/秒エラスチンやコラーゲンを用いた共焦点レーザー endomicroscopy (CLE) イメージが高い蛍光 (false グリーン塗装)、一方、肺胞腔は、黒の領域として表示されます。この図は、アクラムらから変更されています。11<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig2.jpg"> 図 2:ラベル付けされた黄色ブドウ球菌懸濁液中の共焦点レーザー endomicroscopy (CLE) イメージ。繊維共焦点蛍光顕微鏡 (FCFM) を用いて事前ラベル細菌をイメージ、488 nm 励起、100% レーザー出力 12 フレーム/秒ラベル付きで細菌を高輝度点状ドット (偽色緑) で表示。この図は、アクラムらから変更されています。11<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig3.jpg"> 図 3:共焦点レーザー endomicroscopy (CLE) イメージ ラベルの付いた黄色ブドウ球菌によるひと肺組織前のヴィヴォ。繊維の共焦点蛍光顕微鏡 (FCFM) 画像前のヴィヴォひと肺組織に使用され、高輝度点状ドット (偽色ショーを 488 nm 励起、100% レーザー パワーと 12 フレーム/秒ラベル付き細菌、黄色ブドウ球菌をラベル緑色の) 肺の組織サンプル カルセイン AM や UBI 10 とラベル付けされたときに。最高のコントラストは、肺胞腔内の細菌のイメージで観察されます。この図は、アクラムらから変更されています。11<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

この手法は、低分子化学物質の迅速同定のため繊維の共焦点蛍光顕微鏡によるひと肺組織体外内細菌特異光学イメージング エージェントを評価するための効率的なスクリーニング プロセスをについて説明します翻訳可能なポテンシャルを持つプローブ候補。

共焦点レーザー Endomicroscopy Ex Vivoひと肺組織の新規細菌固有の光学検査プローブします。

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

optical-screening-novel-bacteria-specific-probes-on-ex-vivo-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

7.4K ビュー.  University of Edinburgh. この手法は、低分子化学物質の迅速同定のため繊維の共焦点蛍光顕微鏡によるひと肺組織体外内細菌特異光学イメージング エージェントを評価するための効率的なスクリーニング プロセスをについて説明します翻訳可能なポテンシャルを持つプローブ候補。

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

免疫・感染学

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

共焦点レーザー Endomicroscopy Ex Vivoひと肺組織の新規細菌固有の光学検査プローブします。

要約

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の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌と人間

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で拡大

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症