P01CA040035（FE / JAS）とVAキャリア開発賞（JAS）：著者は、次の資金源を認める。

1。細胞維持<ol><li> MDA-MB-231の多くが骨転移したサブクローンは骨の植民地化と成長のための変数を持っている傾向が存在しています。我々の実験のために私達はUTHSCA 2で開発されたGFPタグ付きのMDA-MB-231由来のクローンを使用しています。この特定のサブクローンは4週間で犠牲にして、約3週間後の接種で可視溶骨性骨病変を形成することになる。 </li><li> 37℃、10％FBSおよび0.1 mg / mlのペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEMで細胞を維持°5〜8％CO 2の 7のC。 </li><li> 1:10希釈80〜90％コンフルエントと再プレートで継代細胞（これは細胞の種類やサイズのプレートによって異なります、T-75のMDA-MB-231細胞では、これは約6×10 5である）、これおよそ72時間です。 </li><li> MDA-MB-231細胞は、多数の偽足と概ね線維芽細胞の外観を維持します。任意の丸めは過密または他の望ましくないストレスの指標であり、このため、避けなければならないin vivoでの転移の可能性に影響を及ぼす可能性があります。 </li><li>理想的には、細胞を接種（私たちは以下の1週間をお勧めしたり、実験のために十分な細胞を持つまで）の前には簡単にしか培養で維持されるべきであり、丸めまたは細胞増殖率の変化が発生した場合、新しいバイアルを解凍する必要があります。 </li></ol> 2。細胞調製<ol><li> 0.15％80〜90％のコンフルエンスで細胞をトリプシン処理トリプシン/ EDTA（PBS中の0.5％ギブコトリプシンEDTA 1:2希釈）。この濃度は、高速剥離（&lt;2分）を可能にし、細胞の凝集が減少します。 </li><li>直ちに10mlの氷冷DMEMを5分間200×gで15 mlコニカルチューブおよび遠心分離機に10％のFBS、ピペットを含有するプレートから細胞を除去する。 </li><li> 25ミリリットル氷冷PBS（CaおよびMgなし）と数えるの50 mlコニカルチューブでペレットを再懸濁します。 </li><li>再ペレットに遠心し、1ml当たり10 6個の細胞（心臓）で、または氷冷PBSで25万cells/10μL（intratibial）で再懸濁します。テンペラPBSのトゥーレは、注入後の細胞とそれに続く塞栓症の凝集を防止することが重要である。細胞懸濁液は、注射を行いながら、氷の上に残っているべきであり、実行可能で、30分間、国連は、凝集したままになります。必要なプレートの正確な数は、治験責任医師から治験責任医師に異なりますが、我々は一般的に8月10日マウスの間には1、T-75を使用しています。 </li></ol> 3。心臓内接種<ol><li> 4〜6週齢の雌（Foxn NU-/ - ：ハーラン）マウスは、これらの実験のために使用され、他の免疫不全マウス（RAG1-/ - 、RAG2 - / - 、SCID、XID、およびなど）のものも出できヒト癌細胞の実験で使用されます。 </li><li>注入手順による死亡率を減少させる、と撮像法のバックグラウンド蛍光を低減するために注入する前にヌードマウス飼育Teklad 2920xダイエット5-10日である必要があります（食べ物はアルファルファ無料ですので）。 </li><li>のnu / nuマウス以外を使用する場合は、腹側腹部ARで（我々の経験Nairさんでよりよく動作）ナイールを剃るか、または使用することによって毛を取り除く手順を開始する前にEA。 </li><li>または他の好ましい麻酔（我々の経験ではイソフルランが心臓内接種に対して許容最高です）：イソフルラン気化器（2-3 L / minのO 2 2.5％ISO）を使用して隔離室でマウスを麻酔。 </li><li>ステンレス製換気フード内麻酔マシンのノーズコーン、一度に1つのマウスを移動します。 </li><li>上を向いて胸と背中にそれぞれのマウスを置きます。 </li><li> 2回繰り返し、70％エタノール、続いて10％ポビドン/ヨウ素綿棒/溶液と胸を洗ってください。 </li><li>注射用マークマウスの胸（無菌マーカーを使用したり、注射部位を無菌維持する側に若干マーキング）。我々は、胸骨のマーク位置胸骨切痕とxyphoidプロセスの上部との間の中間にあり、わずかに左に（解剖）を使用します。 300μlの28グラム½インスリン注射器のプランジャとメニスカスの間にスペースを（心臓パルスを見るために重要）を作成するために注射器の中に空気の小さな泡を描き、細胞100μlを描く。 </li><li>針が直立しておいてください。もう一方の手でピンと張ったマウスの皮膚を押さえながら、針を挿入します。 </li><li>左心室に挿入が成功し、シリンジ内の血液の明確な明るい赤のパルスになるはずです。この深さでは、慎重に胸腔内の心臓やこぼれた細胞を刺さないように針の重要な動きなく、シリンジのプランジャ（100μlの体積）を踏み込みます。 </li><li>細胞が注入された後、胸腔への細胞のしたたり減らすために負圧の少量を作成するためにプランジャを少しアップされています。 </li><li>心臓の内膜を引き裂き、出血を引き起こす可能性があります取り外し、中に針を傾けないように注意しながら直接胸の針を引き抜きます。 </li><li>出血を減らすために注射部位の上に胸に穏やかな圧力を適用します。 </li><li>ノーズコーンからマウスを取り外し、約1分間の光の圧力を適用し続ける。 </li><li>完全に詐欺になるまで加熱パッドにマウスを移動scious。 </li><li>マウスが回復した後にスピンしたりけいれんし始めた場合は、可能性の高い原因は塞栓症です。血管抵抗を減少させながら血流量と心拍出量を増加させるためにケタミンの80〜120 mg / kgを腹腔内でマウスを注入します。これは、マウスが血栓に合格するのを助ける必要があります。これが発生した後、それは、細胞が凝集されていることを示しているとして、それは、細胞調製物を変更するのが最善です。我々は、約8匹の後に細胞調製物を変更するか、または30分。 </li></ol> 4。 Intratibial <ol><li> Buprenex（0.1 mg / kg）のか、すぐに手続きの前に似たような承認された鎮痛剤をマウスに注入します。 </li><li>イソフルランを用いてマウスを麻酔し、ノーズコーンに移動して麻酔を維持します。 </li><li> 10％ポビドン/ヨウ素で両足をきれいに綿棒/ソリューション、2回繰り返して、エタノールが続く。毛皮の存在しているなら、クリーニングの前に脱毛脚（ナイールまたは同様の製品を使用）。 </li><li>そっと外果、内果、と人差し指とthと脛骨の下半分を把握UMBは、その後（屈曲と外旋の組み合わせは、膝が表示されていてアクセスするような足を曲げる。 </li><li>明確な、厚い、白い線として見えなければならない膝蓋靭帯を、根底の視認性を高めるために70％エタノールを用いて皮膚を湿らせます。しっかりと28グラムのマウスインサート半針膝蓋骨下、膝蓋靱帯の真ん中を通しての足首/足を掴むと、脛骨の上部の前顆間区にしながら。 </li><li>脛骨に針を挿入すると、わずかに掘削アクションと安定した、しっかりと圧力を利用して成長板をよく導く。 </li><li>脛骨の成長板の浸透時に、針が著しく少ない抵抗に遭遇するでしょう。 </li><li>針は脛骨と成長板を介してであることを確認するために、針の穏やかな、横方向の動きを使用しています。針は脛骨内の適切な場所にある場合、動きが制限されます。 </li><li>徐々に細胞溶液の10μlを注入するためにプランジャーを押し下げます。抵抗なしに少しは、この時点で感じられるはずです。 </li><li> SLOwly針を抽出します。 </li><li>同じ手順に従って、PBS10μlを注入するために次のレグに進みます。 </li><li>麻酔からマウスを外して、回復するまで加熱パッドを続ける。 </li><li>次の24時間にわたってマウスを監視して、動物が苦痛の徴候を示し続ける場合は、追加Buprenexですべて12時間を注入します。 </li></ol> 5。撮像時間コース<ol><li>ルシフェラーゼイメージング：該当し、ルシフェラーゼイメージングは​​7日後の腫瘍細胞接種（ほとんどの骨転移モデルにおけるもっとも、近い14日目に検出可能）で開始に利用されるべきである。マウスは、150 mg / kgのルシフェリン、麻酔を腹腔内に注射し、8分IVIS装置8を使用して注入した後に結像される。 </li><li> GFPイメージングは：一般的にGFPを発現する腫瘍はマエストロイメージング機器（CRI）9を使用して心臓内実験用intratibial注射と16から21のために一日10から14の周りには検出され始める。簡単に説明すると、マウスはイソフルランで麻酔し（3％）とマエストロイメージングチャンバー内のノーズコーンを介して麻酔下で維持した。私たちのEGFP発現細胞のために私達は10 nmステップで500ミリ秒露出で青フィルターセット（EGFPの498 excitation/515エミッション）を使用します。 </li><li> Faxitron（X線）：X線は毎週14〜7日の間に開始取られる。病変はintratibial注射3で21日目で心臓モデルに表示され、一週間早くなります。 のex vivoおよびin vivoでの我々のX線写真のデータは、暴露の8秒間35 200kVでFaxitron LX-60を使用して取得しました。 </li><li>他のイメージング：イメージングモダリティは完全に特定の研究に基づいて行われます。上記の方法に加えて、3Dマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）、マイクロ陽電子放射断層撮影（μPET）、および他のモダリティ10,11に基づいて生きている動物イメージングは、貴重な情報を提供することができます。 </li></ol> 6。マウスサクリファイス<ol><li>各モデルには、わずかに異なる時間経過を持っています。 MDA-MB-2と31細胞のマウスには、通常、21と35日は通常、一日約28（それは21から28日の間にマウスを注入）との間の悪液質または下半身不随になる。 </li><li>一度に複数のマウスは、頸椎脱臼（または他の動物実験委員会の承認された方法）とケタミン/キシラジン過剰摂取を用いた研究ではすべてのマウスを犠牲にし、下半身不随になったり、体重の10〜20％の間で失う、皮質骨を突破し始める病変を発症。 </li><li>バッファリングされた4％ホルマリンでさらなる研究とストアに必要な骨を取り除きます。 </li><li>胸の腫瘍を持つマウスは逃した注射のしるしであり、試験から除外されるべきである。 </li></ol> 7。ex vivoで解析 <ol><li> μCT：70％EtOHにスキャンは、同じ骨片で測定するために、構造的および組織学的パラメータを可能にします。 </li><li>等高線や個々の実験計画や利用可能な装置10によると分析する。我々のデータは、12μmの解像度を使用してScancoμCT40で得られた。 </li><li> Histomorphometry：望ましい組織学的方法を用いてプロセス標本とヘマトキシリン/エオシン7で染色</li></ol> 8。代表的な結果腫瘍細胞の心臓内またはintratibial接種（ 図1）に続いてマウスはX線撮影および蛍光（または発光）で毎週監視されています。彼らはモデル（ 図2）に応じて、2週早ければ蛍光および発光により表示されることがありますしながら病変は、通常、週2と3の間にX線で明らかになる。病変は、骨の中の暗い穴として表示され、時間（ 図3）でより顕著になる。病変はX線写真のMetamorph分析を用いて定量化され、蛍光がマエストロ（CRI）画像取得と解析ソフトウェアを用いて定量した。病変が成長し始めると、マウスが頻繁に悪液質になる。マウスは彼らの最初の体重の10〜20％の間で失われたときに犠牲が必要となります。の条件<html>マウスは、急速に変化することができ、日中に何度も監視する必要があります。 3-4週間の間にマウスは、1つまたは両方の後肢をドラッグし始め、全体の研究が犠牲になった。画像は、犠牲にする前に取られた。麻酔を大量に服用した後、血液は骨代謝やその他の要因のマーカーを測定するために収集した。頸椎脱臼した後、皮膚を切除し、マウスと骨から剥奪されたと、少なくとも7日以前のin vivoイメージング技術に比べて腫瘍病巣の可視化を可能にするのex vivoイメージング（ 図3）のために掃除した。イメージングが完了した後の骨は、ラベル付きカセットに入れて、固定し、さらに組織学的処理μCTまたは分析のためにホルマリンに保存されていました。組織形態計測はμCT後の腫瘍負荷およびBV / TVを示すために、サンプルで実施された骨破壊の量（ 図4）を定量化するために脛骨上で行った。 / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。注射を適切に配置する。 第 4肋間で、心臓内接種のために左心室への針の適切な配置を示す成体マウスの胸部の腹radiographicalビュー（）。解剖学的ランドマークが胸骨上の水平の破線（白抜き）で示されている。マウスの皮膚に胸骨切痕とxyphoidプロセスは、ランドマークとして機能し、針が胸骨の左にわずかに挿入されます。顆の間に整列脛骨近位端に針の適切な配置を示す成体マウスの脚の腹側radiographical図（B）、。横方向の視点から針の先端が脛骨粗面と骨端軟骨板への深い後ろに配置されます。注入のための理想的な場所は、白丸で示されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> 図2。骨転移モデルの時間経過。caの進行X線やGFPを示すncer誘発性骨疾患+ in vivoでの腫瘍の蛍光画像intratibial注射（）と心臓内注射（B）から。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> 図3。 。、MDA-MB-231の心臓内注射後0日、14日、21日、および28でGFP蛍光を示すエクスビボ画像： 心臓、MDA-MB-231モデルの一番上の行の時間経過 。 14日目に腫瘍病巣が軟部組織を除去した後のex vivoでのみ表示されますので注意してください。下段：溶骨性骨病変を示す同じ大腿骨の ex vivoで放射線画像。骨の破壊が3週間心臓注射後まで通常表示されていないことに注意してください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> 図4。骨転移の進行の定量化。GFP + tibiのマエストロのex vivoイメージングにより可視化などの腫瘍非担癌マウス（）および4週間、MDA-MB-231サブクローン（B）を発現しているGFPの心臓内注射後のマウスのAE。腫瘍病巣はFaxitron（D）で示すように骨破壊の領域と相関する腫瘍（C言語）を使用せずに骨を比較した。 microCT測定から骨構造とミネラルのデータは健康な骨（E）および担癌骨（F）は骨破壊の領域が無効領域として示されているの3D画像としてレンダリングされます。さらに骨や腫瘍詳細は、対応するH＆E染色組織切片（G＆H）に見られる。

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Cancer Res. , (2012).</li><li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma.">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li><li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone.">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li><li>Sterling, J. 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Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease.">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

腫瘍誘発性骨疾患の研究は、2つの最も一般的に使用されるが、心臓とintratibial接種そのうちのいくつかの動物モデルに依存しています。多くの場合、心臓、骨への転移を研究するための最良の選択肢であるが、それは完全な転移過程を表すものではありませんので、乳腺脂肪パッドまたは他の同所注射は、理想的には、その端部に向かって使用する必要があります。腫瘍細胞は、ヒト細胞を?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MDA-MB-231ヒト乳癌細胞</td><td>もともとATCC-内部クローニングされ、選択した</td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>メディアテック株式会社</td><td> 21から040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td>アトラス生物</td><td> F-0050a </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td>マエストロ</td><td> CRI </td><td></td></tr><tr><td> μCTスキャナ</td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td>無胸腺ヌードマウス</td><td>ハーラン</td><td>フォックスNU - / - </td></tr><tr><td>インスリン注射器（300μL、28.5グラム） </td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td>キャリパー</td><td></td></tr><tr><td>照射されたげっ歯類のダイエット</td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

骨転移は、乳癌、前立腺癌、および肺癌を含むいくつかの悪性腫瘍で一般的なものです。一度骨に設立され、腫瘍はかなりの罹患率と死亡率の1を担当している。このように、骨の腫瘍の確立、成長や活性を制御する分子メカニズムを理解するための重要な必要性がある。 in vivoモデルのいくつかは、これらの事象を研究するために設立され、それぞれが固有の利点と制限事項がありますされています。最も一般的に使用されるモデルは、無胸腺（ヌード）BalbCマウスの動脈血供給に直接腫瘍細胞の心臓内接種を利用しています。この手順は、多くの異なる腫瘍タイプ（PC-3前立腺癌、肺癌、およびマウスの乳腺脂肪体腫瘍を含む）に適用することが可能であるが、本稿で我々は、MDA-MB-231乳癌モデルに焦点を当てます。このモデルでは、我々はもともとサンアントニオの博士マンディのグループで導出された高度に骨選択的クローンを、利用している時間以来、GFPの発現のためにトランスフェクトされ、私たちのグループ3によって再クローニングさとして。このクローンはosteotropism率が高いと、肺、肝、副腎にはほとんど転移を有する骨転移変種です。心臓内注射は、最も一般的に骨転移2の研究のために使用されていますが、特定の場合にintratibial 4または乳房脂肪注入の方が適しています。 、骨に逮捕生き残る、増殖し、癌誘発性骨疾患に発展する腫瘍を確立するために具体的には、癌細胞の能力を転移の後の段階を監視することを目標に、ヒト腫瘍細胞を使用しているとき心臓内注射は、一般的に実行されます。腫瘍が確立された転移性骨疾患にほぼ相関して骨に転移した後にがん細胞と骨の関係に着目した場合Intratibial注射が行われます。塞栓症とエントリにもこれらのモデルを再現するの転移過程の初期段階では、前循環への腫瘍細胞の。骨へのプライマリ·サイトから原発腫瘍の増殖や転移を監視する場合は、次に乳房脂肪の接種は通常、優先ですが、非常に少数の腫瘍細胞株は一貫して、4T1骨優遇クローンで、プライマリサイトから骨に乳腺マウスを転移するでしょう癌、例外5,6である。 本稿では、このような細部接種の手続きを、ポスト接種分析における重要なステップが強調表示されます。具体的には、細胞培養、心臓とintratibial接種のために腫瘍細胞接種の手続きと同様に、X線、蛍光および組織形態計測分析による毎週のモニタリングに関する簡単な情報が含まれています。

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Models of Bone Metastasis

動物モデルは頻繁に骨への癌の転移を研究するために利用されている。このプロトコルでは、骨転移の研究のために腫瘍接種の2つの一般的な方法を説明し、簡単にこれらのモデルを監視し、定量化するために利用される分析のいくつかを説明します。

骨転移モデル

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Research

JoVE Journal

Medicine

41.9K ビュー.  Vanderbilt University. 動物モデルは頻繁に骨への癌の転移を研究するために利用されている。このプロトコルでは、骨転移の研究のために腫瘍接種の2つの一般的な方法を説明し、簡単にこれらのモデルを監視し、定量化するために利用される分析のいくつかを説明します。

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

実験的転移アッセイ

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

医学

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

調整可能な剛性、ラット大腿骨骨切り術や分節骨欠損モデルの創外固定器

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

腹腔内卵巣癌転移の定量

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...