当社のプロトコルは、転移性コロニー形成および成長における任意の候補遺伝子の役割を迅速かつ容易にテストするために使用することができる。このプロトコルはまた、転移、形成、成長のリアルタイムモニタリング、ならびに切除または組織学的染色を必要とせずに同じ動物の転移数およびサイズの定量を可能にする。完全な成長培地の12ウェルプレートに150,000個のウェルで4つのT1細胞をプレートします。
一晩摂氏37度5%の二酸化炭素でインキュベートする。翌日、細胞から増殖培地を吸引する。500マイクロリットルのルシファーゼウイルス上清と500マイクロリットルの蛍光タンパク質ウイルス上清を加え、同時にルシファーゼと蛍光タンパク質ウイルス上清の両方で細胞に感染させます。
その後、1ミリリットルの8ミリグラムの臭化ヘキサジメトリンを1マイクロリットル加え、摂氏37度でインキュベートし、24〜48時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。トリプシンの500マイクロリットルで4つのT1細胞をトリプシン化します。2〜5分後、すべての細胞を4ミリリットルの選択媒体で6センチメートル皿に移し、トリプシンを消光する。
選択が完了した後、感染した4つのT1細胞が50〜100倍の倍率で反転蛍光顕微鏡を使用してZsGreen蛍光タンパク質を発現していることを確認します。また、感染した4つのT1細胞が市販のルシファーゼ活性キットを用いてルシファーゼを発現していることを確認する。テキストプロトコルに記載されているように、in vivo実験計画の最適化を実行する。
培地を吸引し、1X PBSで細胞板をすすいだ。15センチメートルプレート当たり5ミリリットルのトリプシンで細胞を2〜5分間トリプシンし、すべての細胞を円錐チューブに移します。トリプシンをクエンチするのに十分な完全な成長培地で組織培養皿から残りの細胞を洗浄する。
同じ円錐形のチューブに洗浄を追加します。セルの合計数を決定するために、自動セル カウンターを使用してセルをカウントします。次に、細胞を122回Gで3分間遠心し、上清を吸引する。
所望の濃度で1X PBS中の細胞を再懸濁する。ここで、25,000個の細胞が各マウスおよび100マイクロリットルのPBSに注入される。したがって、再懸濁細胞は1ミリリットル当たり250,000細胞である。
細胞懸濁液を射出するまで氷の上に置いてください。動物施設のフードで作業し、チューブを反転するか、1ミリリットルの注射器を使用して細胞を穏やかに完全に混合し、均一に再懸濁されるようにします。さて、細胞懸濁液で1ミリリットルのルアーロックシリンジをロードし、余分な気泡を排出します。
ベベルを上げてシリンジに半インチの30ゲージ針を置き、気泡を排出します。げっ歯類の拘束剤にマウスをそっと置きます。横尾静脈は目に見えて拡張する必要があります。
そうでなければ、尾の根元をそっとつまみ、尾を暖かい水道水に浸して静脈を拡張します。アルコール拭き取りを使用して尾部をきれいにし、針を尾静脈に挿入し、ベベル側を上にして、100マイクロリットルの細胞懸濁液を注入します。針が静脈に適切に挿入されている場合、それは簡単にわずかに前後にスライドする必要があり、プランジャーを押しても抵抗があってはならない。
成功した注射はまた、静脈の青い色が注射後数秒間白くなるフラッシュをもたらすはずです.ゆっくりと針を取り外し、滅菌ガーゼを使用して、注射部位に圧力をかけ、出血を止める。マウスをケージに戻し、15分間監視して完全に回復します。
in vivo ライブアニマルイメージングデバイスの電源を入れ、画像ソフトウェアを開いてログインします。初期化ボタンをクリックし、マシンが初期化されるまで待ちます。ビューのフィールドを D.に変更する 初回使用時に、[編集]、[環境設定]、[取得]、および [自動露出] をクリックして露出設定を編集します。
最大露出時間をデフォルトの 60 秒から 300 秒に変更し、[大丈夫] をクリックします。D-ルシフェリンで1ミリリットルの注射器をロードし、注射器に半インチ30ゲージ針を追加し、気泡を排出します。麻酔付きマウスの質量を測定し、記録します。
親指とポインタの指で首の擦り傷をつまみ、ピンキー指と手のベースの間の尾をつかんでマウスを拘束します。マウスを 45 度の角度で反転し、頭が下を向きます。針をベベル側に挿入し、マウスの左側のIPスペースに挿入します。
小さいボリュームを描き戻してIP空間への入力を確認します。IP空間に描画するときに針のベースに色がないようにしてください。D-ルシフェリンの適切な量を注入する 150 キログラムあたりのミリグラムの用量.
D-ルシフェリン投与直後に、タイマーを開始する。鼻コーンに鼻を入れた画像装置の背面にマウスを平らにし、イオブルランの半分から2%半が投与されていることを確認します。発光ボックスと写真ボックスをクリックします。
露出時間を自動に変更し、取得コントロールパネルで取得をクリックします。イメージングの後、マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を確実にします。安楽死後、テキストプロトコルに記載されているように、各マウスから肺を分離して除去し、1X PBSでリンスして余分な血液を除去する。
GFPワイドバンドフィルターを使用して、ブライトフィールドの10Xでローブ内のZsGreen転移の画像を取得し、蛍光を取得します。画像解析ソフトウェアを使用して、画像のサイズと数のメタスタを定量化します。in vivoライブ動物イメージング装置で取得した画像のデータを処理して解析するには、画像ソフトウェアでマウスごとに全ての画像ファイルを開きます。
画像ウィンドウの左上にある矢印をクリックして適切な単位に変更することにより、生物発光データの輝度と蛍光データの効率がユニットであることを確認します。ツール パレット ウィンドウの ROI ツールをクリックして、最後の時間ポイントのイメージを使用して、関心のある領域 (ROI) を作成します。次に、矢印をクリックして 1 つの ROI を選択して、ROI を 1 つ挿入します。
ROI の枠線をクリックし、マウスの胸部に移動します。ROI のサイズを調整して、マウスの胸部を覆い、信号を除外しないようにします。次に、[ROI の測定] をクリックし、生の数値を Excel シートにコピーまたは入力します。
テキスト プロトコルで説明されているように、データをプロットして分析します。画像ファイルを右クリックして ROI をコピーし、他のタイム ポイントのイメージ ファイルに貼り付け、[ROI の測定] をクリックします。YAPおよびTAZの両方を標的とするタンデムmiR-30ベースのshRNAを発現するレトロウイルスベクターは、4つのT1細胞におけるYAPおよび税タンパク質発現および転写活性を低下させる。
4つのT1ルシメラーゼ細胞は、このタンデムYAP/TAZ shRNAベクターまたは制御されたmiR-30ベースshRNAのZsGreen発現バージョンで安定的に導入された。生物発光画像は、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスと比較して、コントロール細胞を注射したマウスにおいて転移負担が増加する速度が有意に速かることを示している。実験の過程で各マウスについて測定されたlog10変換されたルシファーゼシグナルのプロットは、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスと比較して、コントロール細胞を注射したマウスの速度が速かったことも示している。
YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスで形成される転移は、手動でカウントされた場合のコントロール細胞を有するマウスと比較して有意に少ない。画像解析ソフトウェアを使用した場合も同じ傾向が見られました。対照マウスではより多くの転移が形成されただけでなく、一般的に大きかった。
一貫して、肺の転移性負担もYAP/TAZノックダウンによって大幅に減少した。各マウスに同数の健康な細胞を注入することは、高品質のデータを確保するために重要です。感染性レトロウイルスやレンチウイルス、特にウイルスがヒト感染性である場合は、注意して安全ガイドラインに従うことを忘れないでください。
この技術により、候補遺伝子の役割と転移性コロニー形成および成長を説明することができ、転移性疾患の治療のための新しい治療標的を同定し、テストする方法を提供しました。この手順に従って、肺を含む転移を免疫蛍光または組織学的染色によってさらに分析し、改変された遺伝子が転移にどのように影響しているかを調べ、関与する可能性のある他のタンパク質を同定することができる。
