この作品は組んで帝国国立研究所健康研究 (NIHR) 医学研究センター (BRC)、NIHR 健康保護研究ユニット (HPRU) ロンドン大学インペリアル カレッジで呼吸器感染症から資金によって支えられた資金。NIHR 帝国とイギリス公衆衛生 (PHE) 患者の安全トランスレーショナル ・ リサーチ センターします。見解では、これらの者とは必ずしもこれらの NHS、NIHR、保健や公衆衛生イギリス。

次のプロトコルで使用される技術は、西ロンドン研究倫理委員会 (参照数 15/ロー/0444) によって承認されています。
1. 鼻吸収 (NA)
<ol><li>
NA サンプリングする前の準備
	<ol>
<li>NA を遂行した場合まず手洗いと手袋、患者の前にできれば。</li>
		<li>頭のトーチを使用して鼻腔を検査、鼻腔内を可視化する患者さんの鼻を撤回する彼らの非利き手の親指を使用して医師。 注:鼻鏡は通常必要ありません。</li>
		<li>鼻腔と下鼻甲介サンプリングの前に可視化します。 注:鼻孔 (鼻孔) 円形断面では、彼らはまっすぐ後方に移動します。一般に、膨らみや、鼻孔の外側の壁にインデントとして下鼻甲介を見ることができる鼻中隔を形成スムーズ、フラット内側の壁。たいこの引け目からサンプル鼻甲介、基になる上皮は上気道44の単純な線毛上皮なので。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA サンプリング
	<ol>
<li>サンプリングする場合は、下鼻甲介に対して平らであることの位置を決め、鼻孔の内腔を優しく NA サムを渡します。</li>
		<li>人差し指を使って鼻の粘膜の上にサムを押すドナーをお願いします。NA は、わずかなくすぐり、可能な限り目の散水とマロラクティック発酵がおこるよう可能性があります。 注:成人では、我々 は一般的に 60 NA を実行 s。</li>
		<li>MLF の吸収後、鼻孔から NA デバイスを削除し、元の管に戻します。</li>
		<li>研究室ですぐにサンプルを処理またはこのプロトコルの詳細として、それらを凍結します。 注:鼻の粘膜のチャレンジ モデルの様々 な異なる気道疾患、NA が検討されています。ただし、各研究と患者人口の他の呼吸サンプリング メソッドに対する検証を行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 気管支吸収 (BA)
<ol><li>
BA サンプリングする前の準備 注:BA は、気管支鏡検査スイートの専門スタッフによって実行されます。<ol>
<li>カテーテルを BA デバイスを配置すること、前に SAM は押し出しと、カテーテルに撤退を確認します。</li>
		<li>患者に BA を行う前に気管支鏡下シミュレータのモック BA を実施します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BA サンプリング
	<ol>
<li>気管支気管支、右下、右中葉に分割するだけで近位のレベルに気管および右主気管支に気管支鏡を渡します。 注: 私たち通常サンプルから気管支気管支気道内の他のサイトをサンプリングすることができます。カテーテルとサムを観察すると、気管支鏡先端を見ることができない 1 つ。気管支鏡が必要なサンプリング サイトに到着したら、ba、次の簡単な手順を遵守します。</li>
		<li>白の先端が気管支鏡の端に 1 cm の最大に、気道のちょうど表示されるまで、下カテーテル: は気管支鏡の操作チャンネルを通じて BA カテーテルを挿入します。気管支内視鏡やカテーテルの先端を気道の内腔の中心にしてください。カテーテル先端と粘膜に耐摩耗性のリスクを軽減する気管支の粘膜との接触を最小限に抑えるように注意します。</li>
		<li>サム アウト: SAM は右中または右下葉気道の内腔に押し出されますので、BA デバイスのハンドルを押し下げます。直視下気道壁にマロラクティック発酵との接触、サムが作っているように気管支鏡の先端を曲げます。30 の粘膜壁にフラットに気道内でサムを残して s。</li>
		<li>サムの: カテーテルの端に戻って、湿ったサム プローブがストレートや曲がっていないことを確認するため, 気管支鏡に目を通します。必要なカテーテルや気管支鏡の先端が SAM をまっすぐに後ろにできます。直視下カテーテルにストレートのサムを優しくリトラクトします。 注意: 難易度のカテーテルに SAM を取り消し、サムと全体のデバイスを撤回、気道から押し出されます。</li>
		<li>カテーテル: 気管支鏡の操作チャンネルからカテーテル全体を撤回します。</li>
		<li>サムを断つ: SAM は滅菌ハサミで切断されは氷の上を cryotube に入れています。これらのサンプルは、このプロトコルで後で説明するよう、さまざまな方法で処理できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. NA と BA の処理をサンプルします。
注:NA と BA から生じるサンプルの実験室の処理のための多数のオプションがあります。これらのプロトコルは、後で使用するためのサンプルを格納し、SAM から MLF サンプルを溶出するを求めます。
<ol><li>
NA と BA のサンプルの即時処理のオプション
	<ol>
<li>オプション 1: は、さらに処理する前に、いくつかの時間のため氷の上湿ったサムを格納します。</li>
		<li>オプション 2: すぐに深い凍結 NA サムズ コレクションの管です。同様に、サンプリング デバイスからハサミで除去した後、セラム チューブで BA SAMs を凍結します。</li>
		<li>オプション 3: 直接または深い凍結を処理する前に溶出バッファー (300 μ L) で戸建のサムを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA と BA のサンプルの溶出バッファーのオプション 注:溶出バッファーの選択は MLF サンプルで分析することに依存し、私達は 4 つの主な選択肢を提案します。<ol>
<li>事前に用意されたアッセイバッファー イムノアッセイ プロシージャに適したを使用します。そのようなバッファーは、蛋白質、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) の 1% だけでなく、少量の洗剤 (0.05%) を含める必要があります。</li>
		<li>また、セル換散が発生しますので、洗剤の量を格納するバッファーを使用します。 注:1% の濃度でトリトン X または NP40 を含むバッファーを使用します。セル換散バッファーは、サムから溶出して一般的に高いレベルのサイトカインとケモカイン、サイトカイン細胞内と細胞外の両方を有効にします。これらのバッファーは、タンパク質を含める必要があり、1 %bsa と成っています。</li>
		<li>ウイルス RNA または測定のホスト RNA の定量的 PCR などの RNA 測定湿ったサムに直接 RNA 抽出バッファーを追加します。 注:カオトロ ピック RNA 抽出バッファーを含む蛋白質を変化させるため。代わりに、免疫や細胞の換散バッファーで溶出 MLF 流体に RNA 抽出バッファーを追加します。</li>
		<li>質量分析法による評価のための代謝と脂質の抽出のため、トリフルオロ酢酸などの有機溶剤を使用します。 注:これらの試薬の詳細は、マテリアル セクションに含まれます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶出法
	<ol>
<li>いずれかの上記の溶出技術、SAM を目的抽出バッファーと共に、2 mL マイクロ遠心チューブに挿入します。</li>
		<li>渦ミックス 30 サンプル s 緩く接続された体液と生体分子のサムを洗浄します。</li>
		<li>サンプル全体については復旧できるようにには遠心溶出を実行するために、洗浄に使用される同じ 2 mL マイクロ遠心チューブに挿入するスピン フィルター ミニ列に湿ったサムを追加します。 注:2 つのスピン フィルター ミニ列の種類を使用できます。最初には、流体における溶出を許可する場所に SAM を保持するプラスチック製のメッシュのみが含まれています。また、感染性物質を扱う場合は、0.22 μ m の細孔径を持つスピン フィルターを使用します。これらのフィルターは、試料を滅菌し、抗酸菌感染サンプルに適しています。ただし、これらのフィルターは、非特異的相互作用によってフィルターするメディエーターの結合を最小限に抑えるためのバッファーでする必要があります。</li>
		<li>スピン フィルターに湿ったサムを転送するのに滅菌鉗子を使用します。検体の間汚染を防ぐために鉗子を変更します。</li>
		<li>ミニ遠心分離機で 16,000 x g で 20 分間遠心分離機サンプル 4 ° C に冷却</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プロトコルの概要の例
	<ol>
<li>研究室では、ラベル 2 mL サンプル コレクションのマイクロ遠心チューブと溶出バッファーの適切なボリュームを追加 (通常 300 μ L NA; の ba 100 μ L)。シール蓋と氷の場所です。</li>
		<li>次のサンプリング (すぐにまたは実験室で) SAM 鉗子を使用してハンドルから削除されコレクション チューブ (前の手順で作成した) を含むバッファーに置かれます。遠心チューブのキャップはしっかりと閉じられ、さらなる処理のために検査室に、氷の上、サンプルを転送を確認します。</li>
		<li>30 の転送コンテナーと渦ミックスからサムと溶出バッファーを含むチューブを削除 s。</li>
		<li>滅菌鉗子を使用して、SAM を削除し、(0.22 μ m 酢酸セルロース フィルターの有無にかかわらず) スピン列に置きます。</li>
		<li>コレクションの管から溶出バッファーを収集し、保持します。</li>
		<li>元のコレクションの管で、サムと、スピン列を配置 (または新しい 1 つの場合、滅菌フィルターのサンプル) 列をスピンする収集バッファーを追加。この方法では、洗浄液が SAM からサンプルを溶出するコレクションの管に回転カラムを通過します。</li>
		<li>サンプルを遠心分離機、シール蓋 (16,000 x g, 20 分, 4 ° C)。</li>
		<li>遠心分離機からサンプルを取り出し、ラックに置きます。</li>
		<li>チューブのシール蓋を開き、SAM を含むスピン列を削除します。適切な廃棄容器のサムとスピンの列の処分します。</li>
		<li>慎重に因数にチューブ内に含まれる溶出液ラベル低温管します。溶出液量とボリュームをそれぞれ因数に記録します。</li>
		<li>シールのクライオ チューブを-80 ° C のフリーザーに転送し、使用するまで直立を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

既存気道サンプリング技術からの結果は非常に変数とみなされますこのフィールド5内の研究の標準化に代替サンプリング技法が必要。NA と BA MLF のサンプリングを許可非侵襲的な方法で、健康と病気の気道の免疫反応を測定するエキサイティングな可能性を秘めています。これらの技術は、既存技術より忍容性、速度サンプリングのサンプリングを繰り返す頻繁機能などさまざまな潜在的な利点を下げるユーザ間の可変性を提供し、免疫メディエーター5 の希釈を減少.吸収と処理方法を使用の期間は、各研究用に最適化およびサンプリング イベントの間が厳格に守らすべき。また、BA、場合慎重に個人間の気道内サンプリング サイト必要がありますレプリケートされます。
NA、そして特に BA は、まだ比較的新しい臨床研究手法です。しかし、これらの技術の利点が代替技術5に対する慎重な検証を含む多くの研究での使用にしました。これらのデバイスは、デバイスの CE マークが呼吸の研究の広まった使用の準備ができて利用可能な今。NA と BA は、代替サンプリング手法よりも多くのより小さいサンプル ボリュームの結果、得られた濃度が高いことができます低豊富な免疫メディエーターの高い感度に 。
目的のダウン ストリーム アプリケーションによって NA と BA のサンプルは、後の処理が、臨床研究環境で研究の実現可能性を高めるため直接固定できます。サンプル処理のためのプロトコルは、特定下位アプリケーションに合うように適応させることができます。推奨処理技術は、核酸、免疫生理活性脂質または蛋白質のコレクションを使用できますが、各研究用に最適化する必要があります。特に、MLF は異なるバッファーで溶出できます。まず、粘膜のサイトカイン、ケモカイン、および抗体6,45を測定する免疫測定法によるバッファーを使用できます。セル換散が発生すると、細胞内サイトカインを含めることを保証するために、洗剤レベルの高いバッファーを使用もできます。ウイルス感染、ウイルスの定量に使用するバッファー カオトロ ピック RNA 抽出ロードは、mRNA と、マイクロバイ ホストします。また、有機溶剤は、リピド ミックスと質量分析法に使用できます。
結論として、MLF 粘膜の表面から直接吸収、呼吸、消化管、泌尿生殖器、および他の粘膜疾患の潜在的な使用とエキサイティングなテクニックです。ただし、これらの有望な吸収の技術をサンプリングし、各疾患の設定 (バイオ マーカー) 個々 の試金のための加工技術の正確な検証が必要になります。さらに、これらの新しい精密粘膜サンプリング テクニックとして必要になります従来のサンプルに対する検証など血液や呼吸、痰から。これらの技術は、微生物、サイトカイン、ケモカイン、プロスタノイド、抗体を測定する MLF を使用できます。

ほとんどの呼吸器疾患を引き起こす炎症反応やアレルギー性鼻炎、ウイルス、真菌感染症、結核、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺の呼吸器粘膜面からのサンプリングのための緊急の必要性があります。線維症や肺がん1。鼻咽頭吸引液 (警察庁)、鼻洗浄、気管支肺胞洗浄 (BAL) は、上部と下部の気道をサンプリングするための一般的な手法です。しかし、これらのテクニックは、貧しい忍容性、炎症性メディエーターの希釈サンプリング2を頻繁に繰り返すことができないなどかなりの問題を提示します。警察庁サンプリングする代わりが群がったナイロン、綿、綿棒の使用またはレーヨン3,4, が、これらも、限界がある不快感や被害鼻上皮といくつかの場合不可逆的な結合を起こすので炎症性メディエーター5。時間以上連続繰り返される一般的にこれらの技術もできない、代替技術は低豊富なサイトカインやケモカイン5,6の検出に効果的かもしれません。さらに、これらの技術に関連付けられているユーザーの変動は大きい患者コホートの要件の結果、データの不整合を生成するかもしれません。
また、天然および合成スポンジを使用して吸収技術は粘膜表面から MLF を収集するために使用されています。眼科用スポンジは天然セルロース (例えば、Weck cel) で構成されるサンプル唾、子宮頚部、膣分泌物7に使用されています。さらに、ポリビニル アルコール (PVA) から作られた合成スポンジと水酸化ポリ酢酸ビニル (HPVA) の活用8をされています。7 つの異なる吸収材料はポリウレタン ミニ スポンジは人間の涙10を収集するために使用されてきたが、抗体9を測定する前の唾液をサンプリングの比較されています。
綿植物から天然セルロース濾紙は、アラム、13,1412,1992年11、、、同僚の先駆的な論文から鼻分泌液を吸収するため広く使用されています 15,16,17。ろ紙ディスク フィルター カード (例えばシャンドン) から生産されているおよび鼻汁中の課題を制御後と自然のアレルゲン暴露18,19 ヒスタミン、サイトカインの測定に利用されています。 ,20,21。ただし、フィルター ペーパーの異なるバッチは蛋白質の結合およびサイトカインを解放するいくつかの失敗の度合いで異なります。合成吸収性マトリックス (SAM) を使用してメソッド開発2,22,23をされているため。Sam は通常 na というが使用鼻 MLF を取得する今これらの吸収性材料が快適に使用し、時間の長時間にわたって、MLF を炎症を起こしている鼻からも頻繁な間隔で取得できます。
鼻吸収は、上気道の MLF のサンプリングのための SAM を使用して精密粘膜サンプリングの形式です。NA デバイスとして CE マークが付いている医療機器クリーン ルームを用いた医療グレードの材料から製造され、ほこりやアレルゲンの無料です。NA サンプラー滅菌 cryotube のハンドルとサムから成ります。SAM は通常繊維、高分子で構成されていますも泡として利用可能だし、ソフトと吸収、サンプル コレクションの急速な吸湿発散性で選択されます。Sam 吸収分泌物の効率的な溶出できるように最小限のタンパク結合があります。NA は、すべての年齢層のドナーに対して実行できる非常に穏やかな、非侵襲的な手法です。さらに、シリアルのサンプリング、数分にも可能です。NA がサンプリング テクニック5既存の上部気道に対して検証され、繰り返しサンプリング速度論的データ アレルゲン23,24,25気道への挑戦、次の世代ができましたエンドトキシンの26とウイルス型 TLR アゴニスト (Jha、a.ら、原稿準備のために)。NA は、ウイルス細気管支炎30乳児アトピー27,28,29の自然史を調査するのにも使用されています。
気管支鏡下の特定 (BMS) は、オリンパス31,32,33によって開発されている気道内 MLF のコレクションのプロシージャです。残念ながら、この BMS システムが日本にはライセンスのみ。オリンパスは、2 つの BMS システムを供給: 線維性水酸化ポリエステル (FHPE) との 1 つは34,35,36,37, プローブし、綿とプローブの33,38,39,40,41,42,43。 大きなネックは、粘膜接触出血、血液で汚染されたすべてのサンプルの半分を引き起こした喘息患者で使用される BMS プローブをされています。著者らは結論サンプル MLF 喘息患者43で末梢気道からこの BMS システムを使用することは不可能だった。
代わりに、以下のライノ ウイルス6, 気管支喘息患者の実験的感染症、下気道の気管支の調査の間に実行することができますソフト SAM を使用して BA を開発しました。BA デバイスで構成されています: 外部中空カテーテル、ハンドピースを活性化、サムを押し出し、その端に SAM を持つ中央のプラスチック ガイド ワイヤ。ナ、BA キット、クリーン ルームを用いた医療グレードの材料から製造されて、ホコリやアレルゲンが。さらに、デバイスは、CE マークおよびガンマ線照射があります。サム ストリップは、吸収性、ソフト、サンプル コレクションの迅速ウィッキングします。また吸収分泌物の効率的な溶出できるように最小限のタンパク結合があります。デバイスは、気管支鏡の作業経路を通じ合うことができるとに急速に使用することができます、気道内の特定のサイトで MLF を正確にサンプルします。バル、BMS とは異なり接触出血または追加の患者不快感ポスト プロシージャの BA はされません。
NA と BA のサンプルの処理によく考慮する必要があります。サンプルをすることができます直接冷凍し、バッチで処理またはすぐに処理することができます。サイトカイン、ケモカインや免疫グロブリンは、ウイルス、細菌、有害の溶出のイムノアッセイを含む特定の下流のアプリケーションに対する処理の種類を調整ことができ、宿主細胞に RNA が関連付けられています。提案する臨床コレクションと研究室の臨床研究者のためのガイドとして NA と BA に関連する処理技術。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

鼻吸収 (NA) と気管支吸収 (BA) の方法は、人間の上気道の粘膜内層液 (MLF) を吸収するのに合成吸収性マトリックス (SAM) を使用します。NA は、下鼻甲介、液を吸収し、最小限の不快感が発生する非侵襲的な手法です。NA は、上気道のサンプリングを繰り返す頻繁機能で再現可能な結果をもたらした。
比較では、呼吸器粘膜、鼻咽頭吸引 (警察庁) や従来の拭き取りなどのサンプリングの方法より侵襲的と大きなデータ変動の可能性があります。他の方法は限界がある、例えば、生検および気管支のプロシージャ侵襲、喀痰を含む多くの死者と死にかけている細胞し、液状化を必要とする、呼気凝縮液 (EBC) 含まれている水や唾液などし洗浄のサンプルが希釈し変数です。
BA は、クリニックで気管支鏡の作業チャネルを介して実行できます。サンプリングは忍し、気道内の複数のサイトで行うことができます。BA の結果気管支肺胞洗浄 (BAL) のサンプルよりも少ない希釈されて MLF サンプルで。
この記事は、NA と、BA のテクニックだけでなく、必要な下流バイオ マーカーの測定対象に合わせた結果のサンプルの検査処理を示します。これらの吸収技術は、臨床呼吸器研究で使用される従来のサンプリング技術を有効な手段です。

NA は、研究の数で簡単に利用されているし、粘膜の炎症を非侵襲的測定します。鼻にアレルゲンの投与、上昇するとマスト細胞の脱顆粒 (スウェーツら、に備えて原稿) に沿って数分 (図 1)、落下プロスタグランジン D2 (PGD2) レベルを観察できます。また、IL-5 (図 2、 24からの許可と再版される) などのタイプ II 炎症のメディエーターは次の鼻アレルギー チャレンジ23,24時間で測定できます。アレルギー性喘息患者と健常者の実験的感染は、NA はインターフェロン γ (IFN-γ) を含む調停のパネルを測定する (図 3、 6から許可を得て転載) の 7 日間にわたっていました。さらに、幼児の自然な呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 感染、NA 実証非 RSV 細気管支炎と健全なコントロール (児に対する IFN-γ などの炎症性サイトカインの高いレベルに関連付けられる RSV図 4、 30からの許可と再版される)。興味深いことに、RSV と非 RSV 細気管支炎の鑑別は、時間一致警察庁サンプル (図 4) で重要でした。
BA は、ライノ ウイルス、アレルギー喘息の実験的感染時にも使われました。IFN-γ、CXCL11、ライノ ウイルス感染、レベル 4 日 IL-10 と IL-5 (図 5のベースラインから上昇を認めたA、B、C および D は、それぞれ)。さらに、この手法は、健康コントロール (図 5 6から許可を得て転載) (図 5) を基準にして、ライノ ウイルス感染時にアレルギー性喘息患者の気道で IL 5 高値を示した。
アッセイバッファー 0.05% Tween 20 と 1 %bsa を含むを使用して溶離されるサンプルから生成されたこれらの代表的な結果 (材料の表を参照してください)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> 図 1: 急速な生成およびプロスタグランジン D2 次の鼻汁中のクリアランス。ティモシー草花粉鼻アレルギー チャレンジ シリアル サンプルで鼻吸収波からプロスタグランジン D2 (PGD2) の測定 (n = 5)。各行は、1 人の個人からのデータを表します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> 図 2: IL-5 次の鼻汁中の運動測定。シリアル鼻吸収サンプル鼻汁中の IL-5 の生産。3 繰り返しの参加者とアレルゲンの課題研究を実施した (n = 19) プラセボ (青)、低の用量 (10 mg) の経口プレドニゾン (オレンジ)、または高用量 (25 mg) 経口プレドニゾン (赤) アレルゲン投与前に 1 時間。行を表す幾何平均と誤差は、すべての参加者の 95% 信頼区間。(図は 2017 情報漏洩者ら、粘膜免疫学の許可を得て転載)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> 図 3: ライノ ウイルス感染インターフェロン-γ の誘導します。健康な成人の感染チャレンジ中に (n = 11、青) とアレルギー性喘息患者 (n = 28、赤) ライノ ウイルス 16、鼻吸収サンプリング インターフェロン γ (IFN-γ) のレベルを測定する使用されました。データは、四分位範囲を示す誤差範囲を個人や B) 中間レベルの A) 生スパゲッティ プロットとして表されます。(図は、ヘンゼルらから許可を得て転載6).<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> 図 4: Nasosorption 差別乳児の rs ウイルス感染症に関連付けられている高架のインターフェロン-γ 。鼻吸収と鼻咽頭吸引 (NPA) は、細気管支炎呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 感染症に関連付けられている乳児のインターフェロン-γ レベルを測定する使用された (赤、n = 12)、非 RSV 呼吸器病原体 (緑、n = 12)、および健康コントロール (青、n = 9)。Kruskall-ウォリス検定ダンズ補正を用いた多重比較用データを行った (* * *p< 0.001)。ラインは中央値を表し、誤差範囲、四分位範囲します。(図ア スウェイツらから許可を得て変更30).<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> 図 5: ライノ ウイルス感染時に気管支の吸収サンプル中の炎症メディエーター 。 健常者のライノ ウイルス 16 感染 (n = 10、青) とアレルギー性喘息ボランティア (n = 23、赤)、気管支の吸収はベースライン時および感染 4 日目 D) IL-5、C) IL-10、B) CXCL11 A) IFN-γ のレベルを測定する使用されました。ウィルコクソンによって分析されたデータは署名ランク テスト (一致するサンプル)、マンホイットニー検定 (比類のないサンプル)。図は、ヘンゼルらから許可を得て転載6<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

本稿では、具体的には合成吸収性マトリックス (SAM) を使用して、上部および下気道の粘膜内層液 (MLF) をサンプリングして鼻粘膜および気管支の吸収の技術の使用について説明します。これらのメソッドより標準化と既存の呼吸サンプリング手法よりも忍容性を提供します。

鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

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SCIENTISTS IN ACTION

29.5K ビュー.  St Mary's Hospital. 本稿では、具体的には合成吸収性マトリックス (SAM) を使用して、上部および下気道の粘膜内層液 (MLF) をサンプリングして鼻粘膜および気管支の吸収の技術の使用について説明します。これらのメソッドより標準化と既存の呼吸サンプリング手法よりも忍容性を提供します。

ビデオ: Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

医学

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

遠隔実験システム管理: 呼吸器ウイルス診断

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

ヒト鼻上皮オルガノイドの培養とイメージング

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

A Traditional Chinese Medicine Characteristic Therapy for Bronchial Asthma: Moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest tightness, or cough, as a result of increased airway reactivity. With high diurnal variation, these symptoms often occur or worsen at night or in the morning. By burning and roasting the Chinese medica above human acupoints, moxibustion is a type of treatment that stimulates the activity of the human meridians through drugs and heat stimulation to prevent and treat diseases. According to the principle of syndrome differentiation and treatment of traditional Chinese medicine, acupoints are selected on the corresponding parts, which has a definite effect. It is regarded as a characteristic traditional Chinese medicine therapy for bronchial asthma. This protocol elaborates the methods and steps of patient management, material preparation, selection of acupoints, operation, and postoperative nursing to ensure safe and effective moxibustion treatment to significantly improve the clinical symptoms and quality of life of patients with bronchial asthma.

This protocol presents a curative procedure of moxibustion in treating patients with bronchial asthma.

気管支喘息に対する漢方薬の特徴的な治療法:灸

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest ...

空間オミクス解析のための口腔粘膜下線維症組織サンプルの採取

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

著者スポットライト:経口潜在的な悪性腫瘍の謎を解き明かす 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる口腔粘膜下線維症サンプルからの形態学的および空間的情報による細胞の分離

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

Methods Article

鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング