MALは、JCG、およびMRSはエネルギー契約の米国務省は、＃DE-AC02-05CH11231、監督研究開発NIA（R00AG033176とR01AG040081）および研究所によってサポートされています。

1。組織の処理と消化<ol><li>外科的処置から廃棄材料として人間の乳腺組織を取得します。削減mammoplastiesは正常または良性細胞を提供することができます。線維腺腫とgynecomastiasは良性細胞を提供する、非腫瘍乳房切除組織（末梢または腫瘍と反対、または皮下）ノーマルからmicrotumorsを含有することに良性の範囲とすることができる細胞を提供する。適切なIRBの承認が廃棄材料を取得する前に存在していることを確認します。すべての材料は、血液媒介病原体の規制の下で扱われるべきである。 </li><li> 100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのファンギゾン、50U/mlポリミキシンBを補充バッファまたはメディア（ 例えば 1時01ダルベッコ改変イーグル培地とハムF-12）を含有する滅菌容器に入れ材料および10％ウシ胎児血清、および4の実験室への輸送℃まで削減乳房形成組織を大幅にsuコマンドに影響を与えることなく、72時間、4℃で保存したり、出荷することができますbsequent細胞の生存。非縮小乳房形成組織の小片は、より迅速な処理を必要とするかもしれません。 </li><li>滅菌メス、鉗子、はさみの組み合わせを使用して脂肪組織、結合組織と血管の間質マトリックスから上皮領域を分離する。大きなガラス滅菌シャーレ（ 例えば 、150ミリメートル）でハサミと場所との組織片を切り取ります。優しくひどく脂肪物質を削り取るための材料とメスを保持するために鉗子を使用して、黄色く間質マトリックス中に埋め込まれた白いストランドとして表示上皮領域を、ばらばらにする。消化を促進するために、50mlの試験管に反対メスや場所を使用して3〜4ミリの小さな部分に上皮組織を切った。組織は大量の処理されている場合は、新鮮なメス刃が必要になることがあります。制度上の規制に従って処分に皿から脂肪物質を取り除きます。 <ol class="lalpha"><li>重く線維性組織（ 例えば 、皮下MAS重度の線維嚢胞性疾患を持つtectomies）、よりソリッド白、非上皮性物質が存在します。それはそのような繊維状マトリックスからの上皮細胞をばらばらにするのは難しいかもしれません。繊維状物質の大部分は、エリア1〜3 mm角の〜とは別に消化される小さな断片に切断することができる。 </li></ol></li><li>チューブの体積の3分の1よりも大きいを含まない組織とコニカル遠心チューブ（50 mlまたは15ミリリットル）に解剖上皮組織を置きます。組織消化混合物（DME/F-12または同等、10μg/ mlのインスリン、上記のような抗生物質、および10の最終濃度を用いて、回転中に混合を可能にするためにわずかな空気のスペースを残して、フルボリュームにチューブを持ち出す％FCS、200 U / mlの粗製コラゲナーゼおよび100 U / mlのヒアルロニダーゼ。 </li><li>プレースHulaMixerチューブローテーター上管および37℃で一晩8 rpmで360°回転℃に</li><li> 5分間、600×gで遠心する。処分協定のための上澄みの脂肪と媒体を捨てる制度的な規制にING。 </li><li>培地中のペレットの小アリコートを希釈することにより、消化が完了するのを確認してください。顕微鏡検査がスムーズに見える、歯槽管、または接続された間質（ 図1A）から無料で膵管肺胞構造を持つ細胞（オルガノイド）の塊を示すとき消化は完了です。削減乳房形成組織は通常まだ一晩消化した後に添付された間質が表示され、追加の消化時間が必要になります。 <ol class="lalpha"><li>別の4から12時間37℃で回転と新鮮な組織消化混合物と再インキュベートで不完全消化ペレットを再懸濁します。手順1.6と1.7を繰り返します。消化がまだ不完全である場合には、再度37℃で一晩回転でペレットと再インキュベートする消化混合物を追加します。酵素の濃度は一晩過消化を防ぐために減少させることができる。 </li></ol></li><li>消化が完了すると、5分間600×gで遠心する、ダイジェストを吸引約15 ml/50 mlチューブ、5 ml/15 mlチューブで媒体プラス抗生物質のイオン混合、ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 2。消化された物質の濾過及び凍結<ol><li>滅菌した50mlチューブオーバー滅菌100μmのストレーナーに再懸濁ペレットのアリコートを転送します。チューブに培地ドレインせてから、培地の2-3 mlの上位1-2X倍にオルガノイドを洗い直す。再懸濁ペレットのすべてが転送されるまで繰り返します。フィルタおよび媒体上にあまりにも多くのオルガノイドがある場合は、もはや簡単に排水せず、残りの材料のための新しいフィルタ（複数可）を使用しています。慎重に別の滅菌チューブの上にフィルタ（複数可）を反転させると、より培地をチューブにオルガノイドを洗う。これは、100μmのオルガノイドプールです。 </li><li>元の50mlチューブに排出物質を取るとほとんど胞構造が含まれている40μmのオルガノイドプールを得るために、40μmのストレーナーを使用して2.1のプロセスを繰り返します。番目に排出物質電子管は、間葉と上皮細胞と血管系の小片のシングル/小さな塊が含まれているろプールを構成している。 </li><li> 5分間、600×gでペレットは、100μm、40μmとし、濾液プール。 </li><li>パックされたペレットを0.1mlあたりCPMII約1mlを使用して、CPM II（44％FCS、および6％DMSOによるDME/F-12または同等品）で上清を、再構成するそれぞれのチューブを吸引します。 4℃に保つ</li><li>下記の3.2のようにドロップすることによって35mmの組織培養プラスチック皿のドロップに再懸濁した材料の0.1ミリリットルを配置することによって、シード2オルガノイドプール用のテスト皿を。濾液プールは直接線維芽細胞培地（10μg/ mlのインスリンおよび10％FBSを含むDME/F-12または同等品）を用いて組織培養プラスチック上に播種することができる。 </li><li>アリコートヌンク型凍結アンプル（1ミリリットル/ 2ミリリットルのアンプル）に再懸濁し、残りの材料。 -80℃で一晩凍結し、液体窒素中でストレージに速やかに転送します。私たちは、生存率の有意な損失が確認されていません当社独自のアンプルに、1970年代後半以来、凍結保存。 </li></ol> 3。冷凍オルガノイドと初代培養の継代培養を播種<ol><li>素早く37℃の水浴中でオルガノイドを含む凍結アンプルを解凍します。アンプルでオルガノイド数の目測に応じシード2から10にオルガノイド（通常〜6）60ミリメートル皿、または1-3の100mm皿、。約60 mmディッシュに播種当たり20から40オルガノイドは最適です。 </li><li>解凍しオルガノイドを慎重に配置され、オルガノイドを均等に分配するために1ミリリットルピペットやパスツールピペットを用いて皿の表面に、一滴ずつ。一緒に近くに配置オルガノイドは、継代培養や凍結のための少数の細胞を生じさせる、伸長のための限られたスペースを持つことになります。 （細胞が過去の傷の表面を成長させない傾向がある）皿の表面を傷つけないように注意してください。オルガノイド添付し、その後徐々にオルガノイド（ 例えば、2月3日ml/60 mmディッシュ）外れを避けるために増殖培地を追加できるようにするために1〜2分待ちます。私37℃で加湿CO 2インキュベーター内でncubate。これらは初代培養されています。我々は現在、最も堅牢なHMEC成長（ 図2）M87A +オキシトシン（X）の培地を使用しています。 </li><li> 1日後、オルガノイドが取り付けられていることを確認します。追加の媒体（ 例えば、2月3日ml/60 mmディッシュ）を追加します。オルガノイドから細胞遊走は、播種後48〜72時間（ 図1B、C）で24〜48時間、および細胞分裂伸長によって表示されるはずです。ときどき添付ファイルは、特に年配の女性からoverdigestedオルガノイドまたはオルガノイドをめっきした場合、24時間後に貧しいですが、ほとんどの準備は72時間以内にアタッチされます。血管系の小片は、添付して、線維芽細胞の増殖（ 図1D）を生じさせることができる。 </li><li>文化を少なくとも週3回を養う。 M87A型媒体で培養した細胞は、播種密度に応じ、5-8日以内に近く合流に成長。 </li><li>に基づいて、重要な線維芽細胞成長、微分トリプシン（DT）は、存在する場合表面のプラスチックからの繊維芽細胞の急速な離脱は、線維芽細胞を除去するために必要とされる。上皮パッチはSTE（生理食塩水、0.05％トリプシン、0.02％EDTA）、吸引と大きく、吸引メディア、洗浄皿（ 例えば 、1〜ml/60 mmディッシュ）になると、室温で新しい0.5 mlのSTEを追加して残す連続的な顕微鏡観察で1分程度のため。線維芽細胞は切り離すが、上皮細胞が優しく、まだ付着しているが、急激に線維芽細胞を取り除くために、ハード面に対して皿の側面をノックしてからすぐに吸引した場合。 PBSで1回洗浄し、再度吸引します。ひどく汚染された線維芽細胞と文化が追加DTが必要な場合があります。 </li><li>大型上皮パッチが存在している初代培養を継代培養が、合流する前に。オルガノイド播種および添付ファイルの密度が必要な時間に影響を及ぼすであろう。初代培養を維持するには、時間をかけて等間隔に複数の二次培養液を生成するためには、部分Trypsinizations（PT）を実行します。 </li><li>吸引メディアは、皿に0.5ミリリットル新鮮STEを追加し、1〜2 mlのSTEと60ミリメートル皿を洗う。細胞の剥離を促進するための皿の穏やかなノッキングで、1から5分間室温で顕微鏡下で細胞の剥離を観察します。細胞の約50％が外れたときにトリプシン処理を停止する必要があります。初期のPTは通常、迅速な細胞剥離があります。すべての細胞はすぐにオフに来るかもしれないように、後のPTのために、細胞を、注意深く監視して、より速く剥離のために37℃で配置することができます。 </li><li>皿に血清含有培地の2 mlを加え、repipetteは洗浄し、滅菌した15mlチューブに転送します。チューブに洗浄を追加し、別の〜1-2 mlの培地で2回繰り返します。主要な皿を再供給するとインキュベーターに戻ります。血球計付きチューブに細胞をカウントする。一度継代培養し、細胞がLOません; PTをプライマリー料理や継代培養や凍結セカンダリ（第二通路細胞がセカンダリと呼ばれるから同等の長期的な成長の良好な細胞成長により4から8回程度繰り返すことができますnger原色）。一度オルガノイド物質はもはや初代培養に存在していない、継代培養セカンダリーは、長期的な集団倍加電位の低下を示す。 </li><li><ol class="lalpha"><li>皿にチューブから直接セカンダリー、種細胞に継代培養した。そのようなM87A + Xなどの堅牢な培地中で1〜2×10 5 cells/100 mmディッシュの播種と4-7日で合流につながる。私たちは、増殖能を高めるために第二通路で培地にコレラ毒素を追加し、それがオルガノイドから重層化細胞の増殖につながるため、コレラ毒素は、初代培養では省略されている。 </li><li> 5分間600 xgでセカンダリー、ペレット管として凍結のため、10 6細胞/ mlの最終濃度とCPMIIに再懸濁する。アリコートは、ヌンク型凍結アンプルに細胞を再懸濁し、-80℃で一晩凍結℃、その後液体窒素でストレージに速やかに転送します。 </li></ol></li><li>これは、保管のための最初のPTから細胞を凍結することをお勧めします、と継代培養のための第二PTからの細胞を使用しています。追加のPTは、将来の使用のために凍結保存することができます。 </li></ol>

<ol>
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特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示され、人間の乳房組織の処理方法は、人間の乳房の細胞型の異種混合物から純粋な乳腺上皮細胞を得ることができます。固定サイズの孔を通って濾過が消化された間質マトリックスから乳腺の異なる画分（ 例えば 、乳管や膵管-歯槽対肺胞）を分離することができます。同質乳腺線維芽細胞は、上皮細胞に一致するように求めることができる。凍結消化された物質は、30年以上に渡って良好な生存能力を保持しています。このメソッドは、すべてが、非常に繊維質の乳腺組織で正常に働いて、実行するのは簡単ですしています。乳腺組織の処理の他のバリエーションは、現実的な、きれいな、または分離されている上皮画分を提供していませんが存在しています。そのようなM87Aなどの低応力誘発メディアと文化の中で処理さオルガノイドの配置は複数系統マーカーでHMECの長期的な成長を可能にします。まだ属する能力を保持しているプラ​​スチック上で培養されたHMEC生体のような系統関係における法線とteの3D構造。これらHMEC培養は通常HMEC行動や老化およびトランスフォーメーションを推進するまたは阻害する可能性のある要因についての高スループットなど、豊富な実験調査に適している。

<table border="1"><tbody><tr><td>ガラスシャーレ15センチメートル</td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td>はさみ6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td>鉗子8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td>使い捨て外科用メス</td><td> Miltex </td><td> 4から411 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td>インスリン</td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin /ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td>ポリミキシンB硫酸塩</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td>トリプシン0.05パーセント100ミリリットル</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 159-20D </td></tr><tr><td>セルストレーナーは100μm </td><td> BDファルコン</td><td> 352360 </td></tr><tr><td>セルストレーナー40μmの</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td></tr><tr><td>チューブ15ミリリットル</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 188から261 </td></tr><tr><td>チューブ50ミリリットル</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 227から261 </td></tr><tr><td> TC皿10センチメートル</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 664から160 </td></tr><tr><td> TC皿6センチメートル</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 628から160 </td></tr><tr><td>極低温バイアル</td><td>ナルゲン</td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td>ハウザー·サイエンティフィック</td><td> 1490 </td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフモデル</td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

正常ヒト乳腺上皮細胞（HMEC）の動作方法と、正常な細胞が異常な性質を獲得の実験的検討では、in vivoで生物学のそれより正確にモデルのin vitro培養系によって促進することができる。細胞分化を研究するためのヒト由来の材料を使用することは、加齢、老化、および不死化は1-2人間と一般的に利用さげっ歯類の細胞間で、これらのプロパティの多くの重要な分子の違いが与えられたが特に有利で ​​ある。正常と異常組織が大量に削減乳房形成や乳房切除手術の周波数による使用可能であるため、乳腺細胞が便利なモデルシステムを提示する。 乳腺は、多くの異なる細胞型、 例えば 、上皮細胞、脂肪、間葉、内皮の複雑な混合で構成されています。上皮細胞は、泌乳期乳腺の分化機能を担当しているまた、ヒト乳癌の大部分の起源である。私たちは純粋な上皮成分にだけでなく、間葉系細胞を3乳腺外科廃棄組織を処理する方法を開発した。処理された材料は、無期限に凍結保存、または初代培養に開始することができます。外科廃棄材料が実験室に輸送して、手動で上皮含有組織を濃縮するために解剖されています。基底膜における上皮からコラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼストリップ間質材料を用いた解剖組織のその後の消化。上皮ツリーの結果小片（オルガノイド）は、固定孔径のメンブレン上の順次濾過により消化ストロマから分離することができる。細孔の大きさに応じて、画分を大きく肺胞/腺管部分、小さい歯槽クラスタ、または間質細胞から成る得ることができます。培養はオルガノイドとしてではなく、DISとして開始されたときに我々は優れた成長を観察しているsociated単一細胞。低応力誘導培地を用いて培養におけるオルガノイドの配置では、複数の系統型（筋上皮、管腔、前駆）4-5のマーカーを用いて正常なHMECの長期的な成長をサポートしています。細胞が十分な数は、広範な実験的な標準化された細胞のバッチを使用して検査だけでなく、高スループットのモダリティを用いた尋問を許可するために1個の組織から得ることができる。 培養HMECは正常な成長、分化、老化、老化を支配するプロセス、およびどのようにこれらの通常のプロセスは不滅と悪性形質転換4-15,16時に変更されているを調べる研究のさまざまな分野で用いられてきた。細胞外マトリックス物質の存在下で成長、他の細胞型、および/ ​​または3D文化の影響は、プラスチック5,15上での成長と比較することができます。培養HMECは、正常細胞から始まり、その要因を調べるために実験的に扱いやすいシステムを提供人間の老化と発癌を推進または防ぐかもしれません。

適切オルガノイドに消化し ​​、培養物中に置かれた組織のための代表的な数値は、 図1に示します。不完全に消化された組織は、まだこれらの構造体の外側に取り付けられた材料が表示され、可能性が高いDTは削除する必要が、初代培養におけるいくつかの線維芽細胞増殖を持つことになります。 Overdigested組織が少なく滑らかな外部の境界線を表示され、初代培養でアタッチに時間がかかる場合があります。上皮性増殖は48〜72時間（1B、C）内で開始する必要があります。血管系（1D）の小片は、間葉系細胞の増殖の原因となることができます。上皮の増生は筋上皮、先祖に関連するマーカーを持つ細胞、および管腔系統（1E、3C-E）の混合物を含む増殖集団で、形態学的に不均一な集団を示しています。コレラ毒素およびオキシトシンを補充などM87Aとして低応力メディアの成長は長期的に優れたサポートしています前のメディア製剤（ 図2）と比較して、通常のプレうっHMECの成長。 M87A型メディアも通路4-8（ 図3C-E 4）を介して管腔側細胞と前駆細胞の増殖をサポートする、その後はほとんどの細胞は筋上皮のみ系統マーカーが表示されます。プラスチック上で培養HMECは筋上皮細胞（ 図4A、B）への内部管腔の細胞を用いて、マイクロパターン3Dマイクロウェル内自己組織化適切な3Dを形成する能力を保持することができ、マトリゲル（4C、D）に播種したときに組織化された構造を形成する。 <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 HMECオルガノイドと初代培養（A）オルガノイドは消化管、濾過後、肺胞の構造を示す。 （B、C）が2日、初代培養で配置した後に乳管および肺胞構造を示すオルガノイドは、先頭セルoutgrの点に注意してください。owth（白矢印）。 （D）は小血管は、AとB、Cと同じ培養から線維芽細胞の増殖を開始すると接続されている4日後にプライマリオルガノイド培養から（E）の上皮細胞の増殖。系統はK14（赤）とK19（緑）に対する抗体で染色することにより識別され、核はDAPI（青）で染色した。腔側（K14-/K19 +緑）、筋上皮（K14 + /-K19、赤）、および前駆（K14 + / K19 +黄）細胞が見えます。染色されていない細胞は不完全抗体の浸透に起因オルガノイドコアで観察されています。 <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 1個、184検体から得られた様々なメディア製剤におけるHMEC培養物の増殖。オルガノイドは異なるメディア製剤を用いて初代培養に開始された。最良の長期的な成長は、私たちの最新の製剤、M87A +オキシトシン（X）は4を使用して得られる。この媒体はまた、サポートしています複数HMEC系統の成長（図1E参照）。以前のメディア製剤は、MM 3は少なく力強い成長を提供し、一方、無血清培地、MCDB170（商用MEGM）ラピッドサイクリンキナーゼ阻害剤p16 INK4aの誘導および7,11,13異常細胞の選択〜17リード。 <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> 図3。 4 回目の継代培養されていないオルガノイドおよび培養HMECにおける系統の多様性の比較 （A、B）EpCAMとCD49f/alpha 6インテグリンの（A）の発現のための教養のない、酵素的に解離オルガノイドのFACS分析、および（B）CD227/Muc1とCD10/CALLA。 （C）EpCAMとCD49f/alpha 6インテグリンを発現させるための（C、D）の4 番目の通路プレうっHMECのFACS分析、および（D）CD227/Muc1とCD10/CALLA。識別可能な電話opulationsはLEP（腔側マーカーEPCAMまたはCD227を発現する）、MEP（筋上皮マーカーCD49fまたはCD10を発現する）、またはPROG（CD49f + / EPCAM +集団に富む）として分類されます。 EpCAMとCD49f変化の文化の規制への適応時に教養のないオルガノイドに比較することに注意してください。 （E）はソートされていないHMECと4 番目の通路でFACS富むLEPとMEPは、系統の識別を検証するためにケラチンK14のMEP（マーカー）とK19（LEPマーカー）の免疫蛍光分析のために染色。 DAPIで染色された核は青色で表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> 図4。培養HMECは適切な微小環境に置かれたときに生体のような系統関係にあると組織化された構造を形成することが可能である。（）プリうっ血4 番目の通路HMECはFACSに富んだ私でしたNTO腔側LEPと筋上皮のMEP系統（図示せず）は、K14とK19の発現によって検証されたこれらの系統で、CD227およびCD10のマーカーを使用しています。 （B）は、マイクロウェルマイクロパターンで一緒に混合すると、培養した細胞は、外部と内部のLEPのMEPとの二重層に自己組織化することが可能であった[シャンソンらから適応。5]。蛍光標識されたLEP（緑）とMEP（赤）は共焦点0時間、24時間で顕微鏡、およびマイクロウェル（上側）に加えて48時間後に撮像した。制御HMECは任意に赤または緑の蛍光標識（下）で標識した。 （C）は、FACSに富む前駆細胞の明視野像（CKIT +）3D（マトリゲル）培養に播種し、18日間生育させた。得られた構造は、肺胞の形態形成を示すことができる。 （D）の構造は、マトリゲルから抽出およびK14とK19を検出するために染色した、核をDAPIで対比染色した。免疫蛍光分析は正しかっ腔側と基底ポーラで組織構造を示しているrity。

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

ヒト乳腺外科廃棄材料を処理する方法が記載されている。オルガノイドの形で処理された組織は、無期限に凍結したり、長期的な成長のための文化に入れ保存することができます。この方法は、実験的な正常なヒト上皮細胞生物学の検査、および外因性の摂動の効果を可能にします。

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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16.5K ビュー.  Lawrence Berkeley National Laboratory. ヒト乳腺外科廃棄材料を処理する方法が記載されている。オルガノイドの形で処理された組織は、無期限に凍結したり、長期的な成長のための文化に入れ保存することができます。この方法は、実験的な正常なヒト上皮細胞生物学の検査、および外因性の摂動の効果を可能にします。

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

医学

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

人間の前庭神経鞘腫の初代培養

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

トランスレーショナルがん研究のためのヒト組織での作業

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Methods Article

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理