ジカやエボラウイルスなどの最近の流行の急増は、世界規模でより協調的で軽快な対応の必要性を強調している。これを達成するために、我々はそのような発生時に世界中の資源制約地域で使用される革新的でスケーラブルな、内部モーダル実験室ユニットを設計しました。ここでは、モーダル、拡張可能なモバイル出荷コンテナ研究所を紹介します。
そして、以下の論文では、BSL-2とBSL-3のアプローチを呼吸器インフルエンザウイルス診断に紹介します。RCT-PCRによる迅速なインフルエンザウイルス診断設置された実験室ユニットに入る準備をする前に、BSL-2の安全要件をすべて考慮する必要があることに注意してください。
これには、適切な個人用保護具付きのドレッシング、手洗い、手袋の着用、使用する予定のワークスペースの除染が含まれます。あなたのワークスペースや供給を除染するために漂白剤を使用する場合は、漂白剤が有毒な煙を作成するためにワークスペース内の他の化学物質と混合することができるので、漂白剤にさらされたすべての領域をきれいにするために70%エタノールを使用する必要があります。すべての漂白剤製品を独自の指定されたゴミ箱に処分します。
サンプル綿棒は患者から採取され、現場または診療所から実験室施設に運ばれ、パススルーウィンドウを介してラボ技術者に渡されます。このウィンドウは両側から開くことができません。BSL-2パススルーウィンドウでは、サンプルを含むチューブの外部表面を漂白剤で完全に消毒し、2分間座るために放置する必要があります。
パススルー・ウィンドウを開き、登録するサンプルを収集します。漂白剤の残骸を含むサンプルを拭き取り、パススルーウィンドウの内部を漂白剤で拭き取り、続いて70%エタノール溶液を拭き取ります。各サンプルチューブにバーコードを追加し、アリコート用に指定された4つの空のチューブを追加します。
サンプルをベントフードに移動します。各チューブのバーコードをスキャンし、適切なサンプル識別情報がタブレットベースのシステムまたはラップトップ画面に表示されることを確認します。登録プロセスを完了します。
サンプルアリコート。試験管に標識が付いたら、認定および除染クラスIIバイオセーフティキャビネットを使用してサンプルのアリコートを採取します。アリコートを取るときは、各サンプルに新鮮な無菌または使い捨てのピペットを使用し、クロス汚染を避けるためにバイオ有害廃棄物容器に廃棄してください。
すべてのチューブが密閉されていることを確認してください。即時抽出のために標本ごとの1つのアリコートを利用しなさい。将来の使用のために冷凍庫に他のアリコートを保管してください。
ワークステーションに移動する前に、漂白剤と70%エタノール溶液が続くすべてのワークスペース表面と機器を洗浄してください。バーコード PCR サンプルをアリクォートしたら、抽出用に指定されたワークステーションに移動します。リシスステップ用のバッファー AVL キャリア RNA 混合物を準備します。
サンプルおよびリシスバッファーマスターミックスは室温で保つべきである。1.5ミリリットルの遠心分離チューブにラベルを付けます。ピペットチップを560マイクロリットルに設定します。
きれいなピペットチップを塗布します。各チューブにリシスバッファーを追加します。廃棄物容器の先端を捨てます。
次に、PCR アリコートサンプルを取ります。アリコート1用に指定された準備されたリシスバッファーチューブに入れ、追加のサンプルに対してこれを繰り返します。古いピペットの先端を捨て、きれいなピペットの先端を適用します。
きれいなピペットチップを塗布します。140マイクロリットルのバッファーをコントロールチューブに加えます。各チューブをしっかりと閉じます。
パルス渦を15秒間。追加のアリコートまたはサンプルを使用して繰り返します。各サンプルを5秒間マイクロ遠心分離します。
室温で10分間インキュベートします。10分後、チューブを少し遠心分離して、各チューブの蓋の内側から滴を取り除きます。サンプル1に560マイクロリットルのエタノールを加えます。
ピペットチップを交換します。残りのサンプルまたは追加サンプルを繰り返します。各サンプルチューブをしっかりと閉じます。
各サンプルのパルス渦を15秒間サンプルを5秒間マイクロ遠心分離します。きれいな2ミリリットルのコレクションチューブを得る。
スピン列を追加します。サンプルに合わせてラベルを付けます。サンプルの630マイクロリットルをそれに応じてカラムに合わせて移します。
キャップを固定します。遠心分離機に移動します。サンプルを遠心分離機に均等に分配します。
6000 gで遠心分離機を1分間、リシスバッファーを除去する。ワークステーションに戻ります。あなたのコレクションの管を取り替えます。
残りのリシスバッファーを追加し、遠心分離ステップを繰り返します。元のアリコートサンプルチューブを捨て、その後、溶出液を処分し、スピンカラムをバッファAW1で洗います。すべてのサンプルまたは追加のサンプルでこの手順を繰り返します。
各サンプルのキャップを固定し、遠心分離機を6 gで固定します。20gで2番目の洗浄バッファAW2で繰り返します。最後に、カラムを清潔な1.5ミリリットルのチューブに入れます。
カラムを開き、60マイクロリットルのバッファーAVEを加え、室温で1分間インキュベートし、6 gで遠心分離機を1分間インキュベートします。サンプルは、PCR 分析の準備ができました。
BSL-3条件下では、実験プロトコルは同じままですが、安全対策は何よりも前例があります。BSL-3ラボに入る前に透明な窓から見て、グローブボックスユニットに負圧が確立されていることを確認してください。壁のボールが見える時に負の圧力が確立していることは明らかでしょう。
負圧が確立されたらドアを開け、単位に入ります。すぐに手を洗ってからPPEチェックリストに進んでください。次の順序でPPEに置くことに進みます:手袋、ガウン、靴カバー、マスク、フェイスシールド、手袋の第二のペアの下。
機械の電源を入れ、グローブボックス内の圧力を安定させます。漂白剤スプレーソリューションを使用して、グローブボックスの内側と外側で使用する予定のすべてのエリアと電源を除染します。漂白剤のみの容器に漂白剤廃棄物を処分します。
70%エタノール溶液を使用して、漂白剤が使用されているあらゆる領域を洗浄してください。パススルーウィンドウを介してサンプルを転送します。サンプルは、漂白剤溶液を噴霧し、BSL-3ユニットの内部でそれらを受け取る前に、パススルーで少なくとも1分間放置する必要があります。
次に、BSL-3ユニットの内部でサンプルを受け取り、登録とラベリングのステップに進む前に、それらを徹底的に清掃してください。サンプルを登録してチューブにラベルを付けたら、エアロックトレイを介してサンプルをグローブボックスに入れます。両方のドアを同時に開けないでください。
安全上の注意のために、2つの異なるステップで各ドアを開閉します。サンプルをグローブボックス内部に安全に移動したら、グローブボックスにサンプルアリコートを作成する場合と同じ手順に従います。サンプルがアリクォートされたら、サンプルを気密容器に移動させます。
グローブボックス内に漂白剤溶液をスプレーして、チューブやその他すべての表面を除染します。5分間待ってから、70%エタノール溶液を塗布して漂白剤を洗浄します。徹底的な除染後、リシスのPCR分析に必要なサンプルのみをグローブボックスに戻します。
グローブボックスでは抽出手順のみのリシスステップを実行します。細胞を取り付けたら、各サンプルのキャップをしっかりと密封し、加圧エアロック通路に入れる。漂白剤に続いて70%エタノール溶液で再びグローブボックスを除染します。
サンプルをグローブボックスから移動し、抽出手順の残りのステップのためにワークステーションに転送します。抽出後、サンプルをパススルーウィンドウに転送して PCR 分析を行います。サンプルを取り外して転送した後、ラボワークスペースをグローブボックスの外に除染します。
PPEを取り外す前に、ユニットの空気循環が適切な数のフィルタリングサイクルに達するまで待ってから、PPEを取り外してください。PPE廃棄物容器に全PPEを取り出して処分した直後に、ユニットを出る前に石鹸と水でラボシンクで手洗いに進みます。PCR増幅および検出。
抽出したRNAサンプルをパススルーウィンドウから取り出します。1.5ミリリットルチューブに、対象となるアッセイごとに次の成分を含むマスターミックスを準備します:水、プライマーとプローブ、アタック混合物、および2Xバッファー。渦とスピンマスターミックス、その後、ストリップチューブのそれぞれにマスターミックスをアリコート。
マスターミックスを準備したら、推奨温度でPCRキットを保管してください。各ストリップチューブの間に別々の先端を使用して、各ストリップチューブにサンプルを追加します。1,500 rpmで1分間サンプルをスピンし、その後、サンプルをリアルタイムPCRユニットにロードする準備が整います。
サンプルが PCR 装置にロードされると、1 回の実行が完了するまでに約 90 分かかります。リアルタイムPCRアッセイは、ウイルスの強い検出のための高感度な方法です。これは、PCR 分析結果というラベルの付いた表で確認できます。
結果を収集してラボを離れる前に、PPE を削除し、次の診断テストに備えて各ワークステーションを適切に除染してください。代表結果。実験室のワークフローは、個人の保護を重視した図で表されています。
インフルエンザの迅速な診断テストは、RT-PCR分析によって行われます。この手順は 4 つの主要な手順で構成され、プロトコルの各ステージに個別のワークスペースが割り当てられます。このプロジェクトの目的は、新しいモジュール式の急速に展開可能な実験室施設を検証し、我々はこれを成功させただけでなく、流行や流行の間に低資源環境で働く実験室職員のためのトレーニングプログラムを開発することです。
