著者は、彼女の役に立つ議論のため杉本亜砂子博士 (東北大学) を深く感謝します。wyIs251は、博士カン沈 (スタンフォード大学) からの寛大な贈り物だった。mnIs17は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この作品は、日本学術振興会科研費補助金 #17 H 05010 #16 H 06536 と第一三共の財団、脳科学財団と当財団によって支えられました。

1 です。 サンプル準備 <ol><li>生成トランスジェニック c. の elegans 遺伝子導入方法論 18 を使用して興味のひずみ。また、線虫 の遺伝学センター (CGC) から適切な株を取得します。シナプス小胞前駆体の軸索輸送を視覚化する形質転換線 wyIs251 を使用して、[Pmig-13::gfp::rab-3] 7。IFT を観察するには、形質転換線 mnIs17 [osm 6::gfp] 19 を入手します。これらの系統はこのプロトコルで使用されます 。
	注: いずれか染色体外配列、ゲノムの統合またはも GFP ノックイン作品。バック グラウンド信号を減らすためには、細胞特異的発現プロモーターではなく、パン神経プロモーターを使用します 。
	注: ワームのメンテナンスは、他のプロトコルの 20 の説明です。系統は線虫の Escherischia 大腸菌 OP50 フィーダーの芝生の中 (NGM) 板 (1.7% (w/v) アガロース、50 mM NaCl、0.25% (w/v) ペプトン 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL コレステロール、25 mM KH 2 PO 4、1 mM MgSO を維持されました。60 mm 径プラスチック皿に 4) 20 ° c.</li>
	<li>成長がワームのすべてのライフ サイクル ステージに NGM プレートに 20 ° C でワームします 。
	注: いずれかの任意の段階で軸索輸送および IFT を観察できます。これらの段階および視覚化された人身売買イベント 14 , 21 , 22 複数のパブリケーションを使用しているために、若い成人後期 L4 は良い肯定的な制御 、 23.</li>
</ol> 2。10% の Agarose 注: 多くのベンダーは、寒天、寒天粉末、アガロースなどの同様の製品を提供します。電気泳動グレード agarose を使用 (ゲル強度 &#62; 1200 g/cm 2)。結果ゲルがワームを固定するには十分に強いではないため安い寒天粉末は機能しません。
<ol><li>ミックス 0.4 g アガロース 4 mL の蒸留水 (DW) ガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm)。蒸発を避けるためにガラス管にふたを置いた</li>。
	<li>は、90 分の 95 ° C の熱ブロックにガラス管を置きます。さらに、別のガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm) が DW でいっぱいを準備し、95 でそれを維持 ° C を入れて 95 ° C DW ( 図 1 A) パスツール ピペットで移しなさい。たくさんの小さな泡が agarose チューブに見られるし、ソリューションが混濁する必要があります。ソリューションが明確になるまでそれを残します。アガロース溶液が均一になるまで上下にピペッティングで混ぜます 。
	注: DW とアガロースゲルから作られたとき 10% アガロース溶液を準備する電子レンジは使用できません。電子レンジによる微小気泡は、アガロース融解を防止します。ただし、凝固の 10% の agarose のゲル溶かすことが簡単にできる電子レンジを使用しています。10% の agarose のゲルを含んでいるガラス管を事前に準備し、少なくとも 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます。そう場合は、必要なときに電子レンジを使用して素材を溶かすこのプロトコルの手順 3 から開始しています 。
	注: Agarose は徐々 に、長時間または繰り返し凝固と融解後 95 ° C で培養した場合を固める能力を失います。この場合、新しい 10% の agarose を準備します</li>。
</ol> 3。アガロース パッドの準備 <ol><li>76 x 22 mm スライドの 10% の agarose の 2 滴を置く準備手順 2.2 で温めたパスツール ピペットを使用しています</li>。
	<li>すぐに agarose ドロップする前に 2 番目の 76 x 22 mm 2 スライド カバー硬化アガロース溶液を平らにする 2 番目のスライドの下 の図 1 B、およびプッシュに示すよう。厚さは 0.5-1 にする必要があります mm</li>。
	<li>すぐにフラッシュ パスツール ピペット ピペット 95 ° c DW 上下アガロース溶液を洗いまで。そうでなければ、ピペットが agarose のゲルを詰まりになります。95 ° C DW でピペット立っているのままにします</li>。
	<li>1 分待ちます。アガロース パッド形成し、曇りになります。次に、( 図 1 C) の手によって離れてスライドをスライドです</li>。
</ol> 4。ワームの取り付け 注: ワームの動きを少量でもよい観察を防ぐため。レバミゾールは agarose パッド 24 , 25 でワームの動きを防ぐために伝統的に使用されています。しかし、レバミゾールは c. の elegans の神経受容体を阻害する、したがってニューロン 15 で人身売買イベントに影響を与える可能性があります。以下良い代替 17 ポリスチレン ビーズを使用して記述されている。
<ol><li>摺動自在ミラー透視を搭載したステレオ顕微鏡、下 ~ 30 新しい NGM に適切なマーカーを表現するトランスジェニック ワーム プレート白金細線を用いた細菌を選ぶことがなく転送します 。
	注: プラチナ ワイヤー ピックの白金線とパスツール ピペット (5 インチ) で、白金線の先端が平坦化されました。プラチナ ワイヤー ピックの準備およびこれらのワームの処理、Wormbook (http://www.wormbook.org) で説明します</li>。
	<li>プレートを残して 1 分の細菌が自動的に削除されますワームの表面からワーム移動細菌なし NGM agarose のゲルと</li>。
	0.5 〜 1.0 を入れて <li>μ L は、2.6 %100 nm 径ポリスチレン ビーズ水寒天パッド ( 図 1 D) 上でのドロップします。細菌無料 NGM プレートから、ミクロ粒子のニキビトリートメントに 10-20 ワームを転送します。ドロップとの重複を避けるために白金線を使用してワームを選択広がりワームの体 ( 図 1 E).</li>
	<li>22 × 40 mm 2 coverslip ( 図 1 F) が適用されます。空気の泡を削除が、粉砕のワームを避けるために押し込みます。サンプルは画像の準備ができて、今 。
	注: ため、麻酔を投与すると、ワームが寒天パッド、ポリスチレン ビーズ、coverslip 17 によって生成された摩擦力だけで固定されます。フィーダーの細菌および/またはあまりにも多くのソリューションの存在が、摩擦力が弱いです 。
	メモ: 異なるサイズ coverslips (例えば 22 x 22 mm 2 18 x 18 mm 2) の動作します。ただし、大きい coverslips の浸漬水や観測期間中のサンプルに漏れ対物レンズから油を防ぐことができます</li>。
</ol> 5。観測 注: 各顕微鏡システムとカメラの適切な撮像パラメーター (レーザー出力、利得、ビニング、等) は異なります。ここで、回転のディスク共焦点スキャナーとデジタル CCD カメラを搭載した広視野顕微鏡を使用します。
<ol><li>20 ° c、ステージの温度制御を設定または 20 に部屋の温度を調整する ° C</li>
	<li>は、顕微鏡ステージ上サンプル スライドを置きます。100 x を使用 (開口数 = 1.3 またはより良い) 対物レンズします</li>。
	<li>は、 図 2 A (wyIs251 軸索輸送の) または 図 2 B (mnIs17 と IFT) ポジティブ コントロールとして示されている領域を探す.よく 22 として他の分野を分析できます</li>。
	<li>設定パラメーター (CCD の利得 = 200、ビニング = 1 または 2、488 にレーザパワー nm = 1.0 1.3 mW)。マルチ TIFF 形式としてファイルの保存に 1 分の 4 フレーム/秒での時間経過の録音を実行します 。
	注: 場合は、GFP シグナルが消えるし、30 GFP::RAB 3 や OSM 6::GFP を観察していくことは困難だ s、レーザー パワーが強すぎます。その場合は、レーザー出力を下げます。逆に、小胞の動きが記録されていない場合、レーザー パワーが弱すぎます。その場合は、レーザーの力を高める</li>。
	<li>は別のワームを観察し、5.3 および 5.4 を繰り返します。観測最大 20 分間続くことができますが、各ワームは p の影響を避けるために一度だけ記録する必要があります。鳳統損傷 。
	注: ワームは、重大な欠陥 7 , 27 , 28 なし、少なくとも 20 分間観察されています。長い観察の避難所が可能性があります &#39; t されてまだテストします。神経細胞死の明確な兆候は、神経突起の腫れなど神経細胞形態の変化です。GFP の微弱な信号は軸索と樹状突起で wyIs251 と mnIs17 の両方で見ることができる、神経突起の形態は軸索や樹状突起を見るだけで簡単にチェックできます。神経細胞の形態は、 図 2 に示します</li>。
	<li>映画ファイルを生成します。
	フィジーのソフトウェアを使用して <ol><li>開く複数の TIFF ファイルです。ファイルに移動 &#62; オープン ステップ 5.4 で保存された TIFF ファイルを選択します 。
		メモ: フィジーは、jttps://fiji.sc でダウンロードできます。イメージ J とプラグインは、kymographs を生成する使用できます。そう場合選択したプラグインに関連する指示に従ってください</li> <li>をクリックして、&#34; 長方形選択 &#34; ボタン ( 図 3 矢印)、四角形を描画することによって関心のある分野を選択コンピューターのマウス ( 図 3 A の黄色の四角形)。画像に移動 &#62; スタック &#62; ツール &#62; Substacks を作るし、ムービーに含まれているスライス番号を選択します。Substack が生成されます</li>。
		<li>をクリックして substack のウィンドウをアクティブにして画像に移動 &#62; 調整 &#62; 明るさ/コントラスト。明るさとコントラストを調整するためのウィンドウが現れます。ウィンドウで、スライド上部バーの (最小) 右にバック グラウンド信号が消え、2 番目のトップ バーの (最大) 左にので、移動の小胞と粒子見ることができる背景の上に非常によくします</li>。
		<li>行く画像 &#62; スタック &#62; スタンパーの時間します。5.4 の手順で 4 フレーム/秒で、ムービーを記録すると、時間間隔は 0.25 s。したがって、入力 &#34; 0.25 &#34; 間隔で</li>。
		<li>として保存] を選択して動画ファイルを生成する &#62; AVI ファイル メニュー (ムービー 1 と 2). 
		注: 適切なプラグインを使用して、することができますファイルを保存する他の形式としてなど &#34; mpeg4 &#34; または &#34; mov &#34; ファイル</li>。
	</ol></li> <li>Kymographs を生成します。
	<ol><li>再びフィジー ソフトウェアを使用して元のムービー ファイルを開くし、手順 5.6.2 と明るさとコントラストを調整する 5.6.3</li>。
		<li>クリック &#34; ラインを分割 &#34; ( 図 3 B 矢印)。繊毛または軸索 ( 図 3 B で、黄色の線) に沿って分割線を描画、マウスを使用しています</li>。
		<li>行く分析 &#62; マルチ Kymograph &#62; マルチ Kymograph ( 図 3 C)。ライン幅ウィンドウ ( 図 3 D) が表示されます。型 &#34; 3 &#34; 線幅のウィンドウで OK をクリックして ( 図 3 D) です</li>。
		<li>Kymograph ウィンドウが作成されます。TIFF または JPEG 形式で画像を保存します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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著者は、何を開示します。

既存のメソッドに関して制限 ここで説明する方法は、軸索輸送や IFT など高速のイベントを観察に最適です。したがって、固定より長い潜伏よりも優先度は。我々 は重要な摂動なし、少なくとも 20 分間人身売買イベントを観察することができるされている、このメソッド適さない場合があります常に軸索伸長と細胞遊走などの長い観測を必要とする低速の出来事を観察します...

生細胞イメージング、細胞内輸送を分析するために不可欠なツールです。神経細胞生物学の生きているセルイメージ投射軸索輸送の解析は神経機能と形態1を理解することに不可欠です。いくつかの神経変性疾患2軸索輸送の欠陥の根底にあります。ダイニンとキネシン スーパーファミリー蛋白質を運ぶと、逆行性軸索輸送 anterogradely をそれぞれ1,2。
繊毛は、別の細胞内コンパートメントに微小管ネットワークと人身売買の機械が高度3です。蛋白質の統合の機械装置が、繊毛のヒントに毛様体タンパク質を細胞質から運ばれなければならないことを意味する、繊毛でローカライズされていません。繊毛固有キネシンとダイニン、キネシン 2 と細胞質ダイニン-2、呼ばれるそれぞれ、繊毛の4鞭毛内輸送 (IFT)5と呼ばれる現象を利用した部品を輸送します。IFT の減損を引き起こす ciliopathies6と呼ばれる疾患のスペクトル。したがって、ライブセル イメージングによる IFT 機構の解析は、毛様体の形成と病態の基礎的メカニズムを理解する必要です。
線虫(C. elegans) は、軸索輸送および IFT7,8,9を勉強する良いモデルです。IFT を観察、クラミドモナスをモデル生物5,6として広く使用されています。クラミドモナスは単細胞生物、老化、神経機能の動作と IFT の関係の分析が困難でしょう。また、CRISPR/Cas9 など本質的な遺伝学的手法クラミドモナスに適用されていません。高等のモデル生物、ショウジョウバエ、マウスなどでしばしば軸索輸送と IFT の混乱が原因で致死の表現型の形態形成と、動物10の恒常性に欠かせない軸索輸送や IFT 11。マウスの場合、細胞培養とトランスフェクションが軸索輸送と多くのスキルや豊富な時間12,13を必要とする IFT を観察する一般的に必要です。さらに、多くの重要な生理学的なコンテキストは、培養細胞、細胞株の損失が発生します。軸索輸送や IFT線虫変異体が破壊され神経システムがワームの生存のために必須ではないので、ない致命的な7,9,14。軸索輸送および IFT 直接観測できる生体内で郭清なし線虫は透明なそれゆえに簡単に GFP 付けられたマーカーを観察するため。
麻酔16、またはビーズ17マイクロ流体デバイス15アガロースのパッドを使用するなど、線虫を動けなくいくつかのプロトコルがあります。麻酔の包含はニューロン15で人身売買イベントを禁じるかもしれない。マイクロ流体デバイスによる明確な欠点は、マイクロ流体デバイスの準備は、常に容易ではないです。代わりに、アガロース パッド、マイクロ ビーズへの固定化はc. の elegansのタイムラプス イメージングを実行する簡単な方法です。ここでは、私はc. の elegansを固定し、軸索輸送および IFT体内で可視化するこの基本的なプロトコルを記述する線虫。他の方法と比べて、ここで説明する方法は特別な装置を必要としないが安く、簡単に実行します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

軸索輸送および鞭毛内輸送 (IFT) 軸索と繊毛の形態形成と機能に不可欠です。キネシン スーパーファミリー蛋白質ダイニンは、それぞれ前向性および逆行の輸送を調節する分子モーター。これらのモーターは、レールとして微小管ネットワークを使用します。線虫(C. elegans) は軸索輸送および生体内でIFT を勉強する強力なモデル生物です。ここでは、私は生活の軸索輸送および IFT を観察するためのプロトコルを記述する線虫。輸送貨物は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質を用いた貨物蛋白質に付けることで視覚化できます。線虫は透過的であり、貨物の GFP 付けられた蛋白質は細胞特異的発現プロモーターの下で特定のセルで表現できます。生きているワームは、殺害やワームを麻酔なし 10% の agarose のゲルにビーズで固定できます。貨物動きこれらの条件下で軸索と生活の繊毛で直接観測することができます郭清なしの線虫。このメソッドは、ターゲット蛋白質を変更することによりセルやセルで表現する貨物分子の観察に適用できます。最も基本的なタンパク質分子モーターなどと軸索輸送および IFT に関与しているアダプター蛋白質c. の elegansで保存されます。他のモデル生物と比較して、突然変異体を入手し、簡単にc. の elegansの維持します。このメソッドを組み合わせて様々 な線虫変異体は、軸索輸送と IFT の分子機構を明確化できます。

DA9 ニューロンの軸索輸送 前向性および GFP::RAB 3 の逆行性軸索輸送wyIs251線を使用することができます同時に DA9 運動ニューロンに記録されます。前向性および近位背 DA9 ニューロン軸索における逆行性輸送の平均速度は約 1.8 2.6 μ m/秒、それぞれ22。移動小胞の数は 0.03 と s あたりの軸索の μ m あたり 0.018 についてです。したが?...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

線虫(C. elegans) は、軸索および細胞内輸送を勉強する良いモデルです。ここでは、生体内での記録と線虫における軸索と鞭毛内輸送の解析のためのプロトコルを述べよ

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

7.9K ビュー.  Tohoku University. The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

発生生物学

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

腸の生きている線虫のライソゾーム アルカリ化を評価します。

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...