Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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著者は、彼女の役に立つ議論のため杉本亜砂子博士 (東北大学) を深く感謝します。wyIs251は、博士カン沈 (スタンフォード大学) からの寛大な贈り物だった。mnIs17は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この作品は、日本学術振興会科研費補助金 #17 H 05010 #16 H 06536 と第一三共の財団、脳科学財団と当財団によって支えられました。

1 です。 サンプル準備 <ol><li>生成トランスジェニック c. の elegans 遺伝子導入方法論 18 を使用して興味のひずみ。また、線虫 の遺伝学センター (CGC) から適切な株を取得します。シナプス小胞前駆体の軸索輸送を視覚化する形質転換線 wyIs251 を使用して、[Pmig-13::gfp::rab-3] 7。IFT を観察するには、形質転換線 mnIs17 [osm 6::gfp] 19 を入手します。これらの系統はこのプロトコルで使用されます 。
	注: いずれか染色体外配列、ゲノムの統合またはも GFP ノックイン作品。バック グラウンド信号を減らすためには、細胞特異的発現プロモーターではなく、パン神経プロモーターを使用します 。
	注: ワームのメンテナンスは、他のプロトコルの 20 の説明です。系統は線虫の Escherischia 大腸菌 OP50 フィーダーの芝生の中 (NGM) 板 (1.7% (w/v) アガロース、50 mM NaCl、0.25% (w/v) ペプトン 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL コレステロール、25 mM KH 2 PO 4、1 mM MgSO を維持されました。60 mm 径プラスチック皿に 4) 20 ° c.</li>
	<li>成長がワームのすべてのライフ サイクル ステージに NGM プレートに 20 ° C でワームします 。
	注: いずれかの任意の段階で軸索輸送および IFT を観察できます。これらの段階および視覚化された人身売買イベント 14 , 21 , 22 複数のパブリケーションを使用しているために、若い成人後期 L4 は良い肯定的な制御 、 23.</li>
</ol> 2。10% の Agarose 注: 多くのベンダーは、寒天、寒天粉末、アガロースなどの同様の製品を提供します。電気泳動グレード agarose を使用 (ゲル強度 &#62; 1200 g/cm 2)。結果ゲルがワームを固定するには十分に強いではないため安い寒天粉末は機能しません。
<ol><li>ミックス 0.4 g アガロース 4 mL の蒸留水 (DW) ガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm)。蒸発を避けるためにガラス管にふたを置いた</li>。
	<li>は、90 分の 95 ° C の熱ブロックにガラス管を置きます。さらに、別のガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm) が DW でいっぱいを準備し、95 でそれを維持 ° C を入れて 95 ° C DW ( 図 1 A) パスツール ピペットで移しなさい。たくさんの小さな泡が agarose チューブに見られるし、ソリューションが混濁する必要があります。ソリューションが明確になるまでそれを残します。アガロース溶液が均一になるまで上下にピペッティングで混ぜます 。
	注: DW とアガロースゲルから作られたとき 10% アガロース溶液を準備する電子レンジは使用できません。電子レンジによる微小気泡は、アガロース融解を防止します。ただし、凝固の 10% の agarose のゲル溶かすことが簡単にできる電子レンジを使用しています。10% の agarose のゲルを含んでいるガラス管を事前に準備し、少なくとも 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます。そう場合は、必要なときに電子レンジを使用して素材を溶かすこのプロトコルの手順 3 から開始しています 。
	注: Agarose は徐々 に、長時間または繰り返し凝固と融解後 95 ° C で培養した場合を固める能力を失います。この場合、新しい 10% の agarose を準備します</li>。
</ol> 3。アガロース パッドの準備 <ol><li>76 x 22 mm スライドの 10% の agarose の 2 滴を置く準備手順 2.2 で温めたパスツール ピペットを使用しています</li>。
	<li>すぐに agarose ドロップする前に 2 番目の 76 x 22 mm 2 スライド カバー硬化アガロース溶液を平らにする 2 番目のスライドの下 の図 1 B、およびプッシュに示すよう。厚さは 0.5-1 にする必要があります mm</li>。
	<li>すぐにフラッシュ パスツール ピペット ピペット 95 ° c DW 上下アガロース溶液を洗いまで。そうでなければ、ピペットが agarose のゲルを詰まりになります。95 ° C DW でピペット立っているのままにします</li>。
	<li>1 分待ちます。アガロース パッド形成し、曇りになります。次に、( 図 1 C) の手によって離れてスライドをスライドです</li>。
</ol> 4。ワームの取り付け 注: ワームの動きを少量でもよい観察を防ぐため。レバミゾールは agarose パッド 24 , 25 でワームの動きを防ぐために伝統的に使用されています。しかし、レバミゾールは c. の elegans の神経受容体を阻害する、したがってニューロン 15 で人身売買イベントに影響を与える可能性があります。以下良い代替 17 ポリスチレン ビーズを使用して記述されている。
<ol><li>摺動自在ミラー透視を搭載したステレオ顕微鏡、下 ~ 30 新しい NGM に適切なマーカーを表現するトランスジェニック ワーム プレート白金細線を用いた細菌を選ぶことがなく転送します 。
	注: プラチナ ワイヤー ピックの白金線とパスツール ピペット (5 インチ) で、白金線の先端が平坦化されました。プラチナ ワイヤー ピックの準備およびこれらのワームの処理、Wormbook (http://www.wormbook.org) で説明します</li>。
	<li>プレートを残して 1 分の細菌が自動的に削除されますワームの表面からワーム移動細菌なし NGM agarose のゲルと</li>。
	0.5 〜 1.0 を入れて <li>μ L は、2.6 %100 nm 径ポリスチレン ビーズ水寒天パッド ( 図 1 D) 上でのドロップします。細菌無料 NGM プレートから、ミクロ粒子のニキビトリートメントに 10-20 ワームを転送します。ドロップとの重複を避けるために白金線を使用してワームを選択広がりワームの体 ( 図 1 E).</li>
	<li>22 × 40 mm 2 coverslip ( 図 1 F) が適用されます。空気の泡を削除が、粉砕のワームを避けるために押し込みます。サンプルは画像の準備ができて、今 。
	注: ため、麻酔を投与すると、ワームが寒天パッド、ポリスチレン ビーズ、coverslip 17 によって生成された摩擦力だけで固定されます。フィーダーの細菌および/またはあまりにも多くのソリューションの存在が、摩擦力が弱いです 。
	メモ: 異なるサイズ coverslips (例えば 22 x 22 mm 2 18 x 18 mm 2) の動作します。ただし、大きい coverslips の浸漬水や観測期間中のサンプルに漏れ対物レンズから油を防ぐことができます</li>。
</ol> 5。観測 注: 各顕微鏡システムとカメラの適切な撮像パラメーター (レーザー出力、利得、ビニング、等) は異なります。ここで、回転のディスク共焦点スキャナーとデジタル CCD カメラを搭載した広視野顕微鏡を使用します。
<ol><li>20 ° c、ステージの温度制御を設定または 20 に部屋の温度を調整する ° C</li>
	<li>は、顕微鏡ステージ上サンプル スライドを置きます。100 x を使用 (開口数 = 1.3 またはより良い) 対物レンズします</li>。
	<li>は、 図 2 A (wyIs251 軸索輸送の) または 図 2 B (mnIs17 と IFT) ポジティブ コントロールとして示されている領域を探す.よく 22 として他の分野を分析できます</li>。
	<li>設定パラメーター (CCD の利得 = 200、ビニング = 1 または 2、488 にレーザパワー nm = 1.0 1.3 mW)。マルチ TIFF 形式としてファイルの保存に 1 分の 4 フレーム/秒での時間経過の録音を実行します 。
	注: 場合は、GFP シグナルが消えるし、30 GFP::RAB 3 や OSM 6::GFP を観察していくことは困難だ s、レーザー パワーが強すぎます。その場合は、レーザー出力を下げます。逆に、小胞の動きが記録されていない場合、レーザー パワーが弱すぎます。その場合は、レーザーの力を高める</li>。
	<li>は別のワームを観察し、5.3 および 5.4 を繰り返します。観測最大 20 分間続くことができますが、各ワームは p の影響を避けるために一度だけ記録する必要があります。鳳統損傷 。
	注: ワームは、重大な欠陥 7 , 27 , 28 なし、少なくとも 20 分間観察されています。長い観察の避難所が可能性があります &#39; t されてまだテストします。神経細胞死の明確な兆候は、神経突起の腫れなど神経細胞形態の変化です。GFP の微弱な信号は軸索と樹状突起で wyIs251 と mnIs17 の両方で見ることができる、神経突起の形態は軸索や樹状突起を見るだけで簡単にチェックできます。神経細胞の形態は、 図 2 に示します</li>。
	<li>映画ファイルを生成します。
	フィジーのソフトウェアを使用して <ol><li>開く複数の TIFF ファイルです。ファイルに移動 &#62; オープン ステップ 5.4 で保存された TIFF ファイルを選択します 。
		メモ: フィジーは、jttps://fiji.sc でダウンロードできます。イメージ J とプラグインは、kymographs を生成する使用できます。そう場合選択したプラグインに関連する指示に従ってください</li> <li>をクリックして、&#34; 長方形選択 &#34; ボタン ( 図 3 矢印)、四角形を描画することによって関心のある分野を選択コンピューターのマウス ( 図 3 A の黄色の四角形)。画像に移動 &#62; スタック &#62; ツール &#62; Substacks を作るし、ムービーに含まれているスライス番号を選択します。Substack が生成されます</li>。
		<li>をクリックして substack のウィンドウをアクティブにして画像に移動 &#62; 調整 &#62; 明るさ/コントラスト。明るさとコントラストを調整するためのウィンドウが現れます。ウィンドウで、スライド上部バーの (最小) 右にバック グラウンド信号が消え、2 番目のトップ バーの (最大) 左にので、移動の小胞と粒子見ることができる背景の上に非常によくします</li>。
		<li>行く画像 &#62; スタック &#62; スタンパーの時間します。5.4 の手順で 4 フレーム/秒で、ムービーを記録すると、時間間隔は 0.25 s。したがって、入力 &#34; 0.25 &#34; 間隔で</li>。
		<li>として保存] を選択して動画ファイルを生成する &#62; AVI ファイル メニュー (ムービー 1 と 2). 
		注: 適切なプラグインを使用して、することができますファイルを保存する他の形式としてなど &#34; mpeg4 &#34; または &#34; mov &#34; ファイル</li>。
	</ol></li> <li>Kymographs を生成します。
	<ol><li>再びフィジー ソフトウェアを使用して元のムービー ファイルを開くし、手順 5.6.2 と明るさとコントラストを調整する 5.6.3</li>。
		<li>クリック &#34; ラインを分割 &#34; ( 図 3 B 矢印)。繊毛または軸索 ( 図 3 B で、黄色の線) に沿って分割線を描画、マウスを使用しています</li>。
		<li>行く分析 &#62; マルチ Kymograph &#62; マルチ Kymograph ( 図 3 C)。ライン幅ウィンドウ ( 図 3 D) が表示されます。型 &#34; 3 &#34; 線幅のウィンドウで OK をクリックして ( 図 3 D) です</li>。
		<li>Kymograph ウィンドウが作成されます。TIFF または JPEG 形式で画像を保存します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

著者は、何を開示します。

既存のメソッドに関して制限 ここで説明する方法は、軸索輸送や IFT など高速のイベントを観察に最適です。したがって、固定より長い潜伏よりも優先度は。我々 は重要な摂動なし、少なくとも 20 分間人身売買イベントを観察することができるされている、このメソッド適さない場合があります常に軸索伸長と細胞遊走などの長い観測を必要とする低速の出来事を観察します...

生細胞イメージング、細胞内輸送を分析するために不可欠なツールです。神経細胞生物学の生きているセルイメージ投射軸索輸送の解析は神経機能と形態1を理解することに不可欠です。いくつかの神経変性疾患2軸索輸送の欠陥の根底にあります。ダイニンとキネシン スーパーファミリー蛋白質を運ぶと、逆行性軸索輸送 anterogradely をそれぞれ1,2。
繊毛は、別の細胞内コンパートメントに微小管ネットワークと人身売買の機械が高度3です。蛋白質の統合の機械装置が、繊毛のヒントに毛様体タンパク質を細胞質から運ばれなければならないことを意味する、繊毛でローカライズされていません。繊毛固有キネシンとダイニン、キネシン 2 と細胞質ダイニン-2、呼ばれるそれぞれ、繊毛の4鞭毛内輸送 (IFT)5と呼ばれる現象を利用した部品を輸送します。IFT の減損を引き起こす ciliopathies6と呼ばれる疾患のスペクトル。したがって、ライブセル イメージングによる IFT 機構の解析は、毛様体の形成と病態の基礎的メカニズムを理解する必要です。
線虫(C. elegans) は、軸索輸送および IFT7,8,9を勉強する良いモデルです。IFT を観察、クラミドモナスをモデル生物5,6として広く使用されています。クラミドモナスは単細胞生物、老化、神経機能の動作と IFT の関係の分析が困難でしょう。また、CRISPR/Cas9 など本質的な遺伝学的手法クラミドモナスに適用されていません。高等のモデル生物、ショウジョウバエ、マウスなどでしばしば軸索輸送と IFT の混乱が原因で致死の表現型の形態形成と、動物10の恒常性に欠かせない軸索輸送や IFT 11。マウスの場合、細胞培養とトランスフェクションが軸索輸送と多くのスキルや豊富な時間12,13を必要とする IFT を観察する一般的に必要です。さらに、多くの重要な生理学的なコンテキストは、培養細胞、細胞株の損失が発生します。軸索輸送や IFT線虫変異体が破壊され神経システムがワームの生存のために必須ではないので、ない致命的な7,9,14。軸索輸送および IFT 直接観測できる生体内で郭清なし線虫は透明なそれゆえに簡単に GFP 付けられたマーカーを観察するため。
麻酔16、またはビーズ17マイクロ流体デバイス15アガロースのパッドを使用するなど、線虫を動けなくいくつかのプロトコルがあります。麻酔の包含はニューロン15で人身売買イベントを禁じるかもしれない。マイクロ流体デバイスによる明確な欠点は、マイクロ流体デバイスの準備は、常に容易ではないです。代わりに、アガロース パッド、マイクロ ビーズへの固定化はc. の elegansのタイムラプス イメージングを実行する簡単な方法です。ここでは、私はc. の elegansを固定し、軸索輸送および IFT体内で可視化するこの基本的なプロトコルを記述する線虫。他の方法と比べて、ここで説明する方法は特別な装置を必要としないが安く、簡単に実行します。

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

軸索輸送および鞭毛内輸送 (IFT) 軸索と繊毛の形態形成と機能に不可欠です。キネシン スーパーファミリー蛋白質ダイニンは、それぞれ前向性および逆行の輸送を調節する分子モーター。これらのモーターは、レールとして微小管ネットワークを使用します。線虫(C. elegans) は軸索輸送および生体内でIFT を勉強する強力なモデル生物です。ここでは、私は生活の軸索輸送および IFT を観察するためのプロトコルを記述する線虫。輸送貨物は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質を用いた貨物蛋白質に付けることで視覚化できます。線虫は透過的であり、貨物の GFP 付けられた蛋白質は細胞特異的発現プロモーターの下で特定のセルで表現できます。生きているワームは、殺害やワームを麻酔なし 10% の agarose のゲルにビーズで固定できます。貨物動きこれらの条件下で軸索と生活の繊毛で直接観測することができます郭清なしの線虫。このメソッドは、ターゲット蛋白質を変更することによりセルやセルで表現する貨物分子の観察に適用できます。最も基本的なタンパク質分子モーターなどと軸索輸送および IFT に関与しているアダプター蛋白質c. の elegansで保存されます。他のモデル生物と比較して、突然変異体を入手し、簡単にc. の elegansの維持します。このメソッドを組み合わせて様々 な線虫変異体は、軸索輸送と IFT の分子機構を明確化できます。

DA9 ニューロンの軸索輸送 前向性および GFP::RAB 3 の逆行性軸索輸送wyIs251線を使用することができます同時に DA9 運動ニューロンに記録されます。前向性および近位背 DA9 ニューロン軸索における逆行性輸送の平均速度は約 1.8 2.6 μ m/秒、それぞれ22。移動小胞の数は 0.03 と s あたりの軸索の μ m あたり 0.018 についてです。したが?...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

線虫(C. elegans) は、軸索および細胞内輸送を勉強する良いモデルです。ここでは、生体内での記録と線虫における軸索と鞭毛内輸送の解析のためのプロトコルを述べよ

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K ビュー.  Tohoku University. 線虫(C. elegans) は、軸索および細胞内輸送を勉強する良いモデルです。ここでは、生体内での記録と線虫における軸索と鞭毛内輸送の解析のためのプロトコルを述べよ

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

生化学

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

神経科学

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

発生生物学

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

生物工学

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

C.エレガンスを一斉に動けなくするための冷却ステージの構築と運用

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

著者スポットライト:C.エレガンスを培養プレートに固定するための冷却ステージの組み立てと操作  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

C.エレガンスを培養プレートに固定化するための冷却ステージの組み立てと操作

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

要約

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C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー

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Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

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C.エレガンスを培養プレートに固定化するための冷却ステージの組み立てと操作

C.エレガンスを培養プレートに固定化するための冷却ステージの組み立てと操作